بروتوكولنا سهل الاستخدام. باستخدام هذه التقنية ، يمكن لأي شخص عزل المكون بسهولة عن الدم. يمكن تقليل التلوث ويمكن فصل المواد بدقة.
مع الأتمتة وإنشاء هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين بسهولة الحصول على المواد المرتبطة بالسرطان بنقاوة عالية ، وهو أمر مفيد لمختلف الدراسات النهائية. على وجه الخصوص ، من المتوقع أن توفر مزايا مهمة لأبحاث المستخدم النهائي. سيوضح الإجراء جاي جيونغ ، كبير الباحثين والمدير المساعد في معهد أبحاث جينوم السرطان.
للبدء ، قم بتحميل خرطوشة LBx 1 عن طريق تحديد نوع الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. اضغط على زر السهم لتغيير عدد العينات. بعد ذلك ، افتح باب الجهاز وأدخل جميع الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة.
للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب ، واضغط على زر التشغيل على شاشة لوحة اللمس.
تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخراطيش والتي تستغرق حوالي 30 ثانية. اتبع الرسالة لفتح الباب. قم بإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة.
ماصة بحد أقصى 10 ملليلتر من عينة دم كاملة باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة بعمق في مدخل عينة الخرطوشة ، وقم بحقن عينة الدم بأكملها ببطء. بعد إدخال الخراطيش في الجهاز، أغلق باب الجهاز، ثم اضغط على الزر موافق ( OK) .
يتم فصل معاطف البلازما و buffy تلقائيا عن الدم الكامل ، الأمر الذي يستغرق حوالي 30 دقيقة. بمجرد فصل معطف البلازما ومعطف بافي ، ستظهر رسالة على الشاشة مصحوبة بصوت إنذار. أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر الإيقاف.
افتح الباب. قم بإزالة الخرطوشة ووضعها على الطاولة. استرجع ثلاثة ملليلتر من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة واحد ملليلتر.
بعد ذلك ، استرجع ثلاثة ملليلتر من معطف بافي من منفذ معطف بافي باستخدام طرف ماصة واحد ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتحميل خرطوشة LBx 2 عن طريق تحديد اسم الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. اضغط على زر السهم لتغيير عدد العينات واتبع نفس الإجراء الموضح لخرطوشة LBx 1 لإدخال الخرطوشة في حامل الخرطوشة.
بعد إدخال الخرطوشة وإغلاق الباب ، اضغط على زر التشغيل على شاشة لوحة اللمس. اتبع الإجراء الموضح سابقا لإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة ووضعها على الطاولة. ماصة محلول تدرج الكثافة باستخدام ماصة مصلية.
أدخل طرف الماصة بعمق في مدخل الخرطوشة وقم بحقن المحلول ببطء. ثم ماصة عينة الدم بأكملها وحقنها ببطء في مدخل العينة. بعد إدخال الخرطوشة وتثبيتها، أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK) .
بمجرد فصل البلازما و PBMC تلقائيا عن الدم الكامل ، ستظهر رسالة مصحوبة بصوت إنذار. افتح الباب وأزل الخرطوشة. استرجع ثلاثة ملليلتر من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة واحد ملليلتر ، ثم استرجع ثلاثة ملليلتر من PBMC من منفذ PBMC.
وبالمثل ، بالنسبة لخرطوشة FAST-auto ، بعد إزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة ، قم بحقن ستة ملليلتر من محلول PBS في مدخل PBS للخرطوشة. بعد ذلك ، ماصة ثلاثة ملليلتر من الدم الكامل أو معطف بافي التي تم الحصول عليها من LBx 1 ، أو عينة PBMC التي تم الحصول عليها من LBx 2 ، وحقن العينة ببطء في مدخل عينة الخرطوشة. بعد إدخال الخرطوشة وتثبيتها، أغلق الباب واضغط على الزر موافق ( OK) .
بمجرد اكتمال التخصيب التلقائي ل CTCs ، أوقف التنبيه. قم بإزالة الخرطوشة وأدخل مزيل اللوحة الخلفية ، أو BPR ، في الثقوب الأربعة الموجودة في مقدمة الخرطوشة. اضغط على الجناح الأزرق الداكن بإبهام كلتا يديك ، ثم اضغط على الجسم الأزرق الفاتح حتى ينقر.
قم بإزالة جسم الخرطوشة بعناية عن طريق رفعه. بلطف شديد ، التقط غشاء المرشح من الحافة باستخدام ملقط ، وضع الغشاء في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لإعداد الحمض النووي ، أو على زجاج منزلق للتلطيخ. إذا لزم الأمر ، قم باستعادة الدم المصفى إلى مخرج الدم باستخدام طرف ماصة واحد ملليلتر.
تم تقييم cfDNAs المستخرجة باستخدام Bioanalyzer ، وتم استخدام أشرطة شاشة cfDNA مع سلم إلكتروني. تم استخدام الخط الأخضر لمحاذاة السلم والعينة. تشير علامات المثلث إلى نطاق الحمض النووي.
يبلغ طول معظم cfDNA 166 زوجا أساسيا وبعضها موجود في مضاعفات الطول الصحيحة. عادة ، يقيس تركيز cfDNA ما يصل إلى حجم 50 إلى 700 زوج أساسي. على الرغم من وجود اختلاف في الكمية التي تم الحصول عليها من كل عينة على حدة ، مثل 8.47 نانوجرام لكل ملليلتر ، و 5.2 نانوجرام لكل مليلتر ، إلا أن نتائج استخراج cfDNA كانت جيدة لكل من توزيع التركيز والحجم في جميع الحالات.
تشير هذه النتائج إلى أن طريقة LBx 1 تفصل بدقة البلازما التي تحتوي على cfDNA. في FAST-auto ، تمت إزالة الغشاء وتلطيخه بالأجسام المضادة الفلورية للكشف عن CTCs وخلايا الدم البيضاء. لوحظ الغشاء الملون ، الذي وضع على شرائح زجاجية ، تحت مجهر مضان.
بعد تلطيخ الغشاء ، تظهر الخلايا DAPI أو إشارات إيجابية نووية باللون الأزرق ، بينما يتم تمييز EpCAM و CK أو CTCs الإيجابية باللون الأخضر ، ويتم تمييز CD45 أو WBC الإيجابي باللون الأحمر. ليس من الصعب إزالة الغشاء. ومع ذلك ، من الضروري توخي الحذر بشأن فقدان وتلوث CTCs.
الدم الكامل ، PBMC ، ومعطف بافي كلها متاحة. بدلا من ذلك ، تحتاج فقط إلى ضبط وحدة التخزين بالكامل. يمكن أيضا استخدام سوائل أخرى ، على الرغم من أن الاختبار سيكون مطلوبا.
يمكن تشغيل هذه التقنية مباشرة في المستشفيات ويمكن الحصول على المادة بسرعة.
