The authors would like to thank Joshua Kimani, clinical director of the research program at the University of Nairobi, for his assistance with mucosal immunology studies related to this protocol. The authors would like to acknowledge funding from CHVI grant MOP 86721.

Ethik-Erklärung: Die Forschungsethik Vorstand von der Universität von Manitoba und Kenyatta National Hospital / University of Nairobi genehmigt diese Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten. 1. Vorbereitung der Medien und CMC Röhrchen <ol><li> Vorbereitung phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav zum Sterilität. Dies kann bei 4 º C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Pre-aliquote 5 ml PBS in 50 ml Falcon-Röhrchen (eine pro Probe gesammelt werden) und bei 4 º C bis zur Probenentnahme Zeit. </li><li> Beschriften 2-4 Kryoröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe Spülung für die Lagerung zu sammeln. </li><li> Vorbereitung Zellkulturmedien: RPMI 1640 + 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B (Endkonzentration 100 Einheiten / ml, 100 ug / ml und 250 ng / ml, je wEly, ohne FCS / FBS aufgenommen. </li></ol> 2. Sammlung von Proben Cytobrush Sammlung von Proben Zytobürste ist ein nicht-invasives Verfahren, das von einem geschulten MD oder Gynäkologen durchgeführt werden müssen. <ol><li> Sammeln Gebärmutterhalskrebs mononuklearen Zellen (CMC) unter Verwendung sowohl einer Cytobrush und einem Holz-oder Kunststoffschaber. Sammeln CMC vom Teilnehmer unter Spekulumuntersuchung, indem Sie den Schaber und rund um den Muttermund dreht (Abbildung 1). Legen Sie die Cytobrush in die endocervical-Betriebssystem, um 360 ° drehen und sofort legen sowohl die Cytobrush und Schaber in die 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml PBS. </li><li> Halten Proben auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. Um die Lebensfähigkeit der Zellen, Prozessproben innerhalb von 2 h Sammlung aufrecht zu erhalten. </li><li> Wenn möglich, sammeln abgestimmt Blutproben in grüne Spitze Heparin-Vacutainer für periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) Isolierung als Komparator / Steuerung für CMC-Analyse dienen. </li&gt; </ol> 3. Isolierung von CMC Führen Sie die Probenverarbeitung in einem Labor der Sicherheitsstufe 2, in einer sterilen Biosicherheitsschrank mit Flügelhandschuhe. <ol><li> Bei der Abholung kann CMC kontaminierten Proben mit Blut zu werden. Proben mit sichtbaren Blutkontamination aus der Studie ausschließen, um verwirrende Einbeziehung von PBMC in der letzten Probe zu verhindern. Aufgrund der geringen Anzahl von Lymphozyten von CMC-Proben isoliert, können kleine Blutkontamination leicht überwältigen die CMC-Lymphozyten-Komponente. </li><li> Wirbel-Falcon-Röhrchen, die sowohl das Zytobürste und Abstreifer für 45 Sekunden, um Zellen von den Bürsten zu dissoziieren. Proben können schaumig während dieses Prozesses zu werden; das ist normal. </li><li> Verwenden Sie die Cytobrush, um alle verbleibenden Material aus dem Schaber abkratzen, und entsorgen Sie die Schaber in ein Bleichmittel-Lösung. Um alle Zellen bleiben auf den Pinsel / Schaber angebracht sammeln, verwenden Sie einen frischen Handschuh, den Schaber zwischen Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.Schieben Sie die Bürste, so dass die Zellen und PBS in der gleichen 50-ml-Tube gesammelt werden. Entsorgen Sie die Cytobrush in eine Bleichlösung, und entsorgen Sie den Handschuh. WICHTIG: Verwenden Sie einen neuen Handschuh für jede Probe. </li><li> Setzen Sie einen 100 um Nylon Zelle Sieb, um ein frisches 50 ml Falcon-Röhrchen. Verwendung einer Transferpipette, sammeln die PBS-Zellsuspension aus dem Probenröhrchen und dem Filter durch das Sieb in die frisches Röhrchen. </li><li> 5 ml RPMI 1640 auf die ursprüngliche Probenröhrchen. Mit der Transferpipette, waschen Sie die Seiten der Probenröhrchen mit der RPMI und übertragen durch den Filter auf das neue Sammelröhrchen. Und wäscht den Boden der Nylonfilter mit RPMI. </li><li> Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 514 x g. Es ist entscheidend, um die Zentrifuge Brems aufhören bei diesem Schritt, um Herausziehen der CMC Pellet verhindern. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der Röhre, kümmert sich um das Pellet nicht zu stören. Pelletgröße sehr unterschiedlich sein; in some Proben wird das Pellet ziemlich groß aufgrund der Anwesenheit einer großen Zahl von Epithelzellen, während in anderen Fällen ist das Pellet kaum sichtbar und hochtransparent. </li><li> Das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Falcon-Röhrchen. 5 ml PBS, um die Probe zu waschen. </li><li> Zentrifuge wieder für 10 Minuten bei 514 xg ohne Bremse Zentrifuge. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen und wieder aussetzen das Pellet wie oben. Die Zellen sind, bereit für die Kryokonservierung (mit PBMC Kryokonservierung-Protokoll), die Stimulation oder Durchflusszytometrie Phänotypisierung. </li></ol> 4. CMC Oberflächenfärbung und Durchflusszytometrie <ol><li> Das Pellet aus Schritt 3.10 in 100 ul Blockierungslösung und Transfer entweder in eine 96-Well-Platte oder FACS-Röhrchen. Die Blockierungslösung (Fc &amp;ggr;-Rezeptoren zu blockieren) Rezeptur ist wie folgt: 1,8 ul Maus-IgG (Endkonzentration 0,2 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l), 5 &amp;mgr; l FBS und 93,2 &amp;mgr; l FACS-Wasch (PBS + 2% FBS).Die Färbung kann in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden, wenn Pelletgrößen klein genug sind, müssen aber möglicherweise in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn Pellets sind routinemäßig groß. Es ist wichtig, Antikörper entsprechend titrieren. </li><li> Blockieren Sie die Proben für 10 Minuten auf Eis / bei 4 ° C </li><li> Mit 100 &amp;mgr; l FACS-Wash (PBS + 2% FBS) in 96-Well-Platten oder 500 &amp;mgr; l FACS-Röhrchen in die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C mit dem Brems auf niedrig (oder aus, wenn eine niedrige Brems Einstellung nicht verfügbar ist). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet durch Bewegung. In Lebensfähigkeit Stain (Live Toten feststellbar Lebensfähigkeit Farbstoff). Vorbereitung Lebensfähigkeit Farbstoff nach den Anweisungen des Herstellers. Er muss dann für den Einsatz in jedem Labor / Durchflusszytometer Setup titriert werden. Inkubation für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen μl/500 100 ul PBS (für 96-Well-Platte / FACS-Röhrchen). Zentrifugieren bei 600 g für 10 min mit geringer / ohne Bremse. Entfernen supernatant und resuspendieren Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit der Mischung aus Oberflächenmarker-Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 ul. WICHTIG: Optimieren und titriert jedes Durchflusszytometrie Tafel vor der Färbung zu probieren. Zellen für 30 min im Dunkeln inkubieren bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.5. wenn Anfärben in einer 96-Well-Platte, Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 750 &amp;mgr; l FACS-Wash mit 1% Paraformaldehyd (PFA) (oder Cytofix, verdünnt 1 in 4). Gehen Sie zur Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer. </li></ol> 5. Entnahme und Vorbereitung von Gebärmutterhalskrebs Vaginal Lavage (CVL) <ol><li> Vor der Entnahme Cytobrush, verwenden Sie eine Spritze, um die Endocervix mit 2 ml steriler PBS waschen und saugen Sie den Spülung aus dem hinteren Scheidengewölbe. </li><li> Sammeln Sie die angesaugte Spülung Probe in ein 15 ml Falcon-Röhrchen und halten auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. </li><li> Zentrifuge Proben bei 400 × g für 7 min, um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Collect der Überstand, Aliquot der Probe in 1 ml oder 500 ul Aliquots und bei -70 ° C Aliquots können ELISA-oder Perlen Array Analyse der CVL Proteine ​​aufgetaut werden, aber vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren / Auftauen. </li><li> Wenn gewünscht, das Pellet von Zelltrümmern in RNA später RNA-Expression durch folgende Protokoll des Herstellers gemessen. </li></ol> 6. Datenerfassung <ol><li> Einen Satz der Vergütung Rohre, die den Antikörper-Panel passt. Führen Sie die Ausgleichsrohre spektrale Überlappung einzustellen. Führen Sie die Proben auf jedem Multicolor Durchflusszytometer, dass ist für den Fluorochrom konjugierte Antikörper in der Gruppe verwendet, konfiguriert. </li><li> Erwerben Sie eine Probe PBMC erste Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Spannung, um die Lymphozytenpopulation erkennen einzustellen. Versuchen, sie bei 100 auf jeder Achse auf einer linearen Skala zu halten. Ausführen eines PBMC Steuer wird es deutlich einfacher, die CMC Lymphozyten-Population zu finden. </li><li> Das FSC-Schwelle für die CMC-Proben müssen in Bezug auf PBMC-Proben wegen zu niedrigen Werten FSC schmieren die SSC-Achse erhöht werden. </li><li> Mischen Sie jedes Rohr vor dem Erwerb. Erwerben das gesamte Rohr, die Anzahl der Lymphozyten-Gate Ereignisse gesammelt maximieren. Überwachen Sie die Maschine sorgfältig, um ein Verstopfen zu vermeiden. </li><li> Exportieren der Daten in eine durchflusszytometrische Analyse Programm wie FlowJo. </li></ol> 7. Gating-Strategie <ol><li> Wählen Sie Weiterleiten Seitenstreuung hoch (FSC-H) / Vorwärts Seitenstreubereich (FSC-A) die Singulett-Bevölkerung zu bestimmen. </li><li> Wählen Sie Zeit gegen Fluoreszierende Marker (wie zB FITC) für die Qualität der Akquisition steuern. Änderung der Strömungsrate kann zu Artefakten in den Daten einzuführen. Schließen Sie alle mögliche Fläche, die Diskrepanz in der Fließgeschwindigkeit zeigt. </li><li> Identifizieren Sie die Lymphozyten-Population auf SSC-A/FSC-A Handlung. Verwenden Sie einen PBMC Steuerung, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie, dass die CMC Lymphozyten-Population vielleicht nicht so klar wie die PBMC Kontrolle. &lt;/ Li&gt; <li> Tor auf SSC-A/viability färben, um tote Zellen von lebenden Zellen auszuschließen. Tote Zellen können nicht-spezifisch zu integrieren, die Antikörper, die Artefakte vorstellen wird. </li><li> Tor auf der SSC-A/CD3, um die T-Zellpopulation zu identifizieren. Von diesem Tor, identifizieren die CD4 + und CD8 +-Populationen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Angesichts der großen Wissenslücken in Bezug auf die Immunität im weiblichen Genitaltrakt (FGT), können phänotypische Analyse von CMC eine breite Palette von Einsichten in verschiedene Lymphozyten-Populationen in den Gebärmutterhals zu liefern. Mit Proteomanalyse und Viruslastmessungen in den zervikalen Spülung gekoppelt, kann Immunität zu sexuell übertragbaren Infektionen (STI) s und andere Krankheitserreger in verschiedenen Populationen zerschnitten werden. Technische Übe...

Die Mehrheit der HIV-Neuinfektionen weltweit durch heterosexuelle Übertragung entstehen, mit Frauen, die 47% der Neuinfektionen im Jahr 2011 (UNAIDS 1). Das Verständnis der weiblichen Genitaltraktes (FGT), einer der Haupteingangsportale für HIV und andere sexuell übertragbare Erreger, ist von großer Bedeutung auf dem Weg zur Suche nach effizienten Strategien, um Infektionen zu vermeiden. Immunantworten im Genitalschleimhaut deutlich einzigartig und unterscheiden sich von denjenigen im peripheren Blut 2 gemessen. Allerdings ist die Kenntnis der aktuellen Immundynamik an der FGT allenfalls begrenzt. Bisher haben Studien der Schleimhautimmun Umwelt weitgehend auf den Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT), wo es ist klar geworden, dass die frühen Ereignisse im Schleimhautgewebe nach der Infektion einen starken Einfluss auf nachfolgende Fortschreiten der Krankheit 3,4 haben konzentriert. Sammelproben aus der Genitalschleimhaut stellt eine große Herausforderung und ist zumindest teilweise verantwortlich für die lack Verständnis der Immunologie der FGT. Die Lösung des Rätsels der Immun Dynamik zwischen Wirt und Pathogen in Zusammenhang mit der Umwelt, die die unterschiedlichen FGT erfordert effiziente Methoden zur Erfassung und Analyse von Proben aus diesem Gebietsschema ist. Die FGT ist in zwei Abschnitte unterteilt: der obere Fortpflanzungsorgane, die die Eileiter, Endometrium und Endocervix und den unteren Darm-Trakt, die die Ektozervix enthält und die Vagina enthält (von Kaushic prüft et al 5). Es ist immer noch unklar, was der relative Beitrag dieser verschiedenen Websites ist es, HIV-Infektion, aber es wird angenommen, dass beide Seiten könnten, um HIV-Eintritt 6 beitragen. T-Zellen repräsentieren 40-50% der Leukozyten in den oberen und unteren Fortpflanzungsorgane, während Makrophagen umfassen ca. 10% (in Rodriguez-Garcia et al Bewertung 2). T-Zellen können in der Vagina, Gebärmutterhals, Endometrium nachgewiesen werden. Makrophagen sind stärker localiim Endometrium und Myometrium-Bindegewebe als der Zervix zed, obwohl sie in beiden Geweben nachgewiesen werden. Schließlich kann plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) und Langerhans-Zellen auch in FGT Gewebe nachgewiesen werden. Der Phänotyp und Proportionen von Immun Populationen und ihrer Anfälligkeit für eine HIV-Infektion kann allem je nach Hormonzyklen, die Verwendung von hormonellen Kontrazeptiva, bakterielle Vaginose oder sexuelle Aktivitäten 5,7-9. Diverse Verfahren sind entwickelt worden, um die Immun Populationen und der Umgebung des FGT studieren. Cervical Biopsie-, Gebärmutterhals-und cytobrushes zervikovaginalen Spülungen (CVL) 10-12 sind die am häufigsten in der Literatur verwendet. CVL Sammlung von PBS Spülung ist das einfachste Verfahren und erlaubt die Untersuchung der immunmodulierenden Proteine ​​führt jedoch zu extrem niedrigen Zellausbeute und eignet sich deshalb nicht für die Untersuchung der Immunzellpopulationen der FGT 13. CVL Proben andererseits vEry nützlich für die Bewertung der Immun Umgebung der FGT durch Messung der Expression von verschiedenen Zytokinen, Chemokinen oder antimikrobielle Faktoren unter Verwendung von Verfahren, wie ELISA, Cytokin Perlenanordnung 14 oder Massenspektrometrie 15,16. Charakterisierung der Immunzellfrequenzen Phänotypen und Funktionen können durch Sammeln zervikalen mononukleären Zellen (CMC), durch zervikale Zytobürste oder durch zervikale Biopsieprobennahme erreicht wird. Cervical Biopsien ist eine invasive Methode, die die Beschwerden und das Risiko von Blutungen erhöht und nimmt 2 bis 11 Tage, um zu heilen nach dem Verfahren je nach Immunstatus der Frau 12. Auf der anderen Seite, Gebärmutterhals cytobrushes trotz der geringeren Ausbeute an Zellen gesammelt, ist eine weniger invasive und bequeme Methode, um die Immunzellen aus dem FGT sammeln. Beide Verfahren können die gleiche Ausbeute an CD45 +-Leukozyten zu erreichen, aber zwei aufeinander zervikalen cytobrushes sind notwendig, um die gleiche Menge an Zellen enthielt, erhalten wurde in ein Biopsie-13. Dennoch bietet immer noch Zytobürste Probenahme eine zulässige Anzahl von Zellen (etwa 5000 Zellen CD45 + / Zytobürste) für weitere ex vivo Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie 14. Außerdem können funktionelle Charakterisierung an diesen Proben durchgeführt werden, wie Stimulation und intrazelluläre Durchflusszytometrie oder qPCR wurden unter Verwendung von CMCs Zytobürste abgeleiteten HIV-spezifischen Immunantworten 17 oder Th-Zell-Polarisation 18 zu identifizieren. Erweiterung der T-Zellen können auch Bevölkerung erleichtern funktionelle Studien mit CMC 19. Es ist wichtig zu beachten, dass Biopsien und cytobrushes Probe unterschiedliche Abschnitte der FGT. Biopsien sind von der überlegenen Teil des Epithel und Stroma der Ektozervix 12,13 abgeleitet, während Gebärmutterhalskrebs cytobrushes probieren Sie die Muttermundes, Sammeln von Zellen aus dem Epithel der Endocervix und vermutlich der Transformationszone abgeleitet. Cytobrush Proben daher probieren Sie eine Wiedergion aus einer einzigen Schicht von Epithel besteht, während Biopsien, umfassen einen Bereich von einem geschichteten Plattenepithel Epithel 5 ausgekleidet. Als Folge der Natur der Leukozyten-Populationen durch zervikale Biopsie und Zytobürste gesammelt unterscheidet. Biopsien sammeln einen höheren Anteil an CD3 +-T-Zellen, während cytobrushes führen Sammlung von einem höheren Anteil an CD14 + Monozyten / Makrophagen 13. Das Studium der Immunologie der FGT ist seit vielen Jahren 20-22 ein Interesse, und wir haben viel Know-how mit dem Studium der Cytobrush abgeleitete CMC angesammelt. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich vor allem auf die Untersuchung von HIV-infizierten, nicht-infizierten und HIV-seronegativen ausgesetzt (HESN) Sexarbeiterinnen aus Nairobi, Kenia. HIV repliziert vorzugsweise in aktivierten T-Zellen 23 und eine geringere Anzahl an aktivierten Zellen, die von HIV in der FGT richtet werden kann, könnte den Schutz vor HIV-Ansteckung bei. Im Einklang mit dieser Hypothese mehrere studies wurden geringere Immunaktivierung unter HESN Sexarbeiterinnen, die hoch HIV ausgesetzt werden beschrieben bleiben doch nicht infizierten 24,25, und das Ruhe Phänotyp ist auch in der FGT 14 beobachtet. Hier beschreiben wir Methodik für die Verarbeitung und Bewertung von T-Zellen-Aktivierung in CMC-Proben von Gebärmutterhalskrebs cytobrushes durch ex vivo Durchflusszytometrie abgeleitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:205px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">100uM Cell Strainer for 50 ml Falcon tube</td>
			<td style="width:136px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">352360</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:136px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30027.01</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fetal Bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Life technology</td>
			<td style="width:133px;">16000044</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Fungizone</td>
			<td style="width:136px;">Life technology</td>
			<td style="width:133px;">15290-018</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P4333-20ml</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">50ml Falcon tube</td>
			<td style="width:136px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">14-959-49A</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Blood Bank disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:136px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:133px;">13-711-6M</td>
			<td>CMC processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cytobrush plus</td>
			<td style="width:136px;">Cooper surgical</td>
			<td style="width:133px;">C0121</td>
			<td>CMC sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposable cervical scraper</td>
			<td style="width:136px;">Quick medical</td>
			<td style="width:133px;">2183</td>
			<td>CMC sampling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">15 ml Falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:133px;">14-959-70c</td>
			<td>CVL processsing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">1.5ml tube ependroff</td>
			<td style="width:136px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">05-402-18</td>
			<td>CVL storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td>Flow cytometry reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation Buffer (4% PFA)</td>
			<td style="width:136px;">BD</td>
			<td>554655</td>
			<td>Flow cytometry regeant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">IgG mouse&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">I8765</td>
			<td>Flow cytometry regeant&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

Multi Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Phänotypen und Funktionen der Zell-Untergruppen in bisher nicht charakterisiertes Gewebe zu sezieren. Analyse von CMC Proben können Informationen sowohl Lymphozyten und Monozyten-Populationen mit entsprechenden Gating Strategien ergeben. Ein Vertreter CMC Gating-Strategie, im Vergleich zu einem angepassten PBMC-Profil, ist in Abbildung 2 dargestellt. Das FSC-A gegen FSC-H ermöglicht Grundstück für den...

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Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

collection-isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical

Research

JoVE Journal

Medicine

19.0K Aufrufe.  University of Manitoba. The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays. 

Serie: Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Forschung

Medizin

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central nervous system (CNS). However, further optimization of these technologies would benefit from methods allowing rapid and streamline determination of the extent of CNS and cell-specific targeting upon administration of viral vectors or nanoparticles in the body. Here, we present a protocol that takes advantage of the high throughput and multiplexing capabilities of flow cytometry to allow a straightforward quantification of different cell subtypes isolated from mouse brain or spinal cord, namely microglia/macrophages, lymphocytes, astrocytes, oligodendrocytes, neurons and endothelial cells. We apply this approach to highlight critical differences between two tissue homogenization methods in terms of cell yield, viability and composition. This could instruct the user to choose the best method depending on the cell type(s) of interest and the specific application. This method is not suited for analysis of anatomical distribution, since the tissue is homogenized to generate a single-cell suspension. However, it allows to work with viable cells and it can be combined with cell-sorting, opening the way for several applications that could expand the repertoire of tools in the hands of the neuroscientist, ranging from establishment of primary cultures derived from pure cell populations, to gene-expression analyses and biochemical or functional assays on well-defined cell subtypes in the context of neurodegenerative diseases, upon pharmacological treatment or gene therapy.

We present a flow cytometry method to identify simultaneously different cell types retrieved from mouse brain or spinal cord. This method could be exploited to isolate or characterize pure cell populations in neurodegenerative diseases or to quantify the extent of cell targeting upon in vivo administration of viral vectors or nanoparticles.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the body&#39;s circulatory system demands a reliable and multiparametric approach that evaluates the possible hematologic complications caused by these devices (i.e., activation and destruction of blood components). Comprehensive in vitro hemocompatibility testing of blood-contacting implants is the first step towards successful in vivo implementation. Therefore, extensive analysis according to the International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) is mandatory prior to clinical application. The presented flow loop describes a sensitive model to analyze the hemostatic performance of stents (in this case, neurovascular) and reveal adverse effects. The use of fresh human whole blood and gentle blood sampling are essential to avoid the preactivation of blood. The blood is perfused through a heparinized tubing containing the test specimen by using a peristaltic pump at a rate of 150 mL/min at 37 &#176;C for 60 min. Before and after perfusion, hematologic markers (i.e., blood cell count, hemoglobin, hematocrit, and plasmatic markers) indicating the activation of leukocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), platelets (&#946;-thromboglobulin [&#946;-TG]), the coagulation system (thombin-antithrombin III [TAT]), and the complement cascade (SC5b-9) are analyzed. In conclusion, we present an essential and reliable model for extensive hemocompatibility testing of stents and other blood-contacting devices prior to clinical application.

This protocol describes a comprehensive hemocompatibility evaluation of blood-contacting devices using laser-cut neurovascular implants. A flow loop model with fresh, heparinized human blood is applied to mimic blood flow. After perfusion, various hematologic markers are analyzed and compared to the values gained directly after blood collection for hemocompatibility evaluation of the tested devices.

HämokompatibilitätSprüfung von blutverfälschten Implantaten in einem Flow Loop-Modell, das den menschlichen Blutfluss imitiert

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...