This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

ينبغي الحصول على الأخلاق الوطنية والمؤسسية الملائمة قبل تنفيذ التجارب على الحيوانات. 1. إزالة من مؤسسة كهرباء لبنان العضلات والأعصاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن وتخدير عميق ماوس الكبار مع isofluorane استنشاق باستخدام المرذاذ مع 5٪ isofluorane بالإضافة إلى 1.5 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين أو جرة الجرس مع isofluorane القطن غارقة في القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الفأر هو تخدير عميق ولا يستجيب لقرصة أخمص قدميه. قطع رأس بسرعة باستخدام كبيرة، ومقص شحذ أو المقصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض خط الوسط بطني من خلال الأضلاع باستخدام مقص وإزالة الأعضاء الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلد الحيوان عن طريق الامساك الجلد من منطقة الرقبة وتجعله الماضي القدمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الساقين عن طريق خفض فوق الوركين والساقين وضع البشرة في طبق مع المبردة (4 درجة مئوية)، carbogenated (95٪ O 2، 5٪ CO 2) انخفاض الكالسيوم، المغنيسيوم عالية بيكربونات مخزنة CONTAI محلول ملحينينغ في ملي: 128 كلوريد الصوديوم، و 1.9 بوكل، 1.2 KH 2 PO 4، 26 NaHCO 3، 0.85 CaCl 2، 6.5 MgSO 4، و 10 الجلوكوز (درجة الحموضة من 7.4 ± 0.05) 16. انخفاض الكالسيوم، المغنيسيوم عالية الحل يمنع انتقال متشابك أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الساقين الجانب الظهري حتى في صحن ويعلقون الساقين والوركين أسفل باستخدام الإبر أو دبابيس الحشرات بحيث مفاصل الركبة والكاحل هي في زاوية 90 درجة. وضع دبوس على كل نهاية القدمين ودبوس واحد على كل من الفخذين الأمامية والخلفية لعقد الأنسجة في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص الربيع Castroviejo، وترفع من الطبقة العليا من العضلات في الفخذين وجعل خط الوسط قطع لفضح العصب الوركي أدناه مباشرة. يقع العصب الوركي أسفل طبقة العضلات العليا وتدير فوق عظم الفخذ من خروجها بالقرب من الوركين حتى فروع في العصب الشظوي المشترك وقصبي قبل مفصل الركبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العضلات فوق العصب الوركي حتى بوفي كثافة العمليات التي الشظوية الغطس فرع العصبية العميقة في العضلات المثنية الطويلة لإبهام القدم (FHL) مرئيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام # 55 ملقط، تشريح النسيج الضام حول الفرع الشظوي لتحريرها من الساق والنعلية العضلات، والتي هي على الجانب الإنسي من الساق. قطع الأوتار من الساق والنعلية العضلات وإزالتها بعناية من تحت العصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العضلات السطحية على الجانب الوحشي من الساق لفضح ثلاث حزم متميزة في وتر الكاحل، المفصل من الإنسي إلى الوحشي: FHL، مؤسسة كهرباء لبنان، والظنبوبي الأمامي (TA)، مع مؤسسة كهرباء لبنان مخبأة تحت TA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وتر TA في مفصل الكاحل، ورفع TA وحتى بعيدا من مؤسسة كهرباء لبنان، وقطع العضلات بالقرب من الركبة لإزالته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وتر FHL في الكاحل ورفعه إلى الوصول إلى المنطقة حيث يدخل العصب في FHL. قطع أسفل تلك النقطة وإزالة ~ 2/3 من العضلات FHL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العصب الوركي أقرب إلى مفصل الورك ونقاط البيعالمنال وتجريد بلطف بعيدا كل فروع العصب باستثناء الفرع الشظوي العميق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأوتار مؤسسة كهرباء لبنان في كل مفاصل الكاحل والركبة باستخدام مقص الربيع كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حاد، وإزالة مؤسسة كهرباء لبنان، وFHL المتبقية والعصبية من الأنسجة المحيطة بها من خلال قطع عظم الساق عند الركبة والفخذ خلال منتصف الطريق. قطع بعيدا الظنبوب العظم المتبقي حتى مجرد مؤسسة كهرباء لبنان، تبقى جزءا من FHL والعصبية. </li></ol> 2. تركيب العضلات والأعصاب مؤسسة كهرباء لبنان في حمام الأنسجة (الشكل 1A) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء التجربة، وإعداد حمام الأنسجة. يروي باستمرار حمام مع المؤكسد (100٪ O 2) السائل الخلالي الاصطناعية (SIF) تحتوي على (مم) 123 كلوريد الصوديوم، و 3.5 بوكل، MgSO 4 0.7، 1.7 ناه 2 ص 4، 2.0 CaCl 2، 9.5 رنا 6 H 11 O ( غلوكونات الصوديوم)، 5.5 الجلوكوز، والسكروز 7.5، و 10 -2 N-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-آخرونحمض hanesulfonic (HEPES). ودرجة الحموضة 7.4 ± 0.05 17. ينصح معدل التدفق من 15-30 مل / دقيقة. المعروضة حمام متاحة تجاريا من 25 مل القدرة مع قطبين تحفيز ثابتة إلى أسفل الحمام، وظيفة الأنسجة شنت وجبل لوحدة تحكم القوة وطول (أبعاد حمام تقريبي 8.5 سم × 3 سم × 1 سم؛ للمواصفات انظر الجدول المواد / المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأنسجة FHL المتبقية للتعامل مع معزولة العضلات العصبية ووضعه في حمام الأنسجة. ضع قطعة صغيرة من sylgard على الجزء السفلي من صحن واستخدام دبوس الحشرات من خلال الأنسجة FHL المتبقية لتحقيق الاستقرار في العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خيوط الحرير 6-0 لربط كل من الأوتار ويضعوا نهاية واحدة إلى آخر الأنسجة والآخر للذراع رافعة من قوة وتحكم طول (انظر جدول المواد / معدات المواصفات). استخدام أصغر طول الخيط الذي هو عملي. إزالة دبوس الحشرات وsylgard بعد أن كنت قد ربط الأوتار. ملاحظة: لتسهيل سهلةاتصال ذراع الذراع قطعة صغيرة من الأسلاك يمكن أن تكون عازمة إلى &quot;ي&quot; هوك على شكل وثابتة في ذراع رافعة مع الايبوكسي. ويمكن بعد ذلك ربط الخيط إلى سلك بدلا من الخيوط في حفرة صغيرة على الذراع الرافعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأقطاب شفط من 16 SA الزجاج بواسطة أولا باستخدام مجتذب micropipette الزجاج (الحرارة = 286، سحب = 0، السرعة = 150، الوقت = 200). كسر غيض يدويا ذهابا وطحن على حجر شحذ حتى هناك حوالي 3 ملم تفتق. تذوب طرف باستخدام microforge إلى القطر الداخلي للطرف المطلوب بين 10-100 ميكرون اعتمادا على المنطقة من العصبية يرغب احد لعينة من (انظر الأرقام 1B-1C عن القطب التخطيطي و / معدات جدول المواد للحصول على معلومات المنتج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ج ابحث ملء الزجاج الكهربائي شفط إلى سلك الفضة الداخلي مع SIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شفط نهاية قطع العصب في القطب والاتصال إلى ميناء إيجابي من مكبر للصوت التفاضلية. التفاف الكهربائي مع الفضة chloridedالسلك الذي يصل إلى ميناء السلبي للheadstage. أرض الحمام SIF عن طريق تشغيل سلك الفضة chlorided الثاني من الحمام إلى ميناء البرية headstage ل. الأرض أيضا أنابيب نضح إلى قفص فاراداي في نقاط متعددة للتخفيف من الضجيج الكهربائي التي أدرجت عن طريق مضخات نضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز العضلات عبر الأقطاب التي شنت على جانبي العضلات في حمام الأنسجة للحث على انكماش نشل. بدلا من ذلك وضع قطب كهربائي على تحفيز نهاية قطع العصب. زيادة تحفيز الجهد حتى يلاحظ قوة مقلص الذروة ومن ثم زيادة الجهد من قبل إضافي 15٪ لتصل إلى الجهد فوق الأعظمي (0.5 ميللي ثانية عرض النبضة). مواصلة تقلصات نشل في التيار الكهربائي فوق الأعظمي، مع بقية 10 ثانية في ما بينهما، ولكن تختلف في طول العضلات حتى قوة مقلص الذروة يتم التوصل لإيجاد طول الأمثل (L س) من العضلات. فإن كل سلالم طول والاهتزازات تبدأ عضلة في هذه ينغعشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح إعداد العضلات العصبية بالبقاء في الحمام لا يقل عن 1 ساعة قبل جمع البيانات اللاحقة للسماح الأنسجة للوصول إلى درجة حرارة حمام وللانتقال متشابك الطبيعي أن تتعافى بعد تشريح في محلول منخفض الكالسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع البيانات عند درجة حرارة أخرى من درجة حرارة الغرفة، وضع مسبار درجة الحرارة في حمام بالقرب من الأنسجة العضلية. جلب ببطء الحمام تصل إلى درجة الحرارة عن طريق ضخ الماء الساخن من خلال لوحة الأنسجة قاعدة الحمام. التفاف الطين منصات التدفئة ميكرووافابل حول الخزان SIF للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ثابتة. </li></ol> 3. جمع البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعريف وارد باعتباره وارد المغزل، تسجيل نشاط الخلايا العصبية أثناء الانقباضات نشل المتكررة التي تنتجها الجهد التحفيز فوق الأعظمي 0.5 ميللي ثانية تسليمها مرة واحدة كل ثانية. ملاحظة: يجب أن العضلات afferents المغزل وقفة أثناء 18،19 نشل انكماش (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام داتا برنامج الحصول على تطبيق التغييرات طول بسرعات مختلفة وأطوال مختلفة. استخدام سيناريو مخصص لتنفيذ هذه المهمة (انظر المعلومات التكميلية لقطة من السيناريو وتوجيهات حول كيفية تخصيص مساحات معينة). تطبيق منحدر، وعقد تمتد من 4 ثانية في أطوال تمتد من 2.5٪، 5٪، و 7.5٪ L س وبسرعة تمتد من 20، 40، أو 60٪ L س / 15 ثانية. ملاحظة: راجع دليل المستخدم للحصول على القوة ومحددة تحكم طول الضروري عامل تحويل الجهد إلى ملليمتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية التجربة، تحديد صحة العضلات في 24 ° C باستخدام تقلصات كزازي متساوي القياس القصوى (500 قطار ميللي ثانية، 120 هرتز تردد القطار، 0.5 ميللي ثانية عرض النبض، والجهد فوق الأعظمي). مقارنة قوة مقلص الذروة إلى القيم ذكرت سابقا (24 ~ غ / سم 2 9،20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

كان الهدف من هذه المقالة لوصف طريقة لتسجيل من afferents المغزل العضلات في إعداد الماوس العضلات العصبية معزولة. لقد وجدنا أن afferents المغزل الماوس تستجيب على نحو مماثل لتلك التي تمتد من الفئران والقطط والبشر 15، واستخدموا فئران مختبرات أخرى مثل الكائنات نموذج لدراسة الخلايا العصبية الحسية في كل من العضلات والجلد في المختبر (على سبيل المثال 3،13) . العضلات afferents الحسية يمكن تسجيل لمدة 6-8 ساعة على الأقل في كل من 24 درجة مئوية و 34 درجة مئوية. للحد من التعامل مع مؤسسة كهرباء لبنان والعصبية، واستخدام الجزء المتبقي من FHL للتعامل مع الأنسجة كلما أمكن ذلك. بعد التشريح، والانتظار ما لا يقل عن 1 ساعة لبدء جمع البيانات للسماح الأنسجة لكي تتوازن إلى درجة حرارة حمام وللانتقال متشابك العادي للتعافي. سابقا، تم التحقق من صحة العضلات على مجموعة فرعية من العضلات المستخدمة في هذا المستحضر عن طريق تحديد أن كزازي كونترا القصوىctile القوة التي تولدها عضلات مشابهة لتلك التي ذكرت من قبل الآخرين في بداية ونهاية التجربة 15. تم تحديد العضلات afferents المغزل وظيفيا في هذا الإعداد من خلال البحث عن وقفة مميزة في اطلاق ردا على نشل انكماش (الشكل 2) وكذلك تواتر الزيادات حظية المتوقع في استجابة للتغيرات طول (الشكل 3). في تجربتنا، ومعظم afferents التي تطلق في ظروف السيطرة هي afferents المغزل العضلات. طول العصب الاحتفاظ بها في إعداد هذا (~ 7 ملم كحد أقصى) ليست طويلة بما يكفي لاستخدام وارد الاختلافات سرعة التوصيل لتحديد الأنواع الفرعية وارد العضلات 13. بالإضافة إلى ذلك، على عكس القطط والبشر، وكانت التدابير حساسية ديناميكية غير قادرة على التمييز بوضوح المجموعة الأولى أ والثاني afferents في الفئران (لمزيد من المناقشة رؤية ويلكنسون وآخرون 15). فرعية أخرى من afferents (أي، المجموعة الثالثة والرابعة) ويمكن تحديد باستخدام اختبارات وظيفية إضافية في هذا الإعداد، على سبيل المثال عن طريق إضافة مواد مثل كشافات، ATP، أو براديكينين، وخفض درجة الحموضة حمام، وتعريض العضلات لنقص التروية، الخ 3،13،21-23 باستخدام أقطاب شفط يسمح النشاط من الخلايا العصبية الحسية متعددة ليتم تسجيلها في وقت واحد، مما يزيد من كمية البيانات التي يمكن جمعها من عضلة واحدة. هذا المستحضر يمكن استخدامه لقياس الأثر الإجمالي لاضطراب في الخلايا العصبية الحسية استجابات السكان أو ردود afferents تحديدها. إذا كان ارتفاع الأشكال هي فريدة من نوعها بما فيه الكفاية، ما يصل إلى 4 الخلايا العصبية الحسية يمكن أن يكون هناك تمييز من قبل البرامج (سواء Spike2 (التصميم الإلكتروني كامبريدج) وLabChart برو (صكوك م) أدوا بالمثل). في الحالات التي تكون فيها الخلايا العصبية لا يمكن التمييز، ويمكن بسهولة أن تنفذ التغييرات في القطب التنسيب أو القطر الحافة. وباختصار، فإن الماوس العضلات العصبية في المختبر preparأوجه المنهج التجريبي هو بسيط والتي يمكن استخدامها لتحقيق خصائص استجابة العضلات afferents الحسية لمختلف الاضطرابات والإصابات والأمراض النماذج الفيزيائية. بالإضافة إلى ذلك، تناسب هذا المستحضر مثالي للاستفادة من الأدوات الجينية القوية المتاحة في الفئران، بما في ذلك الحيوانات المعدلة وراثيا وأدوات optogenetic.

ومعصب العضلات والهيكل العظمي من الخلايا العصبية الحسية التي توفر الجهاز العصبي المركزي مع معلومات هامة عن البيئة العضلات. مغزل العضلات ودرجة عالية من التخصص الهياكل مغلفة تتكون من ألياف العضلات داخل المغزلية التي تقع بالتوازي مع ألياف العضلات خارج المغزلية. ومعصب مغزل من المجموعة الأولى أ والثاني afferents التي تكود التغيرات في طول العضلات والألياف داخل المغزلية هجة وينظم بشكل حيوي بواسطة الخلايا العصبية الحركية التعصيب جاما 1. يتم وضع المجموعة الأولى ب afferents بين ألياف العضلات والأوتار الإدراج وحساسة للتغيرات في قوة العضلات، على سبيل المثال خلال تقلص العضلات 2. مجموعة ألف وباء والثاني afferents توفر ردود الفعل المخصوص أن يساعد في التحكم في المحركات المناسبة. السكان إضافي من afferents العضلات الموجودة في جميع أنحاء العضلات (المجموعة الثالثة والرابعة) تخدم للإشارة إلى تراكم المستقلب، وجود محفزات مسبب للألم، ودرجة حرارة العضلات <sup&gt; 3. هذه المعلومات الحسية العضلات أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التوازن، ومنع تلف العضلات وتحوير الحركة. يمكن afferents العضلات يغير أنماط اطلاق النار على أساس الخبرة السابقة 4. تفعيل nociceptors يمكن أن يؤدي إلى تحريض دول الألم المزمن 5 والإشارات الشاذة من proprioceptors العضلات يمكن أن يؤدي إلى مشاكل في التوازن أو حركة 6. نستخدم معزولة العضلات العصبية في إعداد المختبر لدراسة استجابة العضلات نهايات الخلايا العصبية الحسية المستقبلة من الفئران البالغين من كلا الجنسين (كما هو موضح هي استجابات 2-4 أشهر من العمر C57BL / 6 الفئران). الماوس هو النوع الجيني نموذجا للدراسات في الثدييات. هذا التحضير يتطلب عزل الفرع الشظوي العميق من العصب الوركي والعضلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL)، ونشل العضلات بسرعة في المجموعة الشظوية وجدت في الجزء الجانبي من أسفل الساق. وكثيرا ما يستخدم في مؤسسة كهرباء لبنان لدراسة خصائص مقلص العضلات 7-9، الشركة المصرية للاتصالات لديهاndons التي هي سهلة لعزل وصغيرة بما يكفي للسماح توفير إمدادات كافية من الأكسجين ناشر في الراحة واجب مع دورات الانكماش معقولة 10. العضلات الأخرى في هذا المجال (على سبيل المثال النعلية والظنبوبي الأمامي) هي مشابهة من حيث الحجم وهذا المستحضر يمكن تعديلها بسهولة لتسجيل من afferents من هذه العضلات. يتم وضع قطب كهربائي شفط على نهاية قطع العصب الحسي لتسجيل العضلات اطلاق ارد. يمكن تحديد الخلايا العصبية الفردية وتحليلها على أساس شكل سنبلة سنبلة الخاصة بهم باستخدام برامج الفرز. تحفيز كهربائي في الحمام أو على العصب يمكن استخدامها لاستحضار تقلص العضلات. طول العضلات والقوة يمكن السيطرة عليها وقياسها باستخدام النظم المتاحة تجاريا. تشبه في المختبر استخدمت الاستعدادات في القوارض لدراسة المجموعة الثالثة والرابعة afferents العضلات في الفئران مؤسسة كهرباء لبنان 11، المجموعة الأولى أ والثاني afferents المغزل في الفئران الرابعة عضلة إصبع القدم الخراطينية 12 والمجموعة الثالثة والرابعة في العضلات afferents رانه الماوس أخمصي العضلات 13. نظام في المختبر لديها مزايا الوصول الدوائية والسيطرة المباشرة للمتغيرات سائل الإرواء والفيزيائية مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة. هذا النهج في المختبر يلغي احتمال في الجسم الحي يفند التخدير والعضلات الوضع الارواء. في حين إعداد العضلات العصبية يسمح لدراسة استجابة مباشرة لاضطراب على afferents، والقدرة على دراسة جاما صادر تعديل حساسية المغزل واستجابات متكاملة أخرى ما هو ممكن في الجسم الحي مع 14 أو فيفو السابقين والتضحية 3 الاستعدادات و لا توجد أجسام الخلايا العصبية في هذا الإعداد. كان هذا المستحضر المستخدمة سابقا لوصف استجابة afferents المغزل العضلات الماوس لبطارية من المنحدر ويمتد عقد والاهتزازات وتقرر أن الماوس المغزل رد و اردوكان وفاق مماثلة لتلك الواردة في الأنواع الأخرى مثل الفئران والقطط والبشر. تم العثور على الفأر الردود المغزل وارد أن تكون مماثلة في كل من 24 ° C و 34 ° C درجة حرارة حمام، وإن كان 34 ° C معدلات اطلاق المطلق كانت أسرع وكانت afferents أكثر قدرة على الاستجابة للتغيرات أسرع طول 15. وصفنا أدناه كيف يمكن استخدام هذا الإعداد لتحديد ودراسة afferents المغزل العضلات. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن يتم تعديل هذا الإعداد لدراسة استجابة أخرى فرعية وارد العضلات 13، لمقارنة خصائص afferents الحسية استجابة لحالة المخدرات أو المرض أو متغيرات أخرى متنوعة (مثل العمر والجنس وخروج المغلوب الجينات).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

العضلات الخلايا العصبية الحسية التعصيب مغزل العضلات وأجهزة جولجي وتر ترميز طول وقوة التغييرات الضرورية لاستقبال الحس العميق. الألياف وارد إضافية رصد الخصائص الأخرى للبيئة العضلات، بما في ذلك تراكم المستقلب، ودرجة الحرارة، والمحفزات مسبب للألم. عموما، وتفعيل غير طبيعي من الخلايا العصبية الحسية يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات الحركة أو متلازمات الألم المزمن. وصفنا عزلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL) العضلات والأعصاب للدراسة في المختبر من استجابات أثار تمتد ارد في الماوس الكبار. يتم تسجيل النشاط الحسي من العصب مع القطب شفط ويمكن تحليل afferents الفردية باستخدام البرمجيات ارتفاع الفرز. في المختبر الاستعدادات تسمح الدراسات التي تسيطر عليها بشكل جيد على afferents الحسية دون يفند المحتملة للتخدير أو نضح عضلة تغييرها. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد واختبار رد afferents المغزل العضلات لتمتد. الأهم من ذلك،هذا المستحضر كما يدعم دراسة فرعية أخرى من afferents العضلات، وخصائص استجابة التالية تطبيق المخدرات وإدماج النهج الوراثية قوية ونماذج المرض في الفئران.

رد afferents العضلات يمكن تسجيل التالية مجموعة متنوعة من الاضطرابات، اعتمادا على النوع الفرعي وارد يجري دراستها. وتظهر الردود تمثيلية من afferents المغزل العضلات لتقلص العضلات ومنحدر وعقد تمتد هنا. ونظرا لتعريف وارد باعتباره وارد المغزل، نشل تقلصات مرة واحدة كل ثانية (0.5 ميللي ثانية عرض النبض) لمعرفة إذا كان هناك وقفة في اطلاق خلال انكماش 18،19 الشكل 2 يظهر تتبع ممثل من نشاط الخلايا العصبية والتوتر في العضلات أثناء هذه التقلصات نشل. ويلاحظ أي نشاط الخلايا العصبية أثناء الانقباضات نشل، كما هو متوقع لafferents المغزل. سيكون إذا كان وارد سجلت المجموعة الأولى ب جولجي وارد الجهاز وتر، وزيادة في معدل إطلاق خلال الانكماش المتوقع. في ظل ظروف تحكم معظم afferents مع نمط اطلاق منتظم (~ 12 نبضات / ثانية في 24 ° C و~ 32 نبضات / ثانية في 34 ° C) هي العضلات afferents المغزل. مجموعة فرعية من afferents المغزل لن يؤدي إلا إلى النار خلال تمتد (في أيدينا ~ 11٪ من afferents المغزل) 15. يبين الشكل 3A أثر الخام تمثيلي اثنين afferents المغزل العضلات يرد على منحدر وعقد تمتد تنتجها وحدة تحكم القوة والطول. يتم استخدام ميزة سبايك الرسم البياني من LabChart لتحديد وتحليل وتيرة إطلاق النار الفوري من اثنين من الخلايا العصبية الفردية بشكل منفصل (أرقام 3B-3C). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. العضلات المعزولة إعداد أ) إبهام اليد الباسطة لأصابع (EDL) والتعصيب العصب الوركي هي التي شنت في حمام الأنسجة المعزولة مع perfused الاوكسيجين السائل الخلالي الاصطناعية (SIF). مكبر للصوت خارج الخلية متصلة suctiعلى القطب يسجل النشاط العصبي. قوة المزدوجة وطول تحكم مع البرمجيات المناسبة ضوابط وتدابير قوة العضلات والطول. الأقطاب حمام الأنسجة توفر محفزات لإنتاج نشل أو تقلصات كزازي. ضخ الماء الساخن من خلال القنوات وحة حمام الداخلية تسيطر على درجة حرارة حمام الأنسجة. B) سحبت الزجاج الشفط الكهربائي مع ~ 3 مم طرف مدبب. C) تضخيم تصوير الشكل المثالي للطرف القطب الشفط التي يتم إنتاجها باستخدام microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. المغزل وارد الرد على نشل الانكماش. activit العصبيةيتم فرضه ذ (تتبع العلوي) وتوتر العضلات (تتبع القاع) من 30 تقلصات نشل مع كبار أثر تداخل في الأسود. النشاط ارد مؤقتا خلال الناجم عن انكماش زيادة التوتر، وهو استجابة مميزة من afferents المغزل العضلات. قوس والسهم فوق أثر كبير دلالة على الوقت خلال الانكماش عند توقف النشاط. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> الرقم 3. المغزل وارد الرد على المنحدر وعقد الإمتداد) النشاط العصبي الخام من اثنين afferents (تتبع العلوي) خلال منحدر وعقد تمتد تطبيقها على مؤسسة كهرباء لبنان (طول العضلات هو مبين في أثر السفلي). B) تردد إطلاق النار الفوري (انست. الأب، نبضات في الثانية) وحدة النشاط في معرض L س من أ (يظهر باللون الأزرق). C) INSTANTANEتردد اطلاق الأوس وحدة أصغر الحرائق فقط خلال تمتد (كما هو موضح باللون البرتقالي). كلا وحدات تكييف تظهر ارتفاع وتيرة خلال تمتد الذي تتميز به afferents المغزل العضلات 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

وتشارك العضلات الخلايا العصبية الحسية في إشارة مستقبلة الحس العميق، وكذلك تقريرا عن الأحداث والإصابات المرتبطة الدولة الأيضية. وصفنا ماوس الكبار في المختبر إعداد العضلات العصبية للدراسات afferents على تنشيط العضلات تمتد.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K Views.  San José State University.  وتشارك العضلات الخلايا العصبية الحسية في إشارة مستقبلة الحس العميق، وكذلك تقريرا عن الأحداث والإصابات المرتبطة الدولة الأيضية. وصفنا ماوس الكبار في المختبر إعداد العضلات العصبية للدراسات afferents على تنشيط العضلات تمتد. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

دراسة دمج الكبار المولد الخلايا العصبية

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; إعداد والحث على تسجيل البرامج موتور تغذية مع الحركات الفسيولوجية في<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; إعداد الخلايا العصبية المعوية المعزولة والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية من الماوس الكبار

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

في المختبر المقايسة لدراسة تجميع البروتين تاو وفحص المخدرات

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...