This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

יש לקבל את אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. .1 הסרה של שרירים EDL ועצב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ועמוק להרדים עכבר מבוגר עם isofluorane בשאיפה באמצעות אידוי עם isofluorane 5% בתוספת 1.5 L / קצב זרימת חמצן דקות או צנצנת פעמון עם הכותנה isofluorane ספוג בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא עמוק בהרדמה ואינו מגיב לקמצוץ הבוהן. במהירות לערוף באמצעות מספריים גדולים, חידדו או גיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע הגחון דרך הצלעות באמצעות מספריים ולהסיר את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור בעלי החיים ידי אחיזה בעור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר הרגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגליים על ידי חיתוך מעל הירכיים ומניחים את רגלי עור לתוך צלחת עם (4 ° C) המצונן, carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) סידן נמוך, contai תמיסת מלח ביקרבונט שנאגרו גבוה מגנזיוםנינג במ&quot;מ: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 3 NaHCO, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, ו10 גלוקוז (pH של 7.4 ± 0.05) 16. סידן הנמוך, פתרון הגבוה מגנזיום מעכב שידור סינפטי במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רגלי צד גב בצלחת ולהצמיד את הרגליים וירכיים למטה באמצעות מחטים או סיכות חרקים, כך שמפרקי הברך וקרסול נמצאים בזווית של ° 90. הנח פינים בכל קצה של הרגליים וסיכה אחת בכל אחת מהקדמית וירכיים אחורי כדי להחזיק את הרקמה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים אביב Castroviejo, להרים את השכבה העליונה של שריר בירכיים ולעשות קו האמצע לחתוך לחשוף את גיד הנשה ישירות מתחת. גיד הנשה ממוקם ממש מתחת לשכבת השריר העליונה והוא פועל מעל לעצם הירך מהיציאה שלה ליד הירכיים עד שסניפים לperoneal המשותף והעצב הטיביאלי רק לפני מפרק הברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השריר מעל גיד הנשה עד פוint שבצלילות סניף עצב peroneal העמוקים לתוך שריר longus hallucis המכופף (FHL) הוא גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # 55 מלקחיים, לנתח את רקמת החיבור סביב סניף peroneal כדי לשחרר אותו משרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus, אשר נמצאים בצד המדיאלי של הטיביה. חותך את הגידים של שרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus ולהסיר אותם בזהירות מתחת לעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השרירים השטחיים בצד הלטרלי של הטיביה לחשוף שלוש חבילות גיד נפרדות בקרסול משותף מהמדיאלי לרוחב: FHL, EDL, וקדמי tibialis (ת&quot;א), עם EDL החבוי מתחת לת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד ת&quot;א במפרק הקרסול, להרים את ת&quot;א למעלה מן האדים, ולחתוך את השריר ליד הברך כדי להסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד FHL בקרסול ולהרים אותו חזרה כדי להגיע לאזור שבו העצב נכנס FHL. חותך רק מתחת לנקודה זו ולהסיר ~ 2/3 של שריר FHL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד הנשה הקרוב למפרק הירך כמו possible ועדינות להפשיט את כל ענפי העצב, פרט לסניף peroneal העמוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גידי EDL בשני מפרקי הקרסול והברך באמצעות מספריים אביב גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להסיר את האדים, FHL שנותר ועצב מן הרקמה הסובבת על ידי חיתוך דרך עצם השוקה בברך ובאמצע הירך. לחתוך את עצם השוקה שנותר, כך שרק האדים, חלק מFHL והעצב יישארו. </li></ol> 2 הרכבה של השרירים EDL והעצב לתוך אמבט רקמות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, להכין את האמבטיה הרקמות. כל הזמן perfuse האמבטיה עם חומץ (100% O 2) נוזל ביניים סינטטי (SIF) המכיל (במ&quot;מ) 123 NaCl, KCl 3.5, 0.7 MgSO 4, 1.7 לאא 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NAC 6 H 11 O ( gluconate נתרן), 5.5 גלוקוז, סוכרוז 7.5, ו10 N &#39;N -2-hydroxyethylpiperazine- -2-etחומצת hanesulfonic (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. קצב זרימה של 15-30 מ&quot;ל / דקה מומלצת. מוצג היא אמבטיה זמינה מסחרי של 25 מ&quot;ל קיבולת עם שתי אלקטרודות גירוי קבועות לתחתית האמבטיה, הודעה רקמות רכובה והר לבקר כוח ואורך (מידות אמבטיה משוערת 8.5 סנטימטר x 3 ס&quot;מ x 1 סנטימטר; למפרטים ראה טבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמת FHL שנותרה לטפל בשריר העצב הבודד ולמקם אותו לתוך האמבטיה הרקמות. מניחים חתיכה קטנה של sylgard בתחתית הצלחת ולהשתמש בסיכת חרקים דרך רקמת FHL שנותרה כדי לייצב את השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 6-0 תפרי משי לקשור את שני הגידים ולהדביק קצה אחד לתפקיד רקמות ואחר לזרוע המנוף של הכוח ובקר אורך (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרט). השתמש באורך התפר הקטן ביותר שהוא מעשי. הסר את סיכת החרקים וsylgard לאחר שקשרת את הגידים. הערה: כדי להקל קלחיבור למנוף זרוע חתיכה קטנה של חוט יכולה להיות כפופה ל&quot; j &quot;וו בצורה וקבועה לזרוע המנוף עם אפוקסי. התפר אז יכול להיות קשור לחוט במקום מושחל לתוך החור הקטן על זרוע המנוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אלקטרודות יניקה מSA 16 זכוכית באמצעות חולץ micropipette הכוס הראשון (חום = 286, משוך = 0, מהירות = 150, זמן = 200); לשבור את הקצה אחורי וידני לטחון אותו על אבן השחזה עד שיהיו על להתחדד 3 מ&quot;מ. ממסים את הקצה באמצעות microforge לקוטר הפנימי הקצה הרצוי של בין 10-100 מיקרומטר בהתאם לאזור של עצב אחד רוצה לטעום מ( ראה איורים 1 ב-1C לאלקטרודה סכמטי ולוח של חומרים / ציוד למידע על מוצר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא האלקטרודה יניקת זכוכית premade לחוט הכסף הפנימי עם SIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יניקת סוף החתך של העצב לאלקטרודה ולהתחבר ליציאה החיובית של מגבר ההפרש. עטוף את האלקטרודה עם כסף chloridedחוט שמתחבר ליציאה השלילית של headstage. קרקע האמבטיה SIF על ידי הפעלת חוט כסף chlorided שני מהאמבטיה לנמל הקרקע של headstage. גם לקרקע את צינורות טפטוף לכלוב פאראדיי במספר רבים של נקודות כדי להקטין רעש חשמלי הציג באמצעות משאבות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את השרירים באמצעות אלקטרודות מוצמדות לכל צד של השריר באמבטיה הרקמות כדי לגרום להתכווצות עווית. לחלופין להציב אלקטרודה מגרה בקצה החתך של העצב. הגדל את מתח המגרה עד כוח התכווצות שיא הוא ציין ולאחר מכן להגדיל את המתח על ידי 15% נוספים כדי להגיע למתח supramaximal (0.5 רוחב פולס אלפיות שני). המשך התכווצויות העווית במתח supramaximal, עם שאר 10 שניות שביניהם, אבל להשתנות האורך של השריר עד כוח התכווצות שיא הוא הגיע כדי למצוא את האורך האופטימלי (o L) של השריר. כל רמפות האורך והתנודות יתחילו עם השרירים בleng זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הכנת שריר העצבים להישאר באמבטיה במשך שעה לפחות 1 לפני איסוף הנתונים הבא על מנת לאפשר לרקמות כדי להגיע לטמפרטורת האמבט ולשידור סינפטי רגיל להתאושש לאחר נתיחה בפתרון סידן נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף נתונים בטמפרטורה אחרת מאשר טמפרטורת חדר, למקם את הבדיקה טמפרטורה לאמבטיה הרקמות ליד השריר. לאט לאט מביא את האמבטיה עד לטמפרטורה על ידי שאיבת מים מחוממים באמצעות צלחת בסיס אמבטיה רקמות. לעטוף כריות חימום במיקרוגל חימר סביב מאגר SIF כדי לעזור לשמור על טמפרטורה יציבה. </li></ol> .3 אוסף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מביא כמביא ציר, להקליט את הפעילות העצבית במהלך צירים חוזרים ונשנים עווית המיוצרים על ידי גירוי מתח 0.5 supramaximal האלפיות השני נמסר פעם אחת בכל שנייה. הערה: afferents כישור השריר צריכה להשהות במהלך 18,19 התכווצות עווית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש daתוכנת רכישת ta כדי להחיל את השינויים באורך במהירויות שונות ואורכים שונים. השתמש בתסריט מותאם אישית כדי להפוך משימה זו (ראה מידע נוסף לצילום מסך של התסריט והוראות כיצד להתאים אישית את המתיחות שניתנו). החל משתרע רמפה והחזקה של 4 שניות באורכי מתיחה של .2.5%, 5%, ו7.5% o L ומהירויות מתיחה של 20, 40, או 60% o L / 15 שניות. הערה: עיין במדריך למשתמש של כוח ספציפי ובקר אורך לגורם המרת מתח ל-מילימטר הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, לקבוע בריאות שריר ב24 מעלות צלזיוס באמצעות התכווצויות מקסימליים איזומטרי tetanic (500 רכבת אלפיות שנייה, תדירות רכבת הרץ 120, 0.5 רוחב פולס msec, מתח supramaximal). השווה את כוח התכווצות השיא לערכים שדווחו בעבר (~ 24V N / 2 סנטימטר 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר שיטת רישום מafferents כישור שריר בהכנת שריר עצבים עכבר בודדת. מצאנו כי afferents ציר העכבר מגיבה באופן דומה למתוח כמו אלה מחולדות, חתולים ובני אדם 15, ומעבדות אחרות השתמשו עכברים כיצורי מודל ללמוד נוירונים חושיים בשני השרירים והעור במבחנה (לדוגמא 3,13) . afferents החושית השריר ניתן להקליט לפחות 6-8 שעות בשני 24 מעלות צלזיוס ו34 C °. כדי למזער את הטיפול באדים ועצב, להשתמש בחלק הנותר של FHL לטפל רקמה בכל ההזדמנות אפשרית. בעקבות הנתיחה, לחכות לפחות שעה 1 כדי להתחיל אוסף נתונים כדי לאפשר לרקמות לאזן לטמפרטורת אמבטיה ולשידור סינפטי נורמלי להתאושש. בעבר, בריאות שרירים אומתה על קבוצת משנה של שרירים המשמשים בהכנה זו על ידי קביעה כי קונטרה tetanic המקסימליכוח ctile שנוצר על ידי השרירים דומה לזה שדווח על ידי אחרים בתחילת והסיום של הניסוי 15. afferents כישור השריר זוהו פונקציונלי בהכנה זה על ידי מחפש אתנחתא אופיינית בירי בתגובה לעווית התכווצות (איור 2), כמו גם את העליות בתדירות מיידית הצפויות בתגובה לשינויים באורך (איור 3). מניסיוננו, רוב afferents שהופעלה בתנאי שליטה היא afferents כישור שריר. אורכו של העצב נשמר בהכנה זו (~ 7 מקסימום מ&quot;מ) הוא לא מספיק זמן כדי להשתמש בהבדלי מהירות הולכה מביא לזהות תת מביא שריר 13. בנוסף, שלא כמו בחתולים ובני אדם, באמצעים של רגישות דינמית לא היו מסוגלים להבחין בבירור הקבוצה Ia והשני afferents בעכברים (לדיון נוסף ראה וילקינסון et al. 15). סוגים אחרים של afferents (כלומר., הקבוצה שלישית ורביעי) יכול להיות מזוהה בבדיקות פונקציונליות נוספות בהכנה זו, למשל על ידי הוספת חומרים כמו קפסאיצין, ATP, או ברדיקינין, ירידת pH אמבטיה, חושף את השרירים לאיסכמיה, וכו &#39;3,13,21-23 באמצעות אלקטרודות יניקה מאפשר הפעילות מתא עצב חושי מרובה שתירשם בו זמנית, דבר המגדיל את כמות הנתונים שניתן לאסוף משריר אחד. הכנה זו יכולה לשמש כדי לאמוד את ההשפעה הכוללת של ההפרעות על תגובות אוכלוסיית נוירון חושיות או התגובות של afferents המזוהות. אם צורות ספייק הן ייחודיות מספיק, עד 4 תאי עצב תחושתיים יכולה להיות מופלה על ידי תוכנה (שני Spike2 (Cambridge אלקטרוני עיצוב) ו( מכשירים לספירה Pro LabChart) ביצע באופן דומה). במקרים בהם לא יכולים להיות מופלים נוירונים, שינויים במיקום האלקטרודה או קוטר קצה יכולים בקלות להיות מיושמים. לסיכום, שריר העצבים עכבר בהכנה מבחנהני הוא גישה ניסויית פשוטה, שניתן להשתמש כדי לחקור את מאפייני התגובה של afferents החושית שרירים לדגמי הפרעות, פציעה והמחלה physicochemical שונים. בנוסף, הכנה זו היא אידיאלית לנצל את כלים רבי עוצמה הגנטיות הזמינים בעכברים, כולל בעלי חיים מהונדסים וכלים optogenetic.

שרירי שלד מעוצבבים על ידי נוירונים חושיים המספקים את מערכת העצבים המרכזית עם מידע חשוב על סביבת השריר. צירים שריר מאוד מתמחים מבנים במארז מורכבים מסיבי שריר intrafusal הממוקמים במקביל לסיבי שריר extrafusal. צירים מעוצבבים על ידי הקבוצה Ia והשני afferents שלקודד שינויים באורך שריר וטונוס סיבי intrafusal מוסדרים באופן דינמי על ידי הנוירונים מוטוריים גמא innervating 1. afferents Ib הקבוצה ממוקמות בין סיבי שריר והוספות גידם ורגישים לשינויים בכוח שרירים, למשל בעת התכווצות שרירים 2. Ia הקבוצה, Ib והשני afferents לספק משוב הפרופריוצפטיבית שמסייע בשליטה מוטורית מתאימה. אוכלוסיות נוספות של afferents שרירים הממוקמים ברחבי השריר (קבוצה שלישית ורביעי) משמש כדי לאותת הצטברות המטבוליט, הנוכחות של גירויי nociceptive, וטמפרטורת שריר <sup&gt; 3. מידע חושי שריר זה הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס, מניעת נזק לשרירים וויסות תנועה. afferents השריר יכולה לשנות את דפוסי הירי שלהם המבוססת על הניסיון קודם 4. הפעלה של nociceptors יכולה להוביל לגיוס של מדינות כאב כרוניות 5 ואיתות סוטה מproprioceptors השריר יכול להוביל לבעיות של שיווי משקל או תנועה 6. אנו משתמשים בשרירי עצבים מבודדים בהכנת מבחנה ללמוד את התגובה של הסופים קולט נוירון חושי שרירים מעכברים בוגרים משני המינים (המוצגים הם תגובות של 2-4 חודש C57Bl / 6 עכברים ישנים). העכבר הוא המין הגנטי המודל למחקרים ביונקים. הכנה זו דורשת הבידוד של הסניף העמוק peroneal של העצב משית ושרירי longus digitorum פושטי (אדי), שרירים עווית מהירים של קבוצת peroneal נמצאת בחלק הלטרלי של הרגל התחתונה. EDL משמש לעתים קרובות כדי לחקור את תכונות התכווצות השרירים 7-9, יש tendons כי הם קלים לבודד והוא קטן מספיק כדי לאפשר אספקת חמצן diffusive נאותה במנוחה ועם מחזורי חובת התכווצות סבירים 10. שרירים אחרים באזור זה (לדוגמא soleus וקדמי tibialis) הם בגודל דומה והכנה זה יכול לשנות בקלות כדי להקליט מafferents משרירים אלו. האלקטרודה יניקה ממוקמת על קצה החתך של העצב להקליט ירי מביא חושי שריר. ניתן לזהות נוירונים בודדים ונותחו על פי צורת ספייק שלהם באמצעות תוכנת מיון ספייק. גירוי אלקטרודות באמבטיה או על העצב יכול לשמש כדי לעורר התכווצות שרירים. אורך שריר וכוח יכולים להיות מבוקר ונמדדו באמצעות מערכות זמינות מסחרי. דומה במבחנה הכנות כבר בשימוש במכרסמים כדי ללמוד afferents שריר הקבוצה השלישית והרביעית בחולדה 11 EDL, afferents ציר הקבוצה Ia והשנייה בשריר בוהן העכברוש הרביעי lumbrical 12 ושרירים הקבוצה שלישי והרביעיים afferents בtהוא שריר plantar העכבר 13. מערכת במבחנה יש את היתרונות של נגישות תרופתית ושליטה ישירה של משתני perfusate וphysiochemical כמו טמפרטורה וחומציות. גישה במבחנה מבטלת את הפוטנציאל in vivo מבלבל מעמד זלוף הרדמה ושרירים. בעוד הכנת שריר העצבים מאפשרת לחקר התגובה הישירה של ההפרעות בafferents, היכולת ללמוד אפנון efferent גמא של רגישות ציר ותגובות משולבות אחרות שאפשרי עם in vivo 14 או ex vivo 3 הכנות הוא הקריבה כ אין גופי תא עצביים בהכנה זו. הכנה זו שימשה בעבר כדי לאפיין את התגובה של afferents כישור שריר עכבר לסוללה של רמפה ולהחזיק מתיחות ורעידות ונקבע כי respons מביא ציר העכברes היו דומה לאלו שדווחו במינים אחרים כגון חולדות, חתולים, ובני אדם. תגובות מביא ציר עכבר נמצאו דומה בשתי מעלות צלזיוס 24 ו34 ° טמפרטורות האמבטיה C, אם כי ב34 ° שיעורי ירי מוחלט C היו מהירים יותר וafferents היו יותר מסוגל להגיב לאורך מהר משנה 15. אנו מתארים בהמשך כיצד הכנה זו יכולה לשמש כדי לזהות וללמוד את afferents כישור שריר. יתר על כן, הכנה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי ללמוד את התגובה של תת מביא שריר אחר 13, כדי להשוות את המאפיינים של afferents החושית בתגובה למדינת תרופה או מחלה או משתנה שונים אחרים (למשל, גיל, מין, נוקאאוט גן).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

עצב סנסורי שריר innervating צירים שרירים ואיברי גיד Golgi לקודד אורך וכוח שינויים חיוניים לפרופריוספציה. סיבים הביא נוספים לפקח על מאפיינים אחרים של סביבת השריר, כוללים הצטברות המטבוליט, טמפרטורה, וגירויים nociceptive. בסך הכל, הפעלה לא תקינה של תאי עצב תחושתיים יכולה להוביל להפרעות תנועה או תסמונות כאב כרוניות. אנו מתארים את הבידוד של longus digitorum פושטי השריר (EDL) ועצב למחקר במבחנה של תגובות מביא עורר קטע בעכבר המבוגר. פעילות חושית נרשמה מהעצבים עם האלקטרודה יניקה וניתן לנתח afferents בודדת באמצעות תוכנת מיון ספייק. במבחנה הכנות לאפשר למחקרים מבוקרים היטב על afferents החושית ללא בלבול הפוטנציאלי של הרדמה או זלוף השריר שינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות ולבחון את התגובה של afferents כישור השריר למתוח. חשוב לציין,הכנה זו תומכת גם במחקר של סוגים אחרים של afferents שריר, מאפייני התגובה הבאים יישום סמים ושילוב של גישות חזקות גנטיות ומודלי מחלה בעכברים.

התגובה של afferents שריר ניתן להקליט הבא מגוון של הפרעות, תלוי באיזה מביא תת סוג נחקר. תגובות נציג של afferents כישור שריר להתכווצות שרירים ורמפה ולהחזיק מתיחה מוצגות כאן. מקבלות התכווצויות לזהות מביא כמביא ציר, תפרפרו פעם אחת בכל שנייה (0.5 רוחב פולס אלפיות שני) כדי לראות אם יש הפסקה בירי במהלך 18,19 התכווצות. איור 2 מראה עקבות נציג של פעילות עצבית ומתח שרירים במהלך התכווצויות עווית אלה. אין פעילות עצבית שנצפתה במהלך צירים עווית, כצפוי לafferents ציר. אם מביא נרשם היה מביא איבר גיד הקבוצה Ib Golgi, עלייה בירי שיעור במהלך ההתכווצות שניתן היה לצפות. בתנאי השליטה ביותר afferents עם דפוס קבוע ירי (~ 12 דחפים / sec ב24 ° C ו~ 32V דחפים / sec ב34 ° C) הם afferents כישור שריר. קבוצת משנה של afferents הציר יהיה רק באש במהלך המתיחה (בידיים שלנו ~ 11% מafferents הציר) 15. איור 3 א מציג עקבות גלם נציג של שתי afferents כישור השריר מגיבות לרמפה ולהחזיק מתיחה המיוצרת על ידי בקר הכוח ואורך. תכונת ספייק היסטוגרמה של LabChart משמשת לזיהוי ולנתח אותם בתדר הירי של שני נוירונים בודדים בנפרד (איורים 3 ב-C3). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 שריר מבודד הכנה) longus digitorum פושטי (EDL) וגיד הנשה innervating הם רכובים באמבטית רקמות מבודדת perfused עם נוזל החומץ סינטטי ביניים (SIF). מגבר תאי מחובר לsuctiעל האלקטרודה רושמת פעילות עצבית. כוח כפול ואורך בקר עם תוכנת בקרה ואמצעים מתאימות בכוח שריר ואורך. אלקטרודות האמבטיה הרקמות לספק גירויים כדי לייצר עווית או התכווצויות tetanic. שאיבת מים מחוממים בערוצי צלחת אמבטיה פנימיים שולטת בטמפרטורת האמבטיה רקמות. B) משך האלקטרודה יניקת זכוכית עם תיאור ~ 3 מ&quot;מ קצה מחודד. C) מוגדל של צורת הקצה האידיאלית עבור האלקטרודה היניקה כי הוא מיוצר באמצעות microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 ציר מביא תגובה לעווית התכווצות. Activit עצביy (זכר עליון) ומתח שרירים (זכר תחתון) מ30 התכווצויות עווית הם על גבי עם עקבות חופפות העליונים בשחור. פעילות מביא עוצרת בעליית מתח מושרה התכווצות, אשר היא תגובה אופיינית לafferents כישור שריר. Bracket וחץ מעל העקבות העליונים מציינים את הזמן במהלך התכווצות כאשר הפעילות מושהה. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3 ציר מביא תגובה לרמפה והחזיקו למתוח) פעילות עצבית גלם של שתי afferents (זכר עליון) במהלך רמפה ולהחזיק מתיחה להחיל את אדי (אורך שריר מוצג בזכר תחתון). B) תדירות הזרקה מיידית (Inst. האב, דחפים לשנייה) של היחידה המציגה את הפעילות בo L מ( מוצגים בכחול). C) Instantaneתדירות היחידות הארגוניות ירי של היחידה קטנה יותר שרק שריפות במהלך המתיחה (המוצגת בכתום). שני היחידות להפגין הסתגלות תדירות ספייק במהלך מתיחה אופייני לafferents כישור שריר 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K Views.  San José State University.  עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה. 

Video: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

<em&gt; במבחנה</em&gt; הכנה להפקה והקלטה של ​​תוכניות רכב האכלה עם תנועות פיסיולוגיות<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...