نشكر فنيي مختبر علم الجراثيم في مركز مستشفى جامعة لوزان لمساعدتهم على تنفيذ التقنيات في المختبر.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وبعد التحقق من صحة عمليات البحث والتطوير والقواعد الأخلاقية لمؤسستنا قبل تطبيقها كأداة روتينية. 1. إعداد ثقافة الدم الجرثومي بيليه من كلوريد الأمونيوم الإجراءات كرات الدم الحمراء، lysing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثقافة الدم إيجابية لاحق الطرد المركزي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الغطاء ثقافة الدم. إضافة 70٪ من الإيثانول على غطاء الزجاجة وحرقها. ملاحظة: لا تؤدي هذه الخطوة تحت غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل زجاجة إلى غطاء تدفق الصفحي. جمع 5 مل من ثقافة الدم مع حقنة G 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من ثقافة الدم في أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 45 مل من الماء المعقم (H 2 O) وخلط العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بيليه البكتيرية ثقافة الدم عن طريق تحلل الطرد المركزي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريمولقد طاف (الذي يحتوي أساسا H 2 O وخلايا الدم) مع مضخة فراغ مختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 1 مل من كلوريد الأمونيوم الصنع lysing الحل (0.15 M NH 4 الكلورين، 1 ملم KHCO 3). كسر بيليه عن طريق كشط وقبل vortexing الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي العينة في 140 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف التي تحتوي أساسا خلايا الدم الحمراء الحطام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا بقي بيليه النزفية، resuspend وبيليه في 2 مل من معقم والمقطر H 2 0 لزيادة ليز خلايا الدم الحمراء والمتبقية لغسل بيليه. أجهزة الطرد المركزي العينة في 140 x ج لمدة 10 دقيقة في RT وتجاهل طاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من H 2 O </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية من ثقافة الدم على مختلف انتقائي وغير انتقائي وسائل الإعلام أجار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 1 مل من ثقافة الدم مع حقنة G 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 1 قطرة من ثقافة الدم كثافة العملياتس أربعة أجزاء على أجار الدم، والشوكولاته أجار، McConkey أجار وSchaedler أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 ° C أجار الدم وألواح الشوكولاته أجار في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، وأجار McConkey في جو طبيعي ولوحة أجار Schaedler في الظروف اللاهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع نمو البكتيريا على وسائل الإعلام المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من النقاء البكتيرية. </li></ol></li></ol> 2. تحديد بواسطة MALDI-TOF MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف المباشر من بيليه الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 ميكرولتر من الدم بيليه على لوحة الهدف MALDI واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب العينة مع حمض الفورميك 1 ميكرولتر 70٪ واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب العينة مع 1 ميكرولتر من MALDI مصفوفة (محلول مشبع من α-سيانو-4-hydroxycinnamic حامض في 50٪ حامض trifluoroacetic الأسيتونيتريل 2.5٪) واتركها لتجف على 42 ° C منصة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى MALDI-TOF MS تحليل مع نظام MALDI-TOF MS كما هو موضح من قبل الشركات المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت النتيجة غير صالحة التعرف على مستوى الأنواع (على سبيل المثال مع درجة &lt;2)، إجراء استخراج البروتين من العينة بيليه الدم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بعد استخراج البروتين من بيليه ثقافة الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 20 ميكرولتر من بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإضافة 25 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪ و 25 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونيتريل لبيليه. دوامة بقوة ل resuspend الكريات. و resuspend الكريات الصعبة عن طريق كسر عليهم مع نصائح ماصة قبل vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. نقل 1 ميكرولتر من طاف (التي تحتوي على البروتينات المستخرجة) على لوحة الهدف MALDI واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية. تابع كما هو موضح في 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3. البكتيرية Identification والمضادات الحيوية اختبار الحساسية مع نظام الميكروبية الآلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق البكتيرية لتحديد البكتيريا وAST مع نظام الميكروبية الآلي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنبوب من البلاستيك تحتوي على 3 مل من العقيمة 0.45٪ كلوريد الصوديوم الحل متوافق مع نظام الميكروبية الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية كافية من بيليه ثقافة الدم في 0.45٪ كلوريد الصوديوم الحل للحصول على تعليق البكتيرية المقابلة لتعكر مكفارلاند من 0،6-0،8. قياس العكارة باستخدام آلة قياس شدة الضوء. ملاحظة: حجم بيليه البكتيرية ثقافة الدم يتراوح بين 50 و 200 ميكرولتر لتحقيق التعكر مكفارلاند من 0،6-0،8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الآلي إيجابية الجرام (GP) أو سالبة الجرام (GN) بطاقات لتحديد الهوية وبطاقات AST الآلي لاختبار الحساسية للمضادات الميكروبات من البكتيريا إيجابية الغرام وسلبية الغرام والبكتيريا كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. ملاحظة: Identificatioن مع GP أو بطاقات حسن الجوار لا يطبق إذا MALDI-TOF MS تحديد قيمة النتيجة هي&gt; 2. تحقق نقاء تعليق البكتيرية بواسطة subculturing تعليق البكتيرية على أجار الدم (GP وGN) وآغار ماكونكي (GN) لوحات. </li></ol> 4. المضادات الحيوية اختبار حساسية قبل القرص إنتشار الفحص يوصف فحص القرص نشر من قبل اللجنة الأوروبية على اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات (EUCAST، الإصدار 3.0، إبريل عام 2013، www.eucast.org). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق البكتيرية لإجراء اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات عن طريق الانتشار فحص القرص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنبوب زجاجي يحتوي على 3 مل من معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية كافية من بيليه ثقافة الدم في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل للحصول على تعليق البكتيرية المقابلة لتعكر مكفارلاند 0.5. قياس العكارة باستخدام آلة قياس شدة الضوء. ملاحظة: حجم ثقافة الدمبيليه البكتيرية يتفاوت بين 50 و 200 ميكرولتر لتحقيق التعكر مكفارلاند من 0،6-0،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة تعليق البكتيرية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح تعليق البكتيرية على أجار مولر هينتون (MH) أو مولر هينتون أجار أجار الحساسية الكائنات الحية (MHF) (MH تستكمل مع 5٪ مزال الفبرين دم الحصان و 20 ملغم / لتر من β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع مسحة القطن المعقمة في تعليق البكتيرية وإزالة بلطف السوائل الزائدة من خلال تحويل مسحة على الجدار الداخلي للأنبوب زجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر تعليق البكتيرية بالتساوي على كامل سطح لوحة أجار MH / MHF بواسطة ينظف في ثلاثة اتجاهات أو باستخدام لوحة المدورة الآلي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الأقراص المضادة للميكروبات على لوحات أجار تلقيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق كثب الأقراص على سطح المجففة لوحات أجار تلقيح يدويا أو باستخدام موزع القرص قابلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في تيمبي المناسبrature والغلاف الجوي كما هو موضح في اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات طريقة نشر القرص EUCAST (الإصدار 3.0، إبريل عام 2013، www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. الآلي PCR القائم على اختبار تشخيص للكشف عن الجرثومة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micropipette، ونقل 50 ميكرولتر من بيليه ثقافة الدم إلى قارورة العينة كاشف المتوفرة مع هذه الجرثومة الآلي PCR القائم التشخيص اختبار عدة ودوامة خلال 20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micropipette 1 مل، الاستغناء العينة في منفذ عينة من خرطوشة. إدراج خرطوشة في نظام PCR الآلي وبدء الفحص كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study.">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li><li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States:+analysis+of+incidence,+outcome,+and+associated+costs+of+care.">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li><li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+in+European+intensive+care+units+results+of+the+SOAP+study.">Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study.</a> Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).</li><li>Micek, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empiric+combination+antibiotic+therapy+is+associated+with+improved+outcome+against+sepsis+due+to+Gram-negative+bacteria+a+retrospective+analysis.">Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).</li><li>Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+importance+of+microbiological+findings+in+the+diagnosis+and+management+of+bloodstream+infections.">The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections.</a> Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).</li><li>Barenfanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+mortality+associated+with+prompt+Gram+staining+of+blood+cultures.">Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures.</a> American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).</li><li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection:+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management.">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study.">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li><li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+bacteria+from+BacT/ALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction.">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li><li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li><li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li><li>Croxatto, A., Prod&amp;34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems.">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets.">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system.">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li><li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management.">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li><li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients.">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li><li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae.">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

مقارنة مع النهج التشخيص التقليدية ثقافة الدم إيجابية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية باستخدام كلوريد الأمونيوم تحلل نهج الطرد المركزي يقلل من الوقت لتقرير الهوية من قبل 16 إلى 24 ساعة والوقت لتقرير AST قبل 24 إلى 48 ساعة (الشكلان 1 و 3). <p class="jove_content" style=";text-align:r...

التهابات مجرى الدم والإنتان في المرضى في المستشفيات هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. وهكذا، ويلاحظ الوفيات المتعلقة دموية العدوى في حوالي 14٪ إلى 37٪ من المرضى في المستشفى وربما تزيد إلى 35٪ في وحدات العناية المركزة المرضى 1-3. تحديد السريع للجراثيم هو محوري في توجيه العلاج المضادة للميكروبات الأمثل وزيادة نجاح العلاج المضادة للميكروبات 4،5. التحليل السريع للبقع غرام من ثقافة الدم إيجابية بالفعل لها تأثير كبير على تكييف العلاج المضادة للميكروبات 6،7 ولكن التحديد الدقيق للجراثيم هو مطلوب لتوفير أفضل العلاج بالمضادات الحيوية تتكيف مع المرضى. على سبيل المثال، تختلف نظم العلاج بالمضادات الحيوية لا بد من تنفيذها التالية تجرثم مع المكورات المعوية والعقديات التي يصعب تمييز من قبل غرام تلطيخ. وبالمثل، والتعرف على الأنواع ليفمطلوب ايل للكشف غرام enterobacteria السلبية ترميز الجينات الصبغية شركة المرفأ للطاقة التي تمنح مقاومة لزيادة β-اكتام 8. مع ثقافة الدم إيجابية، ونهج التشخيص التقليدي لثقافة فرعية للجراثيم على لوحات أجار مختلفة، الأمر الذي يتطلب عدة ساعات من الحضانة إضافية تحديد مسبق مع الطرق المختلفة بما في ذلك الاختبارات البيوكيميائية والنمو على وسائل الإعلام المختلفة انتقائية ونظم التعرف الآلي الميكروبي. الوقت لنتائج نهج التشخيص التقليدي هو من حوالي 1 إلى 3 أيام. وقد وفرت ظهور بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF) التكنولوجيا من أجل التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة أداة جديدة لتحديد بسرعة الكائنات الدقيقة من المستعمرات نمت على لوحات أجار ولكن أيضا مباشرة من الدم إيجابي الثقافات (الشكل 1) 9-12. عشراستخدام البريد من MALDI-TOF لتحديد وكيل المعدية من الثقافات الدم قد قلل كثيرا من الوقت إلى النتائج لبضع دقائق بدلا من ساعات وأيام تتطلبها الطرق التقليدية. كما نوقش من قبل Croxatto وآخرون 13، وكفاءة تحديد MALDI-TOF تعتمد على معايير مختلفة بما في ذلك نقاء الكائن الدقيق وكميتها. يتم الحصول على هذين المعيارين بسهولة من مستعمرات منفصلة نمت على لوحات أجار ولكن تتطلب العلاج قبل تحليلية لتخصيب البكتيرية وتنقية من عينات معقدة مثل ثقافة الدم، والتي تحتوي على العديد من المكونات الخلوية والبروتينات التي قد تتداخل مع تحديد MALDI-TOF. وقد استخدمت أساليب العزلة مختلف الكائنات الحية الدقيقة &quot;من ثقافة الدم في عدد من الدراسات بما في ذلك سابونين أو غيرها من طريقة المنظفات معتدل لاستخراج بكتيريا 9،14، المصل طريقة فاصل 10، تحلل أساليب الطرد المركزي 12 </sتصل&gt; والحلول تجاريا مثل مجموعة sepsityper. وقد وضعت لدينا مختبر التشخيص الجراثيم بسيطة ثقافة الدم بيليه البكتيرية إعداد استنادا كلوريد الأمونيوم كرات الدم الحمراء، التي تتيح تحديد هوية تحلل سريع من البكتيريا والخميرة بواسطة MALDI-TOF ونظم التعرف الآلي (الشكل 2) 15. هذا المستحضر بيليه ثقافة الدم كما توفر عينة لتطبيقات المصب المباشرة الأخرى مثل تلطيخ غرام، واختبارات التشخيص الآلي PCR القائم مثل POCT-تقارير إنجاز المشروعات للكشف السريع للمقاومة للميثيسيلين Staphyloccocus العنقودية الذهبية (الجرثومة)، واختبار الحساسية للمضادات الحيوية مع أنظمة AST الآلي و / أو عن طريق القرص المقايسات نشر على لوحات أجار (الشكل 3). في هذا العمل، نحن تصف الخطوات المختلفة لإعداد بيليه البكتيرية ثقافة الدم كما أوضح Prod&#39;hom وآخرون 15 (الشكل 4). ونحن أيضا إلغاءالكاتب البروتوكولات لثلاثة من التطبيقات الرئيسية التي يمكن القيام بها على بيليه ثقافة الدم: تحديد بواسطة MALDI-TOF 15، تحديد الهوية (ID) واختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) مع النظم الآلية 16 لالمعوية والعنقوديات وPCR- الآلي اختبار تشخيصي استنادا للكشف عن الجرثومة 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">20 needle gauge&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Terumo, Leuven, Belgium</td>
			<td style="width:239px;">NN-2038R</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">50 ml Falcon tube</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352070</td>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium chlorure</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>101145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>60340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>F0507</td>
			<td>Flammable, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>70990</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>271004</td>
			<td>Flammable, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>T6508</td>
			<td>Corrosive, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 60 instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27202</td>
			<td>automated microbial system instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-positive (GP) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21342</td>
			<td>automated GP&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-P580 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>22233</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-negative (GN) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21341</td>
			<td>automated GN&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-N242 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>413391</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Xpert MRSA</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>&#160;GXMRSA-100N-10</td>
			<td>nucleic acid amplification technology MRSA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">GeneXpert IV instrument</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>GXIV-4-D</td>
			<td>nucleic acid amplification technology instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microflex LT MALDI-TOF MS instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>BDAL microflex LT/SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MSP 96 target&#160; steel BC</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>280799</td>
			<td>MALDI target plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Densitometer Densicheck instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MALDI Sepsityper kit 50</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>8270170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mac Conkey agar</td>
			<td>Biolife, Milano, Italy</td>
			<td>4016702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Oxoid, Hampshire, England</td>
			<td>CM0337</td>
			<td>Mueller-Hinton agar (MH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHF agar</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>43901</td>
			<td>Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD columbia III agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254071</td>
			<td>blood agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD chocolate agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254089</td>
			<td>chocolate agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD schaedler agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254084</td>
			<td>Schaedler agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a blood culture pellet for rapid bacterial identification and antibiotic susceptibility testing

التهابات مجرى الدم والإنتان هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. نتائج ناجحة للمرضى الذين يعانون من تجرثم الدم تعتمد على التحديد السريع للجراثيم لتوجيه العلاج بالمضادات الحيوية المثلى. تحليل بقع غرام من ثقافة الدم إيجابية يمكن أن تتم بسرعة وبالفعل تؤثر بشكل كبير على نظام المضادات الحيوية. ومع ذلك، ما زالت هناك حاجة إلى تحديد دقيق للجراثيم لتحديد العلاج الأمثل المستهدفة. نقدم هنا البكتيرية إعداد بيليه بسيطة وسريعة من ثقافة الدم الإيجابية التي يمكن استخدامها كعينة لعدة تطبيقات المصب الأساسية مثل تحديد الهوية من جانب MALDI-TOF MS، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) من خلال القرص نشر الفحص الآلي أو أنظمة AST والتلقائية وفقا PCR-الاختبارات التشخيصية. أداء هذه الأنظمة تحديد وAST مختلفة تطبق مباشرة على كريات الدم البكتيرية الثقافة الاشتراكية جداmilar إلى الأداء التي تم الحصول عليها عادة من المستعمرات المعزولة نمت على لوحات أجار. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية ويقلل بشكل كبير من الوقت لتقرير كل من تحديد وAST. وهكذا، في أعقاب الثقافة الإيجابية الدم، وتحديد من قبل MALDI-TOF يمكن ذكرت في غضون اقل من 1 ساعة في حين أن نتائج AST AST الآلي من قبل أنظمة أو المقايسات نشر القرص ضمن 8 إلى 18 ساعة، على التوالي. وبالمثل، فإن نتائج الفحص السريع PCR القائم يمكن أن ترسل إلى الأطباء أقل من 2 ساعة في أعقاب تقرير لتجرثم الدم. معا، وتظهر هذه النتائج أن الإعداد السريع لبيليه البكتيرية ثقافة الدم لديه تأثير كبير على تحديد وقت وAST التحول وبالتالي على نتيجة ناجحة من المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.

في دراسة قام بها Prod&#39;hom وآخرون 15، وقد تم تحليل حبيبات البكتيرية التي حصلت عليها كلوريد الأمونيوم تحلل الطرد المركزي من 122 ثقافة الدم إيجابية من 78 مريضا بواسطة MALDI-TOF MS. من 122 ثقافة الدم إيجابية، 95 (77.9٪) تم التعرف بشكل صحيح على مستوى الأنواع واحدة (0.8٪) عند مستوى...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing at JoVE.com

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

A السريع البكتيرية إعداد بيليه من ثقافة الدم إيجابية يمكن استخدامها كعينة لتطبيقات مثل التعرف بواسطة MALDI-TOF، غرام تلطيخ، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية واختبار PCR القائم. النتائج التي يمكن أن ترسل بسرعة إلى الأطباء لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

preparation-blood-culture-pellet-for-rapid-bacterial-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.4K Views.  University Hospital Center and University of Lausanne.  A السريع البكتيرية إعداد بيليه من ثقافة الدم إيجابية يمكن استخدامها كعينة لتطبيقات مثل التعرف بواسطة MALDI-TOF، غرام تلطيخ، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية واختبار PCR القائم. النتائج التي يمكن أن ترسل بسرعة إلى الأطباء لتحسين نتائج المرضى ال...

Video: Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

بروتوكول لقاحات مرض السارس المؤتلف RBD المستندة : إعداد البروتين ، والكشف عن تطعيم الحيوانات تحييد

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin<em&gt; في المختبر</em&gt; حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...