אנו מודים לטכנאים של המעבדה בקטריולוגיה של מרכז בית החולים של האוניברסיטה של ​​לוזאן לעזרתם כדי ליישם את הטכניקות במעבדה.

פרוטוקול זה פותח ומאומתים הבא תהליכי המחקר ופיתוח וכללי אתיקה של המוסד שלנו לפני שמיושם ככלי שגרתי. .1 הכנת תרבות הדם בקטריאלי גלולה ידי נוהל כלוריד כדורית אדומה-lysing אמוניום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרבית דם חיובית לצנטריפוגה שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כובע תרבית דם. הוספת 70% אתנול בכובע של הבקבוק ולשרוף אותו. הערה: אל תבצע את הצעד הזה תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבקבוק לזרימה למינרית. לאסוף 5 מ&quot;ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תרבית דם בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל מכיל 45 מ&quot;ל של מים סטריליים (H 2 O) ולערבב את המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של גלולה חיידקי תרבית דם על ידי צנטריפוגה תמוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם XG ב 1000 ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמוve supernatant (המכיל בעיקר H 2 O ותאי דם) עם משאבת ואקום מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של אמוניום כלוריד תוצרת הבית lysing פתרון (0.15 M NH 4 Cl, 1 מ&quot;מ KHCO 3). לשבור את הכדור על ידי גירוד ועל ידי vortexing הצינור צנטריפוגות המדגם ב140 XG ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant שמכיל בעיקר תאי דם אדומים פסולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גלולה נותרה מדממת, resuspend גלולה ב2 מ&quot;ל של H סטרילי והמזוקק 2 0 עד lyse נוסף תאי דם אדומים שיורית ולשטוף את הכדור. צנטריפוגה המדגם ב140 XG 10 דקות ב RT וזורקים supernatant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב200 μl של H 2 O </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבות דם על תקשורת אגר סלקטיבי ולא סלקטיבי שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 1 מ&quot;ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1 טיפה של int תרבות הדםo ארבעה רבעים על אגר דם, אגר שוקולד, אגר McConkey ואגר Schaedler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C אגר הדם וצלחות אגר שוקולד באווירה 5% CO 2, אגר McConkey באווירה רגילה והצלחת אגר Schaedler בתנאים אנאירוביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב צמיחת חיידקים על מדיה שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה לטוהר חיידקים. </li></ol></li></ol> .2 זיהוי על ידי MALDI-TOF MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ישיר מגלולת הדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 μl של גלולה הדם על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי המדגם עם 1 μl 70% חומצה פורמית ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי המדגם עם 1 μl של מטריצת MALDI (רווי פתרון של α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה ב50% אצטוניטריל-2.5% חומצת trifluoroacetic) ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך MALניתוח DI-TOF MS עם מערכת MALDI-TOF MS כפי שתואר על ידי היצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ציון ההזדהות אינו חוקי, ברמת המין (למשל עם ציון &lt;2), לבצע הפקת חלבון של מדגם גלולה דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי לאחר מיצוי חלבון מגלולת תרבות דם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 20 μl של גלולה עם 1 מ&quot;ל של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב XG 13,000 עבור 2 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף 25 μl של 70% חומצה פורמית ו25 μl של אצטוניטריל 100% לגלולה. וורטקס במרץ לresuspend את כדורים. Resuspend כדורים קשים על ידי פירוקם עם טיפים פיפטה לפני vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב13,000 XG למשך 2 דקות ב RT. העברת 1 μl של supernatant (המכיל חלבונים המופקים) על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. המשך כמתואר ב2.1.2. </li></ol></li></ol> .3 בקטריאלי Identification ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה עם אוטומטית של מערכת מיקרוביאלית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת השעיה חיידקים לזיהוי חיידקים וAST עם מערכת חיידקים אוטומטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינור פלסטיק המכיל 3 מ&quot;ל של 0.45% פתרון NaCl סטרילי תואם למערכת החיידקים האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.45% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק &#39;פרלנד של 0.6-0.8. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer. הערה: הנפח של גלולה חיידקי תרבית הדם משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק &#39;פרלנד של 0.6-.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן כרטיסים האוטומטיים גראם חיובי (GP) או גראם שלילי (GN) לזיהוי וכרטיסי AST האוטומטיים לבדיקת רגישות מיקרוביאלית של חיידקי Cocci גראם חיובי וגראם השלילי כפי שתואר על ידי היצרן. הערה: identification עם GP או כרטיסי GN אינו מיושם אם ערך ציון הזדהות MALDI-TOF MS הוא&gt; 2. בדוק את טוהר של ההשעיה חיידקים על ידי subculturing ההשעיה חיידקים על אגר דם (GP וGN) וצלחות אגר MacConkey (GN). </li></ol> .4 אנטיביוטי רגישות בדיקה על ידי Assay דיפוזיה דיסק Assay דיפוזיה הדיסק מתואר על ידי הוועדה האירופית לבדיקת רגישות מיקרוביאלית (EUCAST, הגרסה 3.0, אפריל 2013, www.eucast.org). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת השעיה חיידקים לבצע בדיקת רגישות מיקרוביאלית על ידי assay דיפוזיה דיסק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שפופרת זכוכית המכילה 3 מ&quot;ל של .0.9% פתרון NaCl סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.9% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק &#39;פרלנד של 0.5. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer. הערה: הנפח של תרבות הדםגלולה חיידקים משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק &#39;פרלנד של 0.6-.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ההשעיה החיידקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה של השעיה חיידקים על גבי אגר Mueller-Hinton (MH) או אגר אורגניזמים אגר אנין Mueller-Hinton (MHF) (MH בתוספת 5% דם defibrinated סוס ו20 מ&quot;ג / L של dinucleotide אדנין β-Nicotinamide). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים מקלון צמר גפן סטרילי בהשעית החיידקים ולהסיר בעדינות את נוזלים עודפים על ידי הפיכת הספוגית על הקיר הפנימי של צינור הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את ההשעיה החיידקים באופן אחיד על כל פני השטח של הצלחת אגר MH / MHF על ידי שטיפה בשלושה כיוונים או באמצעות מסובב צלחת אוטומטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של דיסקים מיקרוביאלית על צלחות אגר מחוסנת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מקרוב הדיסקים על פני השטח של יבשות צלחות אגר מחוסנת באופן ידני או על ידי שימוש במתקן רגישות דיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על טמפה המתאימהrature ואווירה כפי שמתואר בשיטת דיפוזיה EUCAST דיסק בדיקת רגישות מיקרוביאלית (3.0 גרסה, אפריל 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> .5 האוטומטי PCR מבוסס בדיקת אבחון לאיתור של MRSA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette, להעביר 50 μl של גלולה תרבות דם לתוך הבקבוקון מגיב מדגם מסופק עם MRSA האוטומטי ערכת PCR מבוססת אבחון בדיקה ומערבולת במהלך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette 1 מ&quot;ל, לוותר המדגם ליציאת הדגימה של המחסנית. הכנס את המחסנית לתוך מערכת PCR האוטומטית ולהתחיל assay כפי שתואר על ידי היצרן. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study.">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li><li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States:+analysis+of+incidence,+outcome,+and+associated+costs+of+care.">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li><li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis+in+European+intensive+care+units+results+of+the+SOAP+study.">Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study.</a> Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).</li><li>Micek, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empiric+combination+antibiotic+therapy+is+associated+with+improved+outcome+against+sepsis+due+to+Gram-negative+bacteria+a+retrospective+analysis.">Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).</li><li>Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+importance+of+microbiological+findings+in+the+diagnosis+and+management+of+bloodstream+infections.">The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections.</a> Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).</li><li>Barenfanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+mortality+associated+with+prompt+Gram+staining+of+blood+cultures.">Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures.</a> American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).</li><li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection:+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management.">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study.">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li><li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+bacteria+from+BacT/ALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction.">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li><li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li><li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li><li>Croxatto, A., Prod&amp;34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems.">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets.">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system.">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li><li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management.">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li><li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients.">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li><li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae.">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בהשוואה לגישות אבחון תרבית דם החיובית קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים על ידי שימוש בגישת צנטריפוגה אמוניום כלוריד תמוגה לצמצם את הזמן לדווח זיהוי על ידי 16 עד 24 שעה והזמן לדווח AST ידי 24 עד 48 שעה (איורים 1 ו 3). ?...

זיהומים בדם ואלח דם בחולים מאושפזים הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. כך, תמותה הקשורים לזרם דם זיהומים הוא ציין ב% על 14 ל37% ממטופל מאושפז ועלולה להגביר 35% ביחידות לטיפול נמרצים לחולי 1-3. זיהוי המהיר של הגורם המדבק הוא מרכזי שינחה את טיפול מיקרוביאלית אופטימלי ולהגדיל את התוצאה המוצלחת של 4,5 טיפול האנטיביוטי. הניתוח המהיר של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יש כבר השפעה משמעותית על ההסתגלות של טיפול האנטיביוטי 6,7 אבל זיהוי מדויק של הגורם המדבק נדרש לספק הטיפול האנטיביוטי המותאם הטוב ביותר לחולים. למשל, משטרי טיפול אנטיביוטי שונים צריכים להיות מיושמים, לאחר בקטרמיה עם Enterococci וסטרפטוקוקוס שקשה להבחין על ידי צביעת גראם. באופן דומה, זיהוי במיני לבאל דרוש כדי לאתר enterobacteria השלילי גרם קידוד גן ampC כרומוזומליות מקנות התנגדות מוגברת לβ-lactams 8. עם תרבית דם חיובית, הגישה לאבחון הקונבנציונלית היא תת הגורם המדבק על צלחות אגר שונות, אשר דורש כמה שעות של זיהוי לפני דגירה נוספת עם גישות שונות, כוללים בדיקות ביוכימיות, צמיחה בתקשורת סלקטיבית שונה ומערכות זיהוי חיידקים אוטומטיות. הזמן לתוצאות של גישת אבחון קונבנציונלית הוא של כ 1 עד 3 ימים. הופעתה של טכנולוגית הלייזר desorption בסיוע מטריקס / ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסת יינון (MALDI-TOF) לזיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים סיפקה כלי חדש כדי לזהות במהירות מיקרואורגניזמים ממושבות גדלו על צלחות אגר אלא גם ישירות מהדם חיובי תרבויות (איור 1) 9-12. השימוש בדואר של MALDI-TOF לזהות גורם מזהם מתרביות דם צמצם באופן משמעותי את הזמן לתוצאות לכמה דקות במקום שעות וימים הנדרשים על ידי שיטות מסורתיות. כפי שנאמר על ידי Croxatto et al. 13, את היעילות של זיהוי MALDI-TOF מסתמכת על פרמטרים שונים כולל טוהר של מיקרואורגניזם וכמות. שני קריטריונים אלו מתקבלים בקלות ממושבות דיסקרטיות גדלו על צלחות אגר אבל נדרשו טיפול קדם אנליטיים להעשרת חיידקים וטיהור מדגימות מורכבות כגון תרבות דם, אשר מכילות מרכיבים תאיים וחלבון מרובים שעלולים להפריע לזיהוי MALDI-TOF. שיטות צנטריפוגה שיטות בידוד מיקרואורגניזמים שונים מתרבות דם כבר בשימוש במספר המחקרים כולל saponin או שיטת חומרי ניקוי עדין אחרת להפקת חיידקים 9,14, שיטה מפריד בסרום 10, תמוגה 12 </sעד&gt; ופתרונות מסחריים כגון ערכת sepsityper. המעבדה לאבחון בקטריולוגיה פיתחה הכנת גלולה חיידקים בדם תרבות פשוטה המבוססת על כדורית אדומה-תמוגה אמוניום כלוריד המאפשר זיהוי מהיר של חיידקים ושמרים על ידי MALDI-TOF ומערכות זיהוי אוטומטי (איור 2) 15. הכנת גלולה דם תרבות זו גם מספקת לדוגמה עבור יישומים במורד הזרם ישירים אחרים כגון צביעת גראם, בדיקות אבחון המבוססת על PCR אוטומטיים כגון POCT-PCRs לזיהוי המהיר של methicillin עמיד Staphyloccocus aureus (MRSA), ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה עם מערכות אוטומטיות AST ו / או על ידי מבחני דיפוזיה דיסק על צלחות אגר (איור 3). בעבודה זו, אנו מתארים את השלבים השונים של הכנת גלולה חיידקים בדם התרבות כפי שהוסבר על ידי Prod&#39;hom et al. 15 (איור 4). אנו גם דהסופר הפרוטוקולים עבור שלושה היישומים העיקריים שיכול להתבצע על גלולה תרבות דם: זיהוי על ידי 15 MALDI-TOF, זיהוי (ID) ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) עם המערכות האוטומטיות 16 לEnterobacteriaceae וstaphylococci וPCR- האוטומטי בדיקת אבחון המבוסס על זיהוי של MRSA 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">20 needle gauge&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Terumo, Leuven, Belgium</td>
			<td style="width:239px;">NN-2038R</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">50 ml Falcon tube</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352070</td>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium chlorure</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>101145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>60340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>F0507</td>
			<td>Flammable, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>70990</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>271004</td>
			<td>Flammable, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>T6508</td>
			<td>Corrosive, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 60 instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27202</td>
			<td>automated microbial system instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-positive (GP) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21342</td>
			<td>automated GP&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-P580 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>22233</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-negative (GN) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21341</td>
			<td>automated GN&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-N242 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>413391</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Xpert MRSA</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>&#160;GXMRSA-100N-10</td>
			<td>nucleic acid amplification technology MRSA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">GeneXpert IV instrument</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>GXIV-4-D</td>
			<td>nucleic acid amplification technology instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microflex LT MALDI-TOF MS instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>BDAL microflex LT/SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MSP 96 target&#160; steel BC</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>280799</td>
			<td>MALDI target plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Densitometer Densicheck instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MALDI Sepsityper kit 50</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>8270170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mac Conkey agar</td>
			<td>Biolife, Milano, Italy</td>
			<td>4016702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Oxoid, Hampshire, England</td>
			<td>CM0337</td>
			<td>Mueller-Hinton agar (MH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHF agar</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>43901</td>
			<td>Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD columbia III agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254071</td>
			<td>blood agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD chocolate agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254089</td>
			<td>chocolate agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD schaedler agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254084</td>
			<td>Schaedler agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a blood culture pellet for rapid bacterial identification and antibiotic susceptibility testing

זיהומים ואלח דם דם הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. התוצאה המוצלחת של חולים הסובלים מבקטרמיה תלויה בזיהוי מהיר של הגורם המדבק להנחות טיפול אנטיביוטי אופטימלי. הניתוח של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יכול להתנהל במהירות וכבר להשפיע על המשטר האנטיביוטי באופן משמעותי. עם זאת, זיהוי מדויק של הגורם המדבק עדיין יידרש לקבוע את הטיפול האופטימלי ממוקד. אנו מציגים כאן הכנת גלולה חיידקים פשוטה ומהירה מתרבית דם חיובית שיכול לשמש כדוגמה לכמה יישומים במורד הזרם חיוניים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF MS, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי assay דיפוזיה דיסק או מערכות AST אוטומטיות ועל ידי אוטומטי PCR מבוסס בדיקות אבחון. הביצועים של מערכות זיהוי וAST אלה שונים מיושמים ישירות על כדורי חיידקי תרבית הדם הוא מאוד siמילר לביצועים בדרך כלל מתקבל ממושבות מבודדות גדלו על צלחות אגר. בהשוואה לגישות קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן כדי לדווח על זיהוי שני וAST. לפיכך, החיוביות הבאה דם התרבות, זיהוי על ידי MALDI-TOF ניתן לדווח בתוך שעה פחות מ 1 ואילו תוצאות של AST ידי מערכות AST אוטומטיים או מבחני דיפוזיה הדיסק בתוך 8 עד 18 שעות, בהתאמה. באופן דומה, התוצאות של assay PCR מבוסס מהיר ניתן להעביר לרופאים פחות משעה 2 בעקבות הדו&quot;ח של בקטרמיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי ההכנה המהירה של גלולה חיידקי תרבית דם יש השפעה משמעותית על זמן זיהוי ותפנית AST ובכך על התוצאות המוצלחות של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

במחקר שבוצע על ידי Prod&#39;hom et al. 15, כדורי חיידקים המתקבלים על ידי צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד של 122 תרבות דם חיובית מ78 חולים נותחו על ידי MALDI-TOF MS. מתוך 122 תרבות דם חיובית, 95 (77.9%) זוהו בצורה נכונה, ברמת המין ואחד (0.8%) ברמת הסוג. 26 כדורי תרבות דם הנותרים (21.3%) לא נתנ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing at JoVE.com

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

preparation-blood-culture-pellet-for-rapid-bacterial-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.4K Views.  University Hospital Center and University of Lausanne.  הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם. 

Video: Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...