The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.

1. التعليمات العامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر aziridine العامل المساعد 6BAz (في DMSO) والبروتين MTase Set7 / 9 -80 ° C وجميع الكواشف الأخرى بما في ذلك العامل المساعد المزدوج تنشيط SeAdoYn وDNA MTase M.BseCI (في 50٪ الجلسرين) في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز 6BAz وSeAdoYn عن طريق الأشعة فوق البنفسجية / فيس التحليل الطيفي باستخدام معاملات الانقراض ε 269nm (6BAz) = 16،000 سم -1 -1 M وε 260nm (SeAdoYn) = 15،400 سم -1 M -1 في الماء منزوع الأيونات. تحديد تركيز MTases بواسطة الفحص برادفورد، أو إذا كان معامل الانقراض هو متاح، عبر امتصاص المباشر في 280 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في محاولة لتجنب خلق فقاعات من قبل pipetting المكثف أو vortexing للمنع فقدان نشاط انزيم. بدلا من ذلك، مزيج من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة العوامل المساعدة aziridine من الحلول الأسهم في DMSO تأكد من أن تركيز DMSO النهائية في الاختبار هو أقلمن 5٪. تشمل دائما 10 أيونات المغنيسيوم ملي في المخزن المؤقت فحص لمنع ردود الفعل غير محددة مع DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة العوامل المساعدة تنشيط مزدوجة من الحلول الأسهم الحمضية استخدام كميات صغيرة (حلول الأوراق المالية عالية التركيز) لتجنب التغييرات الرقم الهيدروجيني، وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الفحص لا تتغير بشكل ملحوظ. تجنب التجولات، على سبيل المثال، β المركابتويثانول أو dithiothreitol (DTT)، في المخزن المؤقت فحص لأنها يمكن أن تتداخل مع النقر رد فعل من جانب complexation من أيونات النحاس المطلوبة. </li></ol> 2. خطوة واحدة وصفها من الحمض النووي عبر Aziridine العوامل المساعدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل محدد الناتج عن ناقلة ميثيل تسمية جي (يبتسم) من DNA البلازميد مع M.BseCI DNA MTase وaziridine العامل المساعد 6BAz. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الحل العامل المساعد في 20 ° C وإعداد الخلائط رد فعل على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى فحص أداء عنصر تحكم &quot;العامل المساعد&quot;، لتصور أي تعديلات محددة غير، و&amp; #8220؛ انزيم &quot;السيطرة، للتأكد من أن إعداد MTase نقدمه مجانا من AdoMet العامل المساعد الطبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيج فحص 2 ميكرولتر من 10X عازلة التعديل (التي تحتوي على 100 ​​ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي MgCl 2، 20 ملم β المركابتويثانول، ودرجة الحموضة 7.4)، 2 ميكرولتر من pBR322 (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر)، و 10 مكافئ. M.BseCI في تسلسل الاعتراف على الحمض النووي (تسلسل 1 الاعتراف في pBR322) والعامل المساعد aziridine 6BAz إلى تركيز النهائي من 60 ميكرومتر ضمن الحجم الكلي لل20 ميكرولتر. إضافة العامل المساعد وDNA MTase الماضي. ملاحظة: β المركابتويثانول سامة، أكالة وضررا للبيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل السيطرة &quot;العامل المساعد&quot; إضافة الماء منزوع الأيونات بدلا من M.BseCI ول &quot;إنزيم&quot; السيطرة يضاف الماء منزوع الأيونات بدلا من 6BAz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحلول من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنابيب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييد للتعديل فحص للتحقق من تعديل DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عن طريق خلط 10 ميكرولتر 10X R.TaqI عازلة (التي تحتوي على 100 ​​ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 ملي MgCl 2، 1 M كلوريد الصوديوم، 1 ملغ / مل الزلال البقري مصل، ودرجة الحموضة 8.0)، و 80 ميكرولتر الماء منزوع الأيونات و 3.3 ميكرولتر من تقييد نوكلياز داخلية (REase) من مستحرة مائية (R.TaqI، 10 U / ميكرولتر). تأكد من إضافة REase في الخطوة الأخيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل أنبوب من 2.1.7 إضافة 2 ميكرولتر من 10X R. تقي العازلة و 28 ميكرولتر من الحل من فوق (2.2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحلول من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنابيب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول Electromobility فحص (EMSA) مع streptavidin للتحقق من تعديل وظيفي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 25 ميكرولتر من كل أنبوب (2.2.5) وإضافة 2.4 ميكرولتر من حل streptavidin (1 ملم فيما يتعلق streptavidin مonomer في المخزن streptavidin تحتوي على 100 ​​ملي نا 2 هبو 4، 100 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5. 4 حكمه من إجمالي البيوتين). إضافة 2.4 ميكرولتر من العازلة streptavidin للأنابيب المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عبر agarose هلام الكهربائي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 6X تحميل (0.25٪ برموفينول الأزرق، و 30٪ الجلسرين) إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من حلول بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في آبار من agarose هلام (1٪ الاغاروز في المخزن 0.5X TBE تحتوي على 1X GelRed من حل 10،000x الأسهم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام في 0.5X عازلة TBE مع 80 V تقريبا. 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور العصابات DNA على طاولة الأشعة فوق البنفسجية (312 نانومتر) مع كاميرا CCD مجهزة فلتر (540 ± 50 نانومتر). ملاحظة: ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتضر العينين والجلد. </li></ol></li></ol> 3. اثنين من خطوة وصفها البروتين عن طريق العوامل المساعدة المنشط مزدوجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Methyltransfنقل المجموعات المنشط (mTAG) مع Set7 / 9 والعامل المساعد المزدوج تنشيط SeAdoYn لهيستون H3 يسين 4 وضع العلامات (خطوة التعديل) محو الموجه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد مكونات وتحضير مخاليط رد فعل على الجليد. ملاحظة: دائما نأخذ تبريد SeAdoYn لتجنب تدهور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى فحص أداء عنصر تحكم &quot;العامل المساعد&quot;، لتصور أي تعديلات غير محددة، و &quot;إنزيم&quot; السيطرة، لاستبعاد ردود فعل غير محددة لجنة التحقيق الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الفحص (20 ميكرولتر) التي تحتوي على عازلة التعديل (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 5٪ الجلسرين، ودرجة الحموضة 8.5)، و 10 ميكرومتر هيستون H3، 10 ميكرومتر Set7 / 9 و 600 ميكرومتر SeAdoYn (خليط من كلا epimers في السيلينيوم). في الخطوات الأخيرة إضافة العامل المساعد ثم MTase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل السيطرة &quot;العامل المساعد&quot; إعداد حل الفحص كما في 3.1.3 وإضافة 60 ملي AdoMet للتنافس مع العامل المساعد الاصطناعية. من أجل السيطرة &quot;إنزيم&quot; إضافة الماء منزوع الأيونات بدلا من SeAdoYn.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحلول من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا. تحقق من درجة الحموضة بإضافة 1 ميكرولتر من كل حل لمجال العلوي من شريط الأس الهيدروجيني (الحموضة مجموعة من 5 - 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هلام وفي الوقت نفسه إعداد 12٪ SDS بولي أكريلاميد هلام (تشغيل: 357 ملم مكرر تريس درجة الحموضة 6،5-6،8، 0.1٪ (ث / ت) وكالة الأنباء الجزائرية، 0.04٪ (ت / ت) TEMED و 12٪ مادة الأكريلاميد / bisacrylamide 37.5: 1 ، هلام التحميل: 357 ملم مكرر تريس درجة الحموضة 6،5-6،8، 0.1٪ (ث / ت) وكالة الأنباء الجزائرية، 0.04٪ (ت / ت) TEMED و 5٪ الأكريلاميد / bisacrylamide 37.5: 1). ملاحظة: الأكريلاميد / bisacrylamide هي سامة والصحة خطرة. ارتداء القفازات أثناء هذا الإجراء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلامات الكيميائي ليسين alkinylated 4 في هيستون H3 عبر المحفز النحاس وأزيد آلكاين الإضافة الحلقية (CuAAC) (الخطوة التوسيم). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل نهاية التفاعل تعديل إعداد 5X انقر مزيج تحتوي على 3 مم كبريتات النحاس 4، 3 ملي تريس (3-هيدروكسي-triazolylmethyl) أمين (THPTA)، 250 ملي أسكوربات الصوديوم و 6 ملي طمرة أزيد معالحجم الكلي لل20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من الطازجة 5X فوق المزيج إلى كل أنبوب لبدء CuAAC وإخماد رد فعل التعديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية جميع الأنابيب مع رقائق الألومنيوم من الضوء لتجنب الصورة تبيض من fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هطول الأمطار البروتين لإزالة الزائدة حرية طمرة fluorophore. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب التألق من الفلورسنت المسمى هيستون H3 التي كتبها المكثف مضان في جل حرية طمرة fluorophore، وإزالة fluorophore الزائدة من قبل هطول الأمطار من البروتينات (3.3.2 - 3.3.4) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 75 ميكرولتر الميثانول، 18.8 ميكرولتر الكلوروفورم و 50 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء إلى كل أنبوب ودوامة لفترة وجيزة بعد كل إضافة. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة المرحلة العليا من دون إزعاج طبقة اجهة، والتي تحتوي على البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 56.3 ميكرولتر الميثانول إلى المرحلة المتبقية طن كل أنبوب، دوامة والطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير البروتين. إزالة طاف. كرر هذه الخطوة لغسل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية أنابيب مفتوحة بمنديل الخالي من الوبر والسماح لهم الجافة لمدة 15 - 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل عبر SDS PAGE. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل البروتينات عجلت من 3.3.4 في 20 ميكرولتر SDS العازلة تحميل (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 2.5٪ (ث / ت) SDS، 10٪ (ت / ت) الجلسرين، 320 ملم β المركابتويثانول و 0.05٪ (وزن / ت) برموفينول الأزرق، ودرجة الحموضة 6.8). تأكد بحل تماما بيليه وذلك بدهن جدران الأنابيب مع ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والسماح لهم يبرد إلى 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل كامل المبلغ من كل عينة في آبار من هلام بولي أكريلاميد SDS (3.1.7). استخدام 50 ملي اجتماعات الأطراف، 50 ملي تريس-X (تريس قاعدة)، و 5 ملي EDTA، 0.1٪ (ث / ت) SDS كما يعمل عازلة للالكهربي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تشغيل هلام مع 120 V تقريبا. 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور مضان في جل على طاولة الأشعة فوق البنفسجية (312 نانومتر) مع كاميرا CCD مجهزة فلتر (540 نانومتر ± 50 نانومتر). ملاحظة: ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتضر العينين والجلد. </li></ol></li></ol>

The authors disclose the following competing financial interest: E.W. is inventor on related patents.

وضع العلامات من خطوة واحدة من الحمض النووي DNA مع MTases والعوامل المساعدة aziridine (DNA يبتسم) هو وسيلة قوية ولكن ينبغي النظر في بعض الجوانب عند التخطيط للتجربة. العامل المساعد Aziridine: وكان تركيز 6BAz لوضع العلامات DNA مع M.BseCI 60 ميكرومتر. ع?...

وضع العلامات معين من الأحماض النووية والبروتينات 1،2 3،4 هو من مصلحة كبيرة للالأوصاف الوظيفية، والتشخيص الطبي و(نانو) التكنولوجيا الحيوية. هنا نقدم طريقة وضع العلامات الأنزيمي لهذه البوليمرات الحيوية التي تقوم على أساس S -adenosyl-L-ميثيونين (AdoMet أو SAM) ميثيل معتمد على (MTases). هذه الفئة من الأنزيمات (EC 2.1.1.) تستهدف مواقع أليفة النواة الفردية (النيتروجين، والأكسجين والكبريت وذرات الكربون) داخل بقايا معينة من الأحماض النووية والبروتينات وبطبيعة الحال ينقل مجموعة الميثيل تفعيلها من AdoMet العامل المساعد (الشكل 1A) 5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن MTases الاستفادة من نظائرها العامل المساعد الاصطناعية لوضع العلامات المحددة مع بطاقة تقارب، fluorophores أو تسميات أخرى (الشكل 1B) 6. وقد وضعت فئتين من نظائرها AdoMet: العوامل المساعدة Aziridine لS equence محددة M ethyltransferase- I </strong&gt; nduced L هابيل جي (يبتسم) 7 ومزدوجة نظائرها AdoMet تفعيلها للم الموجه ethyltransferase T ransfer من A ctivated roups G (mTAG) 8. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" width="700" /> الشكل 1: ردود الفعل يحفزه ميثيل (MTases) A. الميثيل نقل مجموعة من العامل المساعد الطبيعي AdoMet (SAM) إلى ركائز مختلفة بما في ذلك DNA، RNA والبروتينات والجزيئات الحيوية صغيرة B. وصفها / functionalization من الأحماض النووية والبروتينات (NNNNN =. أزواج قاعدة لDNA، RNA النيوكليوتيدات لوالأحماض الأمينية للبروتينات، XXXXX = تسلسل الاعتراف MTase مع بقايا الهدف باللون الأخضر) مع نظائرها العامل المساعد الاصطناعية. العوامل المساعدة Aziridine تحتوي على مجموعة مراسل (المجال الأزرق)تعلق على عصابة الأدينين هي تسلسل جانب تحديدا مع بقايا الهدف (يسار) ومزدوجة تنشيط نظائرها AdoMet تؤدي إلى نقل سلاسل ألكيل بمد يحمل مراسل الكيميائية Y (يمين) والتي يمكن أن توصف عن طريق النقر رد فعل bioorthogonal في الخطوة الثانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> العوامل المساعدة Aziridine تعمل بشكل أفضل مع MTases DNA. أنها تحتوي على حلقة membered ثلاثة مع ذرة النيتروجين 9 (أو N -mustard 10،11) بدلا من مركز sulfonium مجموعة رد الفعل كما. إضافة بروتون من هذا ذرة النيتروجين ينشط حلقة aziridine لهجوم أليف النواة من قبل النوكليوتيدات الهدف الذي يؤدي إلى اقتران التساهمية من العامل المساعد كله مع DNA. عن طريق ربط مجموعات المراسل إلى حلقة الأدينين والعوامل المساعدة aziridine يمكن استخدامها في تركيبة مع MTases DNA لتسمية DNA في خطوة واحدة ( <stron<html> ز&gt; الشكل 1B، يسار) 7،12. ويتجلى هذا في التفاصيل لbiotinylation من الحمض النووي مع 6BAz 13-15 (aziridine العامل المساعد مع البيوتين تعلق على موقف 6 من عصابة الأدينين) والأدينين محددة DNA MTase من عصوية دهنية أليفة الحرارة (M.BseCI) 16 (الشكل 2، انظر القسم بروتوكول 2: وضع العلامات خطوة واحدة من الحمض النووي عبر aziridine العوامل المساعدة). بالإضافة إلى M.BseCI (&#39;تسلسل الاعتراف، وMTases DNA من مستحرة مائية (M.TaqI، 5&#39;-TCG A -3 5&#39;-ATCG A T-3)&#39;)، من المستدمية heamolyticus (M.HhaI، 5 &quot;-G C GC-3 &#39;) ومن Spiroplasma (M.SssI، وقد استخدمت 5&#39;- C G-3&#39;) بنجاح لbiotinylate DNA مع 6BAz 17. وعلاوة على ذلك، العوامل المساعدة aziridine يمكن استخدام لخطوة واحدة وضع العلامات DNA مضان 18،19. ontent &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" width="700" /> الشكل 2: تسلسل محدد من خطوة واحدة biotinylation من الحمض النووي مع M.BseCI و6BAz تعترف DNA MTase M.BseCI تسلسل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل 5&#39;-ATCG A T-3 &quot;وبطبيعة الحال methylates المجموعة الأمينية من الأدينين الثاني بقايا (الأخضر) باستخدام AdoMet. مع العامل المساعد aziridine 6BAz يتم تغيير مسار رد الفعل وM.BseCI يؤدي إلى تسلسل الحمض النووي biotinylation معين عن طريق اقتران العامل المساعد كله بما في ذلك البيوتين (الأزرق) مع الأدينين الهدف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> مزدوجة نظائرها AdoMet تنشيط تحتوي على تمديد السلاسل الجانبية غير المشبعة بدلا من مجموعة الميثيل في مركز sulfonium (الشكل 1B </stronز&gt;، أليس كذلك) 20. الرابطة المزدوجة أو الثلاثية غير المشبعة في β-موقف لمركز sulfonium يعوض إلكترونيا الآثار الفراغية غير المواتية داخل الدولة الانتقالية لتحقيق الاستقرار اقترانية. نظرا لأن كلا من مركز sulfonium والسندات غير المشبعة تفعيل الجانب سلسلة لنقل الأنزيمية، تم تسمية هذه العوامل المساعدة نظائرها AdoMet تنشيط نقرا مزدوجا. عادة، يتم استخدامها لنقل سلاسل جنب مع مجموعة فريدة الكيميائية (للصحفيين) الكيميائية، مثل مجموعات الأمينية، آلكاين وأزيد، لوضع العلامات الكيماوي انتقائية في الخطوة الثانية 8،21. بشكل عام، يمكن أن تتضاعف تنشيط نظائرها AdoMet ليس فقط وظيفة العوامل المساعدة لDNA MTases 8،20،21 ولكن أيضا لRNA MTases 22،23 وMTases البروتين 24 - 28 يسمح وضع العلامات إضافية من RNA والبروتينات. ومع ذلك، فإن السلاسل الجانبية الممتدة هي sterically أكثر تطلبا من مجموعة الميثيل وتوسيع المواقع المفعلة MTase بواسطة بروتين الهندسة هو الغفور الرحيمأون المطلوبة للحصول على معدلات نقل فعالة. حل آخر لهذه المشكلة هو استخدام التناظرية AdoMet مع مجموعة صغيرة propargyl (ثلاثة الكربونات) حيث يخدم آلكاين محطة وظيفتين: 1. لتحقيق الاستقرار في الحالة الانتقالية خلال نقل الأنزيمية و2. التعامل مع رد الفعل لمتابعة التعديلات الكيميائية نحاسية المحفزة أزيد آلكاين الإضافة الحلقية (CuAAC) انقر الكيمياء. واتضح أن الناتج propargylic AdoMet التناظرية 29 غير مستقر تماما في ظل ظروف محايدة أو الأساسية قليلا وفقط من الاستخدام المحدود. هذا العيب يمكن أن تكون ثابتة عن طريق استبدال ذرة الكبريت مع السيلينيوم. مما أدى العامل المساعد 5 &#39;- [(سي) [(3 S) -3-الأمينية-3-carboxypropyl] دعامة-2-ynylselenonio] -5&#39;-deoxyadenosine (SeAdoYn، الشكل 3) وقبلها البرية من نوع DNA، RNA وMTases بروتين 30-32 التي تلغي الحاجة للهندسة البروتين في كثير من الحالات. وهذا يتجسد من مضان الموالية<html> وضع العلامات البروتين مع يسين هيستون H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (الشكل 3، انظر القسم بروتوكول 3: خطوتين وضع العلامات البروتين عن طريق تنشيط العوامل المساعدة مزدوجة). <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig3highres.jpg" width="700" /> الشكل (3): من خطوتين وضع العلامات مضان تسلسل محدد من هيستون H3 مع Set7 / 9، SeAdoYn وطمرة أزيد البروتين MTase Set7 / 9 طبيعيا methylates المجموعة الأمينية يسين 4 في H3 هيستون (H3K4 والأخضر) باستخدام AdoMet. مع العامل المساعد المزدوج تنشيط SeAdoYn في MTase نقل مجموعة propargyl صغيرة (أحمر) إلى بقايا يسين. ثم يتم تعديل رابطة ثلاثية محطة تعلق بشكل انتقائي في bioorthogonal نقرة رد فعل (المحفز النحاس وأزيد آلكاين الإضافة الحلقية، CuAAC) مع أزيد derivatized طمرة (tetramethylrhodamine والأزرق) fluorophore.تحميل / 52014 / 52014fig3highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">6BAz</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10304980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Bis-Tris</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Boric acid</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Bromophenol blue Na salt</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right">15375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:139px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Chloroform</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right">10020090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Coomassie Brilliant Blue</td>
			<td style="width:139px;">Serva</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">EDTA disodium salt</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">GelRed (10000x in water)</td>
			<td style="width:139px;">Biotium</td>
			<td align="right" style="width:119px;">41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Glycerol (99.5%)</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">FastRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SM1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Histone H3</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">M.BseCI</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Methanol</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10675112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Magnesiumchloride&#160; hexahydrate</td>
			<td style="width:139px;">J.T. Baker</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">MOPS</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">pH strip (Neutralit)</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1,095,330,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">pBR322</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SD0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">R.TaqI (10u/&#181;l)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td>ER0671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">SeAdoYn</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Set7/9</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">SDS Granular</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">di-Sodiumhydrogenphosphat</td>
			<td style="width:139px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106,586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TAMRA-azide</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TaqI buffer (10x)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:245px;">N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:139px;">Acros Organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">42058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Tris-X (TRIS-base)</td>
			<td style="width:139px;">Gerbu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">762342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific labeling of nucleic acids and proteins with methyltransferases and cofactor analogues

S -Adenosyl-L-ميثيونين (AdoMet أو SAM) ميثيل معتمد على (MTase) تحفز نقل مجموعة الميثيل تفعيلها من AdoMet إلى مواقع محددة في DNA، RNA والبروتينات والجزيئات الحيوية الصغيرة. يمكن توسيع هذا رد فعل مثيلة الطبيعي لمجموعة واسعة من ردود الفعل الألكلة باستخدام نظائرها العامل المساعد الاصطناعية. استبدال مركز sulfonium رد الفعل من AdoMet مع حلقة aziridine يؤدي إلى العوامل المساعدة التي يمكن أن يقترن مع الحمض النووي DNA من قبل MTases المختلفة. يمكن تجهيز هذه العوامل المساعدة aziridine مع جماعات مراسل في مواقع مختلفة من شاردة الأدينين واستخدامها لS M equence محددة ethyltransferase- I nduced جي L هابيل من الحمض النووي (DNA يبتسم). وكمثال نموذجي نعطي بروتوكول للbiotinylation من DNA البلازميد pBR322 في التسلسل 5&#39;-ATCG A T-3 &quot;مع DNA MTase M.BseCI والعامل المساعد aziridine 6BAz فيخطوة واحدة. تمديد مجموعة الميثيل تفعيلها مع غير المشبعة النتائج الألكيل في فئة أخرى من نظائرها AdoMet التي تستخدم لم الموجه ethyltransferase T ransfer من A roups G ctivated (mTAG). منذ يتم تنشيط الجانب سلاسل طويلة من قبل مركز sulfonium والسندات غير المشبعة، وتسمى هذه العوامل المساعدة نظائرها AdoMet تنشيط نقرا مزدوجا. هذه نظائرها وظيفة ليس فقط باعتبارها العوامل المساعدة لMTases DNA، مثل العوامل المساعدة aziridine، ولكن أيضا لRNA والبروتين وMTases جزيء صغير. وعادة ما يتم استخدامها لتعديل الأنزيمية من ركائز MTase مع المجموعات الوظيفية الفريدة التي وصفت مع جماعات مراسل في خطوة الكيميائية الثانية. ويتمثل هذا في بروتوكول لوضع العلامات مضان من البروتين هيستون H3. يتم نقل مجموعة propargyl صغيرة من SeAdoYn العامل المساعد التناظرية إلى البروتين بواسطة يسين هيستون H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 تليها بنقرة وضع العلامات للalkynylated H3 هيستون مع طمرة أزيد. وضع العلامات MTase بوساطة مع نظائرها العامل المساعد هو عبارة عن تقنية تمكن للعديد من التطبيقات المثيرة بما في ذلك تحديد ودراسة وظيفية من ركائز MTase فضلا عن التنميط الجيني DNA وكشف الحامض.

خطوة واحدة وصفها من الحمض النووي عبر Aziridine العوامل المساعدة ويتم هذا التفاعل سبيل المثال بها مع DNA MTase M.BseCI، الذي يعدل بقايا الأدينين الثانية ضمن 5&#39;-ATCG A T-3 &quot;تسلسل المزدوج تقطعت بهم السبل، ولها موقع اعتراف واحد على ...

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues at JoVE.com

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

وصفت DNA والبروتينات تسلسل تحديدا مع تقارب أو مجموعات مراسل الفلورسنت باستخدام الحمض النووي أو البروتين ميثيل ونظائرها العامل المساعد الاصطناعية. اعتمادا على خصوصية العامل المساعد للأنزيمات، aziridine أو مزدوجة نظائرها العامل المساعد تنشيط يعملون لواحد أو اثنين من خطوة وصفها.

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

sequence-specific-labeling-nucleic-acids-proteins-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  RWTH Aachen University.  وصفت DNA والبروتينات تسلسل تحديدا مع تقارب أو مجموعات مراسل الفلورسنت باستخدام الحمض النووي أو البروتين ميثيل ونظائرها العامل المساعد الاصطناعية. اعتمادا على خصوصية العامل المساعد للأنزيمات، aziridine أو مزدوجة نظائرها العامل المساعد تنشيط ي...

Video: Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

مناعي الكشف عن النظائر ثيميدين الثاني (CldU وإيدو) في الأنسجة الابتدائية

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

دراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات الغشاء في الموقع مع الموقع الموجه وصفها الإسفار

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال 13 C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...