هناك أكثر من 100 تعديل متميز للرنا، ثلثاها ميثيلات. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحليل حساس ودقيق لنشاط كاتب الميثيل RNA. هذه التقنية سهلة الاستخدام تسمح لنا بتحديد وقياس الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، التي عادة ما تكون عرضة للتحف.
(إنّها ستُظهر الإجراء ستكون (سامانثا شيلتون طالبة خرّج من مختبري لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد مقايسة RNA ميثيلtransferase ذات 100 ميكرولتر في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد، كما هو مبين في بروتوكول النص. دوامة أنبوب لخلط دقيق، والطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس ثوان لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم، قم بتنظيف التفاعل باستخدام تنقية العمود، كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء عدد التلألؤ السائل، قم بإعداد رف العد المتألق مع قارورة واحدة لكل عينة، وقارورة واحدة لقياس الخلفية، وقارورة واحدة لاختبار السحب.
ملء قوارير مع خمسة ملليلتر من التلألؤ عد الحل. إضافة 10 ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي الريبي المشعة في قارورة واحدة. شد الغطاء، واخلطه بلطف.
لتحضير قارورة الاختبار، فرك مسحات القطن بدقة على جميع الأسطح والمعدات المستخدمة أثناء الإجراء. إضافة هذه المسحات إلى قوارير مليئة حل التلألؤ، وتشديد الغطاء. لتشغيل العينات على عداد التلألؤ، افتح غطاء مضادة، أدخل الحامل في الجهاز، واغلق غطاء المحرك.
حدد عد حامل مفرد. اختر تحديد برنامج المستخدم. حدد أو أنشئ برنامجًا يقيس التريتيوم لمدة 60 ثانية، واضرب رف العد.
كرر العد التلألؤ ثلاث مرات. بعد ذلك، أعد وإعادة تشغيل هلام بولي أكريلاميد اليوريا، كما هو مبين في بروتوكول النص. نقل 20 ميكرولترات من مادة الحمض النووي الريبي المشعة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولترات من 2X هلام تحميل العازلة.
بعد إعداد السلم، احتضان العينات في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل آبار هلام مرة أخرى على الفور قبل تحميل العينة عن طريق الأنابيب العازلة من خزانات هلام إلى أسفل في آبار الجل. ثم، تحميل 20 ميكرولترات من سلم المعدة، 20 ميكرولترات من العينات، و 20 ميكرولترات من 1X هلام تحميل العازلة في الممرات من هلام.
تشغيل الجل في 100 فولت لمدة 60 إلى 180 دقيقة، اعتمادا على نسبة البولي أكريلاميد. بمجرد الانتهاء من تشغيل الجل ، قم بإزالة الجل من الكاسيت وضعه في صندوق يحتوي على 50 ملليلتر من 1X TBE buffer مع خمسة ميكرولترات من وصمة هلام حمض نووي شديدة الحساسية. احتضان على الروك لمدة خمس دقائق لطخة الجيش الملكي النيبالي.
بعد هذا، بعناية تأخذ هلام من منطقة الجزاء، ووضعها على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية من هلام التصوير مع الآبار صعودا وسلم على اليسار. ركّز الكاميرا على الجل، واشعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية، واصطُل صورة للهلام. ثم، إيقاف التعرض للأشعة فوق البنفسجية، وحفظ الصورة كملف TIFF.
وضع هلام مرة أخرى في منطقة الجزاء، وإزالة TBE، وإصلاح هلام مع 50 ملليلتر من حل إصلاح على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحريك الجل بلطف إلى صندوق أسود جديد يحتوي على 25 ملليلتر من محلول تعزيز التصوير التلقائي. احتضان على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
رفع بلطف هلام، ووضعها وجها إلى أسفل على ورقة من البلاستيك التفاف مع الآبار صعودا وسلم على الجانب الأيمن. ضع ورقتين من ورق الكروماتوغرافيا على الجزء الخلفي من الجل، وقلب المكدس بأكمله. قبل تسخين مجفف هلام إلى 80 درجة مئوية.
نقل الغطاء البلاستيكي على مجفف هلام مرة أخرى. إدراج المكدس بأكمله تحت الغطاء البلاستيكي، ونقل الغطاء البلاستيكي إلى أسفل لإنشاء ختم. جفف الجل عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ثم، إيقاف المجفف هلام، وإزالة المكدس بلطف. قم بإزالة ورق اللتفاف وورق اللوني الثاني. الشريط ورقة الكروماتوغرافيا المتبقية مع هلام المجففة في شريط فيديو تلقائي.
في غرفة مظلمة، إضافة ورقة واحدة من فيلم التصوير الذاتي. تخزين الكاسيت في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية، وتطوير الفيلم في الوقت المناسب، اعتمادا على كثافة الإشارة. بمجرد تطوير الفيلم، وضعه على رأس الكاسيت واستخدام علامة مختبر لوضع علامة بعناية على أربعة حواف من هلام، كل بئر، وموقف الأصباغ XC وBB.
مسح الفيلم بدقة 300 أو 600 بكسل في البوصة، وحفظ الصورة كملف TIFF. في هذه الدراسة، هو واضح فحص خالية من الأجسام المضادة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase. وهناك تشغيل نموذجي من رد فعل النسخ في المختبر مع البوليميراز T7 RNA من 7SK الحمض النووي الصغير يظهر الجيش الملكي النيبالي قصيرة نسبيا وعالية الهيكلة.
هناك عدة نطاقات غير مرغوب فيها، سواء أقصر أو أطول من 7SK، ربما ينتج عن بدء النسخ أو إنهاء الأحداث العشوائية. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر المهم للحصول على عينة RNA نظيفة. عند هذه النقطة، يمكن تحديد الجيش الملكي النيبالي من الفائدة من موقعها بالنسبة إلى سلم وتنقيتها تنقية هلام.
يظهر هنا تحليل ميثيل ترانسفيراز RNA ممثل باستخدام الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي الموصى به وتركيزات البروتين. هذا الفحص يسمح لكل من النتائج الكمية من التهم التلألؤ، فضلا عن النتائج النوعية من autoradiogram. هنا، يظهر ميثيل RNA ميثيل ترانسفيراز المعروف لميثيلات 7SK لتكون قادرة على ميثيلات U6 أيضا. وعلاوة على ذلك، كما هو مبين مؤخرا ل7SK، ربط هيستون H4 إلى MePCE يمنع أيضا ميثيل U6.
ويمكن ملاحظة ذلك في كل من عدد التلألؤ وraradiogram، مما يدل على قوة هذا البروتوكول. رنا عرضة للتدهور، لذا يرجى التأكد من استخدام الكواشف الخالية من RNase وتنظيف جميع الأسطح والمعدات بشكل شامل. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع الذي تم الحصول عليه من مقايسة الميثيل ترانسفيراز هذه مباشرة لتقييم نشاط الحمض النووي الريبي أو نشاط الربط الحمض النووي الريبي بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربائية، على سبيل المثال.
هذه الطريقة تسمح للباحثين لاختبار تأثير عوامل مختلفة على نشاط الحمض النووي الريبي ميثيلtransferase، بما في ذلك الطفرات نقطة وعلاجات مثبطات الجزيء الصغيرة. وتستخدم هذه الطريقة مواد مشعة، لذا تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وأن تكون حذراً أثناء مناولة المواد المشعة والتخلص منها.
