We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.

1. Preparação Probe <ol><li> Obter vários oligonucleotídeos únicas em Xist (oligonucleotídeos 20-30 nucleotídeos de comprimento, 63-65 ºC de temperatura de fusão, a Tabela 1) com uma modificação 5&#39;-amino e suspender em água. </li><li> Piscina quantidades equimolares de oligonucleotídeos com 5&#39;-amino modificação (total 4,5 g) e etiqueta com corante fluorescente amino-reactivo seguindo as instruções do fabricante. <ol><li> Dissolve-se os oligonucleótidos reunidos no final de 5 ul de água isenta de nuclease e adicionar 3 mL de 1 M de bicarbonato de sódio à solução de oligonucleótido. </li><li> Adicionar 2 mL de DMSO para o frasco de corante e vortex brevemente reactivo com amina. </li><li> Misturar a solução de oligonucleótido com o corante reactivo em DMSO e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. </li></ol></li><li> Purifica-se as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência por coluna G-25 seguido de precipitação com etanol. <ol><li&gt; Centrífuga coluna G-25 a 750 xg durante 1 min para remover o excesso de tampão de armazenamento. </li><li> Adicionar 40 ul livre de nuclease de água à mistura de rotulagem produzido no Passo 1.2.3 e aplicar à coluna de G-25. Centrifugar a 750 xg por 2 min. </li><li> Adicionar 50 ul de água livre de nuclease, 10 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 250 ul de etanol a sonda purificada a partir do passo 1.3.2. Armazenar a -80 ° C durante 30 min e centrifuga-se a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar os oligonucleótidos precipitados uma vez com 1 ml de etanol a 70%. </li><li> Re-suspender em 50 ul de água isenta de nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para uma concentração final de aproximadamente 10 pM. </li></ol></li><li> Dilui-se as sondas de oligonucleótidos marcados com fluorescência para uma concentração final de 250 nM com tampão de hibridação (formamida a 10%; 2 x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sódio 30 mM], 2 mg / ml de BSA, 10% de sulfato de dextrano). NOTA: Com este protocolo FISH rápida, oligonucleotídeo pmantos de Xist foram concebidos e utilizados com uma concentração mais elevada do que o protocolo normal de FISH utilizando sondas oligonucleotídicas, a fim de encurtar o tempo de incubação para a hibridação. </li></ol> 2. Deslize Preparação NOTA: As lâminas podem ser preparados para imuno-FISH utilizando o rato-tronco embrionárias (ES) ou corpo embryoid (EB) diferenciação de células 20, 21 ou por cultivá-las diretamente em um slide tratados com poli-lisina ou usando cytospin com suspensão de células. Aqui, preparação da lâmina por cytospin é mostrado. <ol><li> Aspirar o meio de cultura em um prato de 6 poços. Lavar com PBS (temperatura ambiente), e aspirado cuidadosamente. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tripsina para o prato de 6 poços, incubar durante 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 5 ml de meio e dispersar as células por suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o meio de umd suavemente suspender as células em 2 ml de PBS. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão celular a 4 x 10 5 células / ml por PBS. </li><li> Montar uma corrediça, um cartão de filtro e uma câmara com um grampo e colocá-los dentro das ranhuras adequadas no rotor do cytospin. Adicionar 250 mL de cada amostra preparada no passo 2.6 em cada câmara das unidades montadas na cytospin. Centrifuga-se a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Encher frascos de 3 coplin sobre gelo com 40 mL de cada um de tampão PBS, CSK gelado (10 mM PIPES, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarose 300 mM; MgCl2 3 mM) e tampão CSKT (CSK com tampão de 0,5% de Triton X-100), respectivamente. </li><li> Após a citocentrifugação está terminado, rapidamente transferir a corrediça em PBS gelado e incubar durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para tampão CSK gelada e incubar durante 1 min. </li><li> Transferir as lâminas para tampão CSKT gelada e incubar durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas de volta para gelada CSK buffer e incubar durante 1 min. </li><li> Transferir as lâminas em 4% de paraformaldeído em PBS e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> Colocar as lâminas em um frasco coplin com PBST (1x PBS com 0,1% de Tween-20) durante vários segundos. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide e colocá-lo em uma caixa de pipeta-tip vazio com água. Sobrepor a lâmina com 40 ul de solução de bloqueio (PBS 1x, 1% BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente uma lamela, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar as lamelas, remover a solução de bloqueamento e adicionar 40 ul de anticorpo de histona H3K27me3 primário diluído para uma concentração de 1: 500 em solução de bloqueio. Coloque a lamela de volta sobre a lâmina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. NOTA: Um inibidor RNase na solução de bloqueio pode ser útil para preservar RNA neste RNA FISProtocolo de H quando são utilizados anticorpos policlonais. </li><li> Wash deslizar 2 vezes em frascos coplin cheios de PBST, durante 5 minutos cada, agitando suavemente durante a lavagem. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta na caixa de ponta. Sobreposição com 40 ul do anticorpo secundário (1: 500) diluídos em solução de bloqueio, colocar uma lamela, e incubar durante 15 min no escuro. Para os passos seguintes, manter o slide no escuro em todos os momentos. </li><li> Lavar duas vezes em frascos Coplin com PBST como no passo 3.4. </li></ol> 4. FISH RNA com Oligonucleotide Sondas <ol><li> Pré-aquecer uma caixa de pipeta-tip vazio com água na parte inferior para evitar slides de secagem a 37 ° C por RNA FISH no passo 4.3. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide a partir do passo 3.6 e coloque a lâmina na caixa de pipeta-ponta com water na parte inferior. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de FISH (10% de formamida em 2 x SSC) sobre a lâmina e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover solução de lavagem FISH, adicione 8 mL de sondas de oligonucleotídeos para o slide, coloque uma lamela, e transferir o slide para uma caixa de pipeta-ponta pré-aquecido com água na parte inferior; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Coloque 3 frascos coplin pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C com tampão de lavagem FISH, tampão de lavagem FISH com DAPI, e 2x SSC. </li><li> Depois de 1-2 incubação hr para RNA FISH, coloque o slide no tampão de lavagem FISH pré-aquecido. </li><li> Incubar a lâmina durante alguns minutos até que a lamela cai fora da lâmina. </li><li> Colocar a lâmina de volta para o tampão de lavagem, e continuar a incubação durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para outro frasco coplin com tampão de lavagem pré-aquecido FISH com 0,5 ng / ml DAPI e incubar por 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para outro frasco coplin com pré-aquecido 2x SSC e incubar por 5 min. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta em uma caixa de ponta seca. Adicione 4 l de antifade com DAPI para o slide e colocar uma lamela. </li><li> Selar a lamela com unha polonês e observar ao microscópio. A corrediça pode ser armazenado a 4 ° C no escuro, por alguns meses. </li></ol>

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	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gracefully+ageing+at+50,+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control.">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li><li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+years+of+X-inactivation+research.">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li><li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+by+RNAs:+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function.">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li><li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation.">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li><li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis.">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li><li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase:+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear/chromosome+structure.">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li><li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA.">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation.">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li><li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes.">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li><li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis.">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome.">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li><li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice.">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li><li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+in+mouse+ES+cells:+histone+modifications+and+FISH.">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li><li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li><li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation.">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li><li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies.">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li><li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways.">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li><li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation.">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171 (2004).</li><li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Neste artigo, apresentamos um protocolo de imuno-FISH rápida, que leva menos de 5 horas para completar a preparação slide, Xist RNA FISH, e imunofluorescência para H3K27me3. Em comparação com a abordagem geral imuno-FISH para Xist RNA de detecção, que normalmente precisa de incubação durante a noite para RNA FISH, este protocolo não só reduz significativamente o tempo gasto, mas também melhora a sensibilidade imunológica-FISH usando sondas de oligonucleotídeos. Uma vez que é ...

Mammalian inactivação do cromossoma X (XCI) é uma estratégia para compensar o desequilíbrio de dosagem do gene ligado ao X e XY entre XX, em que um dos dois cromossomas X em fêmeas é transcricionalmente inactiva 1. Inativação do cromossomo X é um grande sistema modelo para RNA longo não-codificante (lncRNA) pesquisa. Inativação do cromossomo X é regulada por vários lncRNAs, e tem sido amplamente estudado ao longo das últimas décadas para descobrir os mecanismos de crosstalk entre lncRNAs, transcrição, estrutura da cromatina e organização nuclear 2, 3. O centro X inactivação (XIC) localizado no cromossoma X é um locus genético complexo composto de um número de genes que produzem não codificantes RNAs 4. X-inativo transcrição específico (Xist) lncRNA em mamíferos eutherian é um desses lncRNA que desempenha um papel crucial na inativação do cromossomo X 5,6. Transcrições XIST rodeiam o local do future Xi para iniciar inativação do cromossomo X, e aparecem como uma nuvem quando visualizada usando RNA FISH; esta formação é referido como o &quot;Xist Nuvem&quot; 7. Desde Xist ARN interage com vários enzimas de modificação de cromatina, a co-localização das nuvens XIST com diferentes modificações epigenética para cromatina silenciosa e repressor de transcrição é observado durante a inactivação do cromossoma X 8. Por exemplo, Xist ARN interage com Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) que é responsável pela H3K27me3 e induz um estado repressivo 9 cromatina. A ocorrência da nuvem Xist no Xi e sua co-localização com a modificação intensiva H3K27me3 representa uma paisagem heterocromatina facultativa do Xi 10,11. Técnicas de citogenética, como o DNA / RNA FISH têm percorreu um longo caminho desde o método tradicional utilizando sondas radiomarcados 12 às técnicas recentes e avançados, com maior sensibilidade eimagens fluorescentes usando várias sondas de oligonucleotídeos 13,14. PEIXES ADN / ARN acoplado com a imunofluorescência foi rotineiramente usado como uma ferramenta para compreender citológico organização espaço-temporal nuclear, ARN de localização, a estrutura da cromatina e modificações. A preparação mais padrão sonda para RNA FISH envolve o uso de plasmídeo ou cromossoma artificial (BAC) clones bacterianas e sua rotulagem subsequente quer com tradução nick ou iniciação ao acaso 15. No entanto, cerca de 70% dos genes em ratos e 40% de genes em humanos mostram uma sobreposição de transcritos de sentido e anti-16, exigindo assim um método FISH específico de cadeia, a fim de distinguir o sentido e anti-transcrições. Em sondas de ARN transcritos in vitro (ribossonda ) são frequentemente utilizados para específicos de cadeia de ARN FISH 17,18; No entanto, isto envolve a preparação de um clone de plasmídeo ou com o produto de PCR de T7, SP6 ou T3 promotor e ribossondas sintetizar. Além disso, ribossondas derivado genomic DNA ou cDNA geralmente contêm regiões não-específicas e elementos repetitivos, que resultam em alto ruído de fundo. Outra questão é que ribossondas, que são algumas centenas de nucleótidos de comprimento e contêm vários fluoróforos, não pode penetrar de forma eficiente para o núcleo. Para contornar este, várias sondas de oligonucleótidos mais curtos marcados com um fluoróforo único no final foram desenvolvidos que possuem uma boa sensibilidade, a intensidade do sinal uniforme, e facilidade de purificação e de manuseamento 14. Além disso, os oligonucleótidos de ADN são geralmente mais estáveis ​​do que o RNA. Nós aplicamos uma estratégia similar de usar oligonucleotídeos em Xist RNA FISH 19 com imunofluorescência para entender a dinâmica epigenéticas do Xi induzidas por Xist lncRNA durante o processo de inativação do cromossomo X. Este protocolo descreve a criação de sondas de oligonucleótidos e preparação de células apropriada, bem como a utilização de imunofluorescência e ARN FISH. Xist RNA FISH usando oligonucle múltiplaotides é o custo abordagem eficaz a longo prazo, se Xist RNA FISH é realizada rotineiramente em um laboratório. Esta técnica pode ser usada para identificar lncRNAs em células, ao mesmo tempo mapeando sua co-localização com modificações epigenética ou factores. Uma das principais vantagens do protocolo é a capacidade de modificá-lo facilmente para atender um de interesses de pesquisa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">oligonucleotides with 5&#8217;-amine modification</td>
			<td style="width:187px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Alexa Fluor 488 Reactive Dye</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A32750</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MicroSpin G-25 columns</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5325-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cytospin 2</td>
			<td style="width:187px;">Shandon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">59900102</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10715859103</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Histone H3K27me3 antibody</td>
			<td style="width:187px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">61017</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Accutase</td>
			<td style="width:187px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AT104</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21424</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quick fluorescent in situ hybridization protocol for xist rna combined with immunofluorescence of histone modification in x-chromosome inactivation

Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.

Imagens representativas de rápida imuno-FISH são apresentados na Figura 1A. A co-localização do sinal de Xist ARN nuvem e H3K27me3 no Xi foi detectado na diferenciação das células do sexo feminino. No dia 12 após a diferenciação, mais de 90% das células tinha uma nuvem EB Xist (Figura 1B). Sondas oligonucleotídicas curto eficientemente penetrou nos núcleos, levando a uma visualização de quase todos H3K27me3 sinais co-localizada com Xist ARN (Figura 1C; 97...

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Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Fluorescent Rápida<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

13.8K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level. 

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