وأيد هذا العمل من خلال تمويل للمختبر أبحاث Wingert مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر بول كروجر T. الابن لتوفير التغذية المرتدة حاسم على المخطوطة. نشكر موظفي قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء من الباحثين و لدينامختبر الفصل على تعليقاتهم والمناقشات والأفكار حول هذا العمل.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تحديد العقاقير العلاجية فعالة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان هو نهاية اللعبة بالنسبة لكثير من الباحثين الطبية الحيوية. في حين أن تحديد وتوصيف وكلاء الدوائية المحتملة للتطبيقات السريرية له قيمة واضحة للرعاية الصحية، إلا انه لا يزال يشكل تحديا كبيرا. في نهاية المطاف، وتطوير العديد من المركبات العلاجية تأتي من معرفة كيفية أنواع معينة من الخلايا إما تتطور أو وظيفة. الزرد، دانيو rerio، هو مكتملة العظام المياه العذبة من عائلة شبوطيات التي أصبحت كائن النموذج السائد في البيولوجيا التطورية 1. الزرد وراثيا الفقاريات الانقياد التي هي سهلة للحفاظ على والتلاعب للدراسات العلمية 2،3. الجنين الزرد شفافة، المخصبة خارجيا، ويمكن أن تنتج من قبل مئات من زوج واحد التزاوج الكبار في أسبوع واحد فقط 2،3. وعلاوة على ذلك، حصة أجهزة الجسم الرئيسية الزرد وتمتلك د كبيرegree التشابه الجيني مع الثدييات، بما في ذلك البشر 4. لافت للنظر، و 70٪ من الجينات البشرية لها orthologue الزرد 4. ونتيجة لهذا التشابه، كانت الزرد نظام التجريبية ذات أهمية كبيرة لدراسة آليات تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء، و قد استخدمت لتلخيص العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 5-7. هذه الأسباب وغيرها، جعلت الزرد مرشحا مثاليا لمواصلة التحقيقات الوراثية ونتج عنه زيادة مطردة التقدير لفائدة الزرد في أبحاث الطب الحيوي 6،7. على مدى العقود القليلة الماضية، وقد وضعت وفرة من الأدوات الوراثية في الزرد. الجينوم الزرد غير قابلة للالطفرات وtransgenesis 3. حتى الآن، تم تنفيذ عدد كبير من الأمام وعكس الدراسات الجينية، مما يؤدي إلى توليد أكثر من 9،000 المسوخ 3. وعلاوة على ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا لها أن تكونخلق أون، والتي مكنت من وضع العلامات وعزل أنواع معينة من الخلايا 3. فقد كانت هناك جهود كبيرة الجارية لتركيز وتوزيع هذه الموارد للمجتمع البحوث، والتي يمكن الوصول إليها عن المختبرات بتكلفة منخفضة نوعا ما من خلال المركز الدولي للاسماك الزرد الموارد (ZIRC) 8. وعلاوة على ذلك، مستودع واسعة من المعلومات البيولوجية والأدوات الجزيئية، بدءا من أنماط التعبير الجيني لmorpholino متواليات والبروتوكولات، وقد تم شرحها بشكل تدريجي على شبكة المعلومات الزرد (ZFIN) 9-11. وقد بذلت هذه البنية التحتية البحثية الزرد ممكن من خلال دعم NIH كبير والدعوة لهذا النموذج الحيواني 8. استمر هذا المخبأ من المسوخ الزرد، خطوط المعدلة وراثيا، والمعلومات ذات الصلة لتكون ذات قيمة استثنائية للمجتمع الأبحاث البيولوجية ككل. ومع ذلك، في حين الزرد الآن نموذج كائن راسخة والبارز، فإنها لا تمثلrgely غير مستغل لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض من خلال استخدام شاشات الوراثية الكيميائية. علم الوراثة الكيميائية هي استخدام الجزيئات الصغيرة، مثل المخدرات أو غيرها من المركبات، أن تؤثر عملية بيولوجية ضمن نظام المعيشة 12. يمكن تطبيق علم الوراثة الكيميائية لفهم الآليات الجزيئية وظيفة الجين، مثل التعرف على العوامل التي الإنقاذ أو تفاقم خلل جيني معين 12. وعلاوة على ذلك، وعلم الوراثة الكيميائية تمثل سبيلا رئيسيا واحدا لإجراء البحوث متعدية 12. بينما كانت شاشات الوراثية التقليدية إلى الأمام في النماذج الحيوانية قوية جدا في ربط جينات معينة للأمراض، فهي تفتقر إلى البعد الزماني، مما يجعل من الصعب أو من المستحيل أحيانا لمراقبة الظواهر التي قد تنشأ بعد مرحلة التطور الجنيني المبكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التكرار الجيني يجعل النتائج لوحظ من علم الوراثة إلى الأمام يصعب تفسيرها. بدلا من ذلك، وشاشات جينية الكيميائيةالسماح للسيطرة الزمنية الدقيقة وتوفير وقت واحد نقطة انطلاق قيمة لاكتشاف المخدرات 12،13. علم الوراثة الكيميائية يمكن أن يؤديها في استخدام أنظمة الأنابيب (مثل خطوط الخلايا والبروتينات) أو باستخدام نظام في الجسم الحي، مثل الحي كله. يمكن استخدام النظام في المختبر لعلم الوراثة الكيميائية يكون مفيدا لأنه أبسط من نظام الحي كله، وأسهل للعمل مع على نطاق واسع، أقل تكلفة، وأقل استهلاكا للوقت. ونتيجة لذلك، في المختبر أنظمة تسمح لكلا الإنتاجية العالية الفرز (HTS) وفحص عالية المحتوى (HCS). هناك عدد من المزايا لاستخدام نظام في المختبر التي يجب أخذها في الاعتبار عند الاقتراب الوراثة الكيميائية، ولكن أيضا قيود كبيرة. أحد أوجه القصور الرئيسية لاستخدام خط الخلية هو أن جزيئات صغيرة يمكن أن يكون فعال وغير سامة في خط خلية معينة، ولكن عندما تصبح سامة أدخلت في الحي كله. وبالتالي، فإن جوهرالقضية هي أن في المختبر أنظمة لا تعبر عن السياق العام للكائن الحي، وبالتالي ليست قادرة على تقليد بدقة ما يحدث في الحي كله دائما. في حين أن الاختبار المركب في الكائنات كلها يمكن الالتفاف على هذه القضايا، واستخدام الثدييات نماذج الحي كله يطرح عددا من القيود المادية والأخلاقية. على سبيل المثال، فحص المخدرات في الماوس وأعاقت وجستيا من الفضاء والنفقات اللازمة لاختبار حجم العينة المناسب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب الأسئلة التنموية للدراسة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن تطور الثدييات في الرحم. أخيرا، في حين أن إجراء البحوث الطبية الحيوية له قيمة اجتماعية كبيرة، ومع ذلك هناك احتياجات كبيرة لحماية الرفق بالحيوان عن طريق الحد من دراسات مكثفة وتخفيف الألم والمعاناة من الحيوانات المستخدمة في الأبحاث. الزرد توفر بديلا صالحا للعمل مع الفقاريات العليا مثل الثدييات، وعلاوة على ذلك، العديد من المواضيع يمكن دراستها باستخدام علم الوراثة الكيميائية فيالمراحل الجنينية واليرقات عند معالجة العصبية غائب أو المنطوق عند مستوى منخفض 12،13. حتى الآن، تم إجراء عدد لا يحصى من شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الأجنة الزرد على وجه الخصوص، وتسليم المجمع يمكن تحقيق ذلك عن طريق غمر الأجنة في وسائل الإعلام التي تحتوي على المخدرات من اهتمام 12-15. وعلاوة على ذلك، كانت هناك العديد من التطورات العلمية والتكنولوجية لجعل شاشات الوراثية الكيميائية ممكن ويمكن التحكم 16-20. وكان بيترسون وزملاؤه أول من استخدم الزرد في شاشة الوراثية الكيميائية في عام 2000، وفيما بعد في عام 2004 حددت مجمع أن قمعت طفرة تضيق الأبهر في الزرد 21،22. ومنذ ذلك الحين نفذت شاشات الكيميائية لدراسة عدة أنسجة نامية (مثل القلب والدم والأوعية) 23-25، الوظائف الفسيولوجية (على سبيل المثال، أساس العصبية للسلوك) 26، 27،28 تجديد الكبار، وامراض<html> النماذج الإلكترونية (مثل ضمور العضلات والسرطان) 29،30. من بين هذه الشاشات الكيميائية الزرد، اتخذت اكتشاف البروستاجلاندين التي تنظم الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى التجارب السريرية على البشر، مما يدل على القدرة على الانتقال من &quot;دبابات إلى السرير&quot; 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500. NCT01627314). وفي الآونة الأخيرة، ظهرت علاجات واعدة المرشح لأجهزة معقدة مثل الكلى وعلاجها علم الأمراض الخلوي الذي في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34 و قصور كلوي حاد 27،35، على الرغم من أن هذه لديها حتى الآن للانتقال إلى التجارب السريرية. تظهر هذه الشاشات الوراثية الكيميائية على نطاق واسع فائدة اختبار المركبات الصغيرة في الزرد النامية والقدرة على تطبيق علم الوراثة الكيميائية لاستجواب وظيفة الأنسجة الكبار. وعلاوة على ذلك، هناك قائمة متزايدة من مجموعات الأدوية المتاحة تجاريا التي تكون متاحة للدراسات الأكاديمية 19. ove_content &quot;&gt; وفي السنوات القليلة الماضية، كانت هناك تطورات بارزة في مجال تكنولوجيا الفحص الجيني الكيميائية، بما في ذلك استخدام النظم الآلية الروبوتات الاستغناء عن المخدرات والتعامل معها، جنبا إلى جنب مع أنظمة التصوير الآلي 36-38. هذه النظم تسمح بإمكانية اختبار عدة آلاف من المركبات على حد سواء لتحقيق HTS وHCS 36-38. وللأسف، فإن التعهد شاشات الوراثية الكيميائية مع هذه المؤسسات الروبوتية مبتكرة تتطلب عادة موارد كبيرة. هذه الأنواع من الموارد تشكل عائقا كبيرا للعديد من المؤسسات التي تفتقر إلى رؤوس الأموال للحصول على وتشغيل وصيانة هذه الأجهزة. ورغم تأسيس البنية التحتية للمعالجة الآلية للمكتبات الكيميائية، بما في ذلك نقل الأجنة إلى المحتشدة لوحات، لا تزال باهظة بالنسبة لكثير من المختبرات والتصوير الآلي وتحليل التكاليف عموما أكثر يمكن الوصول إليها 12. تمكن الآلي فحص الصورة الكمي من الفلورسنت إعادة المعدلة وراثياالحمالين ويسهل تحليل المظهري محدد 12،15. على الرغم من أن النظم الآلية تمثل التقدم التكنولوجي مفيدة، أسئلة كثيرة يمكن معالجتها من خلال شاشات اليدوي أكثر تركيزا، مثل الاستعلام من عدة آلاف من المركبات النشطة بيولوجيا في العملية التنموية مع كامل جبل الموقع التهجين (WISH) قراءات في 39. وعلاوة على ذلك، في حين أن عددا متزايدا من مختبرات والتذرع شاشات الكيميائية الزرد للتحقيق في مسألة بحثية، وعدد قليل التشبع (إن وجدت) وصلت الجهود والعديد من المواضيع حتى الآن لم يتم اختراقها باستخدام علم الوراثة الكيميائية. يمكن تنفيذها باستخدام شاشات الكيميائية الزرد مستعمرة صغيرة تتألف من عدد قليل فقط من النوع البري أو الدبابات المعدلة وراثيا. لذا، ينبغي أن يكون هذا الشكل من الاستجواب الجيني يمكن بلوغه من قبل معظم المجموعات البحثية الزرد المهتمة في توسيع / ​​تنويع في هذه الساحة. المكتبات الكيميائية متفاوتة الحجم يمكن شراؤها من الموزع التجاري و / أو عمودlaborators. لهذه الأسباب، يمكن أن الوراثة الكيميائية يكون مجديا اقتصاديا حتى في المناخات القاسية التمويل. ومع ذلك، هناك عقبات في بداية شاشة الوراثة الكيميائية، مثل كيفية تخطيط الجوانب اللوجستية للشاشة: على سبيل المثال، فإن عدد الموظفين اللازمين لشاشة ناجحة، وتخصيص وقت مخصص والتفكيك معا بروتوكول المادي لعينات العملية يدويا هذا العدد من بضع مئات إلى عدة آلاف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الجنين الزرد مع WISH بمثابة قراءة المغادرة. يتضمن هذا الأسلوب العلاج من تعاطي المخدرات من الأجنة الزرد، تليها الكشف riboprobe النصوص مرنا. باستخدام هذا البروتوكول، فريق صغير أو حتى فرد واحد يمكن فحص وتحليل معقول مكتبة الكيميائية متواضعة حوالي 600 مركبات في غضون 9 أسابيع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:252px;">JoVE 51922 MATERIALS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:252px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 - 10 &#965;L natural pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">USA Scientific</td>
			<td>1111-3800</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 50X E3 and DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB11072</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-3225</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">20X SSC</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB13156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td>35-3226</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs - boil then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plate</td>
			<td style="width:191px;">CytoOne</td>
			<td>CC7672-7548</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">50 X E3</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 deep well plate</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>100-11-940</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate sealing mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-946</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B8503</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mg/mL using 100% DMF - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">block solution</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00448</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &#176;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:349px;">Consult the manufacturer procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00450</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">4716728001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-1005</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epT.I.P.S 20-300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>22492284</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">E7023</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16140089</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430516</td>
			<td style="width:349px;">0.45 &#965;m CA / 1L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">fine forceps</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:101px;">RS-1050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:252px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00600</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass basin 90 x 50</td>
			<td>Kimax Kimble</td>
			<td>23000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass pipette</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glass vial</td>
			<td style="width:191px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">225012</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G7893</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G8898</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycogen</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">HYB+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 &#965;L/&#965;L heparin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">INT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">I8377</td>
			<td style="width:349px;">Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:252px;">MAB</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MABT</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MeOH</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">34860-4L</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:191px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:101px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:191px;">Mediatech</td>
			<td style="width:101px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 30 - 300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.051</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">nanodrop</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">NBT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">N6876</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:101px;">19210</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR-Film adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>30127.48</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plate container (Pencil Box)</td>
			<td style="width:191px;">Sterilite</td>
			<td>1722</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pronase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11459643001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3335399001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rubber bulb</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11487671001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 45 &#965;L of NBT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 31.5 &#965;L of INT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:101px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11031171001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10881775001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:191px;">Samco</td>
			<td style="width:101px;">202, 204</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB02038</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">waterbath</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">51221073</td>
			<td style="width:349px;">(Model # 2831)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

أصبحت الزرد نموذج كائن يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الآليات التي تقوم عليها البيولوجيا التطورية ودراسة علم الأمراض الأمراض التي تصيب البشر بسبب درجة كبيرة من المحافظة الجيني مع البشر. علم الوراثة الكيميائية يتطلب اجراء اختبارات مفادها أن الجزيئات الصغيرة لديها على عملية بيولوجية، وأصبحت وسيلة شعبية الأبحاث المترجمة للتعرف على المركبات العلاجية. الزرد جذابة خصيصا لاستخدامها في علم الوراثة الكيميائية بسبب قدرتها على إنتاج براثن كبيرة من أجنة شفافة، والتي يتم إخصابها خارجيا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون بسهولة الأجنة الزرد المخدرات يعامل بإضافة بسيطة من مركب إلى وسائل الإعلام الجنين. باستخدام كله يشن الموقع التهجين (WISH) في، التعبير مرنا يمكن تصور واضح داخل الأجنة الزرد. معا، وذلك باستخدام علم الوراثة الكيميائية وWISH، يصبح الزرد سياق الحي كله قوي فيها لتحديد الخلوية والفسيولوجيةآثار جزيئات صغيرة. وقد تم إحراز تقدم في التقنيات المبتكرة التي تستخدم إجراءات الفرز القائم على الجهاز، ولكن للعديد من المختبرات مثل هذه الخيارات لا يمكن الوصول إليها أو لا تزال باهظة التكاليف. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية تنفيذ شاشة عالية الإنتاجية اليدوية الكيميائية الوراثية التي تتطلب موارد الأساسية، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فريق فردي أو صغير واحد في فترة زمنية فعالة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية مجدية والتي يمكن تنفيذها من قبل مجموعات بحثية لأداء الوراثة الكيميائية في الزرد، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاكتساب الأفكار الأساسية في العمليات التنموية، وآليات المرض، والتعرف على مركبات جديدة ومسارات الإشارات التي لها تطبيقات ذات الصلة طبيا .

النهج اليدوي الموصوفة هنا يسمح للباحث واحد بكفاءة وبنجاح إجراء إنتاجية عالية شاشة الوراثة الكيميائية جزيء صغير باستخدام نموذج الجنين الزرد (الشكل 1). باستخدام هذه الطريقة، فمن العملي لشخص واحد لأداء شاشة الوراثة الكيميائية، بحيث على مدار 9 أسابيع شخص واحد (ملتزمة أسبوع العمل 40 ساعة) يمكن إجراء مسح لل~ 600 مركبات (الشكل 1) . وبالتالي، لا يمكن للوقت مقاعد البدلاء لشخص واحد تجاوز الحاجة إلى معدات مطالبين ذات الموارد المرتفعة، مثل النظم الآلية. المفاضلة هي أن الشاشة يدوية تتطلب عدة أسابيع من الجهد المتفاني. في المقابل، يمكن استخدام النظم الآلية ضغط الوقت تشارك في 1-2 أسابيع من الوقت الروبوتية، ويمكن أن يترتب على الحد الأدنى نسبيا جهد الباحث عموما. طريقة واحدة لزيادة كفاءة و / أو نطاق الشاشة الدليل هو حشد 2-3 الباحثين في المجموع، والتي من شأنها أن تمكن من فحص ممركبات خام، متفاوتة تركيز مركب، و / أو غربلة على مدى فترة زمنية أقصر. ويوضح الخطوات الأولية المشاركة في بروتوكول لإكمال الشاشة الوراثة الكيميائية في الأجنة الزرد مع قراءات WISH بمثابة مخطط (الشكل 2). ويمكن تقسيم المهام التجريبية إلى نوعين من أسابيع العمل: (1) التعرض للمواد الكيميائية ووضع البطاقات التعريفية الجنين، و (2) تحليل والتصوير. في أسبوع العمل التعرض للمواد الكيميائية، وهذه الخطوات تشمل اقامة البالغين الزرد (يوم 1)، وجمع الجنين والأجنة arraying والعلاج من تعاطي المخدرات (يوم 2)، وإعداد الأجنة لفي الموقع التهجين (يوم 3)، والتهجين في الموقع (اليوم 4 -6). في الأسبوع التحليل / التصوير، والباحث يحلل التعبير مرنا ليسجل الأجنة ويضرب صورة (يوم 11/07). جزء هام من أداء الشاشة الوراثة الكيميائية هو تسمية باستمرار وبدقة جيدا المواقع. كما الشاشة الوراثة الكيميائية صrocess مفصلة هنا ينطوي على نقل مجموعات من الأجنة من بئر في لوحة واحدة لبئر في لوحة مختلفة عدة مرات، والحاجة لوصفها دقيقا وواضحا أمر بالغ الأهمية، حتى أنه عندما سجل ضربة كيماوية يمكن أن يكون خطيا وسهولة ارجاعه لهويتها داخل المكتبة الكيميائية (الشكل 3). طريقة سهلة لضمان ذلك هي تسمية لوحات في مثل هذه الطريقة أنه في أي وقت ومكان جيد لمجموعة من الأجنة تعامل من قبل مجمع مباريات مباشرة المكتبة وحة المخدرات المكان جيدا الكيميائي للمركب يستخدم لعلاج هذه الأجنة (الشكل 3). هنا، يستخدم نظام مزدوج من الألوان الترميز والعلامات العددية لتنظيم العينات التي تمت إضافتها إلى لوحات الشاشة باستخدام علامات دائمة (الشكل 3). في حين أن تحليل نتائج شاشة عالية الإنتاجية، وهناك حاجة ماسة لتطوير طريقة لتنظيم بشكل صحيح، تعليم، وتحليل جزيء صغير محتملالزيارات. لذا، يجب أن يكون شاشة الوراثة الكيميائية نظام الدرجات دقيق وواضح التي تم تصميمها بعناية والتقيد التام بها. وينبغي لهذا النظام بسهولة وبشكل كامل تنقل ديناميكية هامة للمجمع وتوفر وسيلة مختصرة لعرض نتائج الشاشة النهائية. طريقة واحدة لبناء مثل هذا النظام هو أن الأجنة درجة الاستفادة من النظام الطبقي، وهذا ما يفسر شدة المورفولوجية العامة وثقة ضرب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقترن فئات الطبقة مع (+) أو (-) لوصف أي تأثير توسعية أو التخفيض على المنطقة (ق) من الفائدة. هنا، تعرض الأجنة الزرد إلى مركبات فردية من مكتبة النشطة بيولوجيا (انزو الكيماويات) من 50٪ إلى 24 اكتفار HPF، ثم يعاير من قبل WISH باستخدام مزيج من ثلاثة riboprobes للكشف عن قطاعات كليون (الشكل 4A). باعتبارها نظام الدرجات سبيل المثال، بئر يحتوي على مجموعة من الأجنة التي لديها convolu القريبة الموسع بشكل كبيرتيد أنبوب صغير (PCT) من سليفة الكلوة، الكلى الجنينية الزرد، من شأنه أن يتسبب في مركب يستخدم لعلاج بشكل جيد يتم تصنيفها على أنها (الدرجة الأولى)، وهو في هذه الحالة من شأنه أن يمثل الطبقة المرتبطة عيب أشد وأعلى مستوى الثقة في النمط الظاهري لاحظ الشكل (4B). عندئذ المشروح المجمع مع (PCT) و (+)، ويجري تدوين كامل (الدرجة الأولى - PCT +) (الشكل 4B). هذا مفهوم التصنيف يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لوصف مجموعة نفيسة من المعلومات المتعلقة جزيء صغير من اهتمام، بما في ذلك من شدة تأثير المركبات على الكائن الحي، المنطقة التي يتأثر المخدرات والطريقة التي كانت المنطقة تتأثر (الشكل 4B). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. &amp; #160؛ دليل الزرد استراتيجية شاشة الجنين الكيميائية ويمكن للباحث يختبر عمليا في 96 لوحة جيدا للمواد الكيميائية على الأجنة الزرد وتنفيذ معالجة WISH لاحق خلال أسبوع واحد. أداء أسبوعين من الاختبارات الكيميائية (1 أسبوع (يوم 06/01) و2 أسبوع (يوم 12/7)) يمكن إرفاقها مع الأسبوع الثالث مخصص لأخذ عينات التحليل. ما يقرب من 96 لوحات تستحق عينات من الشاشة ويمكن تصويرها وسجل 3 أسبوع (يوم 13-17). هذا السيناريو يصل إلى ما يقرب من 200 فحص المركبات في فترة زمنية 3 أسابيع، ما يعادل مكتبة صغيرة من حوالي 600 فحص المركبات بشكل كامل من قبل 9 أسابيع. يمكن تعديل هذه الاستراتيجية اليدوية اعتمادا على الموارد المتاحة. على سبيل المثال، يمكن أن تقلل من ثلاثة باحثين من الوقت لاستكمال شاشة حوالي 600 مركبات إلى 3 أسابيع مقارنة مع 9 أسابيع سيستغرق مع أحد الباحثين. استراتيجيات الفحص يمكن تكييفها عن طريق تعيين الباحثين لجوانب محددة من الشاشة، مثل علاج المخدراتمنة والموقع التهجين أو توجيه الباحثين في إجراء عملية الفرز بشكل مستقل بالكامل على أجزاء منفصلة من مكتبة الكيميائية. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. مخطط انسيابي: انهيار سير العمل الشاشة 6 أيام ويمكن تقسيم عملية الفرز الكيميائية بتحفظ وصولا إلى 6 أيام. يوم 1 ويتكون من إنشاء أزواج التزاوج الزرد (= /&gt; 25) لتزويد أجنة لكل 96 لوحة جيدا ليتم عرضه. يوم 2 يشمل جمع الأجنة من غرف التزاوج وarraying لهم في عمق 96 لوحة جيدا، تليها العلاج من تعاطي المخدرات. في يوم 3 أجنة مستعدة لWISH، بما في ذلك dechorionation، تثبيت الأنسجة والأجنة الجفاف. أخيرا، يتم تنفيذ WISH على الأجنة خلال 4-6 يوم. يرجى ملاحظة أن إجراءات بديلة تلطيخ على عينات ثابتة يمكن أن يكون بسهولة Substituted لWISH. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. لوحة توسيم نقل التخطيطي. والمحتشدة الأجنة الزرد والمخدرات يعامل في 96 لوحة جيدا ثم انتقلت إلى 24 لوحة جيدا لإزالة الأنقاض والتعرض pronase. ثم يتم نقل الأجنة إلى 48 لوحات جيدة لإعداد الجنين، WISH، وتثبيت الأنسجة. بعد ذلك، يتم نقل الأجنة إلى 12 لوحات جيدة للتسجيل والتصوير، والتخزين. ويتم إنجاز arraying الدقيق للأجنة من خلال استخدام نظام الترميز اللوني الذي يمكن للباحث لتتبع المواد الكيميائية المنشأ لكل عينة اختبار. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content العرض = &quot;5in&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52063 / 52063fig4highres.jpg&quot; العرض = &quot;500&quot; /&gt; الرقم 4. مثال نظام الدرجات: تجزئة فحص الكلى تمكن تجربة WISH الباحث إلى وصمة عار أنواع معينة من الخلايا استنادا إلى هوية تحقيقات التي تم تحديدها، والسماح للتقييم التغيرات في الظواهر الجنين وفقا للتغيرات في موقع مرنا النسخ و/ أو المستويات. على سبيل المثال، ثلاثة قطاعات من الكلى الجنينية الزرد، وسليفة الكلوة، وقد وصفت باستخدام شاشة ميكس 1. شاشة ميكس 1 هو مزيج من تحقيقات تتكون من wt1b، الذي يموضع تحديدا في podocytes (P)، slc20a1a الذي يصادف القريبة الملتوية نبيب (PCT)، وslc12a1 التي تصف البعيدة في وقت مبكر (DE) شريحة 47. و(+) بجانب رمز تسمية المنطقة يستخدم لتعليم التوسع أو التحول الإيجابي في تلك المنطقة، في حين أن - يستخدم رمزا لإملاء التقليل من منطقة (). هنا، طب الطوارئbryos المخدرات تعامل مع رابطة الدول المستقلة 13-RA لها الداني الملتوية أنبوب صغير الموسع وخسارة كاملة من الجزء القاصي المبكر مع أي تأثير واضح على podocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في القراءة خارج.

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

a-manual-small-molecule-screen-approaching-high-throughput-using

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  University of Notre Dame.  الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في...

Video: A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

A طريقة Permeabilization من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...