وأيد هذا العمل عن طريق منح DP2OD008470 المعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام. إعداد الحل 1. رينغر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل من 116 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.9 ملي بوكل، 3.6 ملي CaCl 2، و 5 ملي HEPES مع عالى النقاء H 2 O من خلال التحريك المستمر لتفادي أي ترسيب الملح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة الأملاح وبينما الحل لا يزال يتحرك، إضافة 100 وحدة / مل البنسلين في و 100 ميكروغرام لكل مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة جميع المضادات الحيوية والأملاح، نفذ التعقيم مرشح من الحل وتخزينها في حاوية معقمة. ملاحظة: N-الفنيل (1-فينيل-2-ثيوريا) أو PTU يمكن أن تضاف إلى الحل رينغر لمنع تشكيل الصباغ في حبة الأجنة مزروع من دون عواقب سلبية على صحة الجنين. لإعداد / تصبغ عرقلة الحل رينغر، واستخدام تركيزاتtration من 0.003٪ PTU. نظرا لتركيز منخفض من PTU التي يمكن ان تضاف ينصح بأن حجم أكبر من الحل رينغر يتم، على الأقل 1 L، لتجنب إضافة كميات ضئيلة من مسحوق PTU. إضافة PTU خلال الخطوة 1.2، في حين أن الحل هو التحريك. </li></ol> 2. تريكين إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 غرام من إيثيل 3-أمينوبنزوات الملح methanesulfonate (تريكين) لكل لتر من محلول زائد 0.1 M تريس، من 1 M الأسهم متوازن لدرجة الحموضة من 9.5 و المصنوع من عالى النقاء H 2 O. ملاحظة: سيتم استخدام تريكين إلى الموت ببطء الأجنة الزرد في نقطة الوقت المطلوب لفحص حبة الظواهر الزرع. </li></ol> 3. E3 إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل من 0،25 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 12.5 ملي CaCl 2، و 16.6 ملي MgSO 4-1 لتر من الماء عالى النقاء لخلق 1 لتر من E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق إلى حل E3 لمنع نمو الفطريات. </li></ol>4. إبر سحب لنقل Microbead <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النار مصقول البورسليكات الزجاج مع خيوط في لOD: 1.0 مم، ID: 0.5 ملم، بطول 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الزجاج borosilicated إلى مجتذب micropipette لإعداد إبر رفيعة. ملاحظة: الأبعاد الأربعة التالية يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لسحب الإبر: الحرارة = 540، سحب = 245، السرعة = 200، والوقت = 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد سحب عدد كاف من الإبر، وتخزينها في البلاستيك مغطى أطباق بتري المتمركزة على شرائط من الصلصال أو شريط لاصق لمنع كسر رأس الإبرة، حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخفض رأس إبرة لحجم تجويف المطلوب، استخدام زوج من ملقط غرامة ليسجل نهاية الإبرة. ملاحظة: سوف إبرة حجم تتحمل تختلف تبعا لحجم microbead يجري استخدامها وكذلك تفضيلات التعامل مع المستخدم. وهناك نقطة انطلاق جيدة لأحجام الحرفية تحمل في نطاق بين 100 و 200 ميكرون إذا كان سيتم استخدام بلي تتراوح 50-100 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PRIOص الاستخدام، وادخال الإبرة قلصت إلى حامل الأنابيب الشعرية إلى صياغة وثيقة نقل microbead الانتهاء. </li></ol> 5. الشارب / لاش إعداد أداة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الخط الطولي، السوط، أو غيرها من قطعة صغيرة بعد شركة من الطبيعي أو الاصطناعي خيوط الشعر. قطع بالقرب من قاعدة للخيوط في زاوية 45 درجة. تلتزم الخط الطولي لmicropipette غيض-P 1000 باستخدام دائم لاصق الغراء واضح. </li></ol> 6. Microbead زرع صينية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 2 غرام من الاغاروز مع 100 مل من محلول E3 لجعل 2٪ E3 agarose هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الحل الاغاروز 2٪ لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية في 250 مل دورق مخروطي، يحوم القارورة كل 30 ثانية من أجل تجنب جل من السطح من جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ غطاء لمدة 60 مم × 15 مم طبق بتري وضعه في أكبر 150 مم × 15 مم الطبق مع الداخلية التي تواجه التصاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب جل الاغاروز الساخن إلى 150 مم × 15 مم طبق بتري، والتأكد من أن يرسو أسفلغطاء للطبق أصغر مع السبابة. ملاحظة: السماح طبقة رقيقة من الاغاروز تحت غطاء من طبق أصغر لإزالة التكثيف التي ستشكل عند صب جل. وهذا سيجعل حبات السهل أن نرى تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يبرد الاغاروز، ولكن قبل أن يتصلب، ضع القالب بشكل جيد على هلام. وهذا سوف يسمح لوضع أسهل من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: من أجل تجنب فقاعات في الآبار، ضع القالب ببطء في زاوية حتى يعوم على الجزء العلوي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام microspatula، وإزالة بعناية القالب جيدا مرة واحدة وقد عزز الجل. إضافة E3 الحل وتخزينها في 4 ° C. </li></ol> 7. الأجنة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرف التزاوج، مفصولة فواصل، عن طريق ملء لهم حتى مع الماء النظام، ومن ثم وضع الذكور البالغين الزرد (ق) والإناث (ق) أزواج في غرف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض المخصب باستخدام غرامة سلكية مصفاة (المراحل الجنينية سوف تختلف قليلا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع البويضة الملقحة في، 10 سم طبق بتري قطر نظيفة من خلال تحويل مصفاة رأسا على عقب والشطف مع تيار غرامة E3 حتى لا توجد البيض تترك في مصفاة، وهناك ما يقرب من 25 مل من محلول E3 في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع وتقسيم البيض في عدة أطباق (حوالي 50-60 بيضة في طبق) لتجنب الاكتظاظ، والتي قد تؤدي إلى اتواقت التنموي داخل مخلب وجعل جمع المرجوة الأوقات نقاط صعبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في حل E3 في 28.5 ° C لتمكين التقييم التنموي وفقا لمعيار الزرد سلسلة انطلاق 40. ملاحظة: يجب أن يتم نقل الأجنة إلى E3 / PTU في 24 التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تطور الصباغ إذا التلاعب في مراحل قديمة تتطلب الوضوح البصري. </li></ol> 8. حبة زرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بلي في المطلوب تركيز جزيء اختبار أو ليالي السيارة المقابلةolution للمرة المطلوبة في حجم مناسب. ملاحظة: الباحثة يمكن استخدام أطباق بتري معقمة تتراوح بين 3-6 سم في القطر، أو لوحات متعددة أيضا، وكلاهما تمكين التصور من بلي في الحل. قد تختلف الوقت اعتمادا على نوع وكمية من جزيء من الفائدة، والباحث يجب الرجوع إلى الشركة المصنعة أو توصيات تنشر لمدة الحضانة وغيرها من الجوانب مثل الحساسية للضوء والحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد وصلت الأجنة في نقطة زمنية التنموية المرجوة، وإزالة الأجنة من chorions الخاصة بهم باستخدام ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في حل قارع الأجراس التي تمت تصفيتها مع المضادات الحيوية لمدة 10 دقيقة حتى يتأقلم منهم إلى الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الأجنة والتأقلم، ونقل بلي في لوحة microbead التي تقع داخل علبة زرع وشطف لهم في حل قارع الأجراس لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: زرع حبات بعد 50 دقيقة بعد الوصول إلى هذه النقطة. هذا ثسوء تقليل احتمال أن أحدا لن زرع حبة مع تركيز أقل من جزيء من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة من الأجنة في آبار من الدرج microbead الزرع، مع الحرص على توجيههم حتى مجال الاهتمام حيث سيتم زرع microbead يمكن الوصول إليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير على الجنين باستخدام إبرة التنغستن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل microbead على الجنين باستخدام ماصة نقل microcapillary: الاكتئاب لمبة من ماصة، وسحب بلطف microbead في العمود الشعري، ومن ثم الافراج عن الضغط لنقل microbead في الوجهة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead داخل الجنين. ملاحظة: تأكد من وضع microbead في الأنسجة بعيدا من موقع شق ذلك لن يتم طرد microbead من الجنين لأنه يشفي. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

على مدى القرن الماضي، وفهم خطة الهيئة الزخرفة وتوالد شهدت تقدما هائلة. وكانت تقنيات التلاعب الأنسجة الحيوية في الكشف عن المعلومات الأساسية عن هذه العمليات الحيوية. التعديل الوراثي هو واحد من أكثر الطرق شيوعا للتحقق من وظيفة الجين، وطرق التحليل فسيفساء، مثل زرع الخلايا، وتوفر مناهج مفيدة لفهم استقلالية وظيفة الجين. يوفر زرع Microbead مكان آخر لاستجواب كيف جزيئات خاصة تغيير ديناميات النمو، كما تمكن هذه الطريقة الباحث إلى تغيير بيئة الأنسجة المحلية من خلال تقديم إشارات جزيئات أو مثبطات. وهناك مجموعة من بلي مختلفة متاحة تجاريا، والتي أحجام مختلفة وغيرها من الخصائص الفيزيائية وجود (على سبيل المثال، تهمة) بحيث أنها يمكن أن تستخدم للظروف تجريبية من الفائدة. وبالتالي، من خلال زرع بلي التي هي غارقة في البروتين أو كيماويةكال المصالح داخل كائن حي، يمكن للباحثين التحقيق في آثار محلية خلال تطوير وإيجاد صلة بين الجينات أو جزيء من الفائدة وبشكل خاص النمط الظاهري البيولوجي (ق). دراسات مثل تلك التي تقوم بها وادا وزملاؤه تستخدم microbead زرع من أجل تقييم تأثير زيادة الإشارات القنفذ في الزخرفة الهيكل العظمي في neurocranium الأمامي (ANC) في الزرد 23. وقد أظهرت دراسات سابقة أن Shh على مطلوب لتكوين حزب المؤتمر الوطني الافريقي 14. حددت باستخدام بلي Shh على المغلفة الباحثون أن هذه الإشارة تشجع تكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. تم استخدام عملية زرع microbead على إثبات وجود صلة واضحة بين القنفذ الإشارات وتكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. لوحظ آخر مثال رئيسي لهذه التقنية التلاعب الأنسجة في الزرد في الدراسات حيث يدرس العلماء سيطرة النسخي من ورم أرومات الحمر السادسة والعشرون (ETS) و مجالجزيء المتعلقة ETS الجهات الفاعلة (إدارة مخاطر المؤسسات) وتورام محسن المنشط 3 (Pea3) من خلال جمعية جيل المستقبل الإشارات في وقت مبكر خلال نمو الدماغ الزرد 19. من خلال microbead تجارب زرع، أنهم كانوا قادرين على إظهار أن Fgf8 وFgf3 يمكن تنشيط ectopically التعبير عن إدارة مخاطر المؤسسات وpea3. وتوضح هذه الأمثلة فائدة بلي لتوفير نظرة ثاقبة الآليات التنموية التي تتعاون أثناء تكوين الأنسجة، والتي يمكن وصفها بشكل جيد من خلال استخدام أساليب لتقييم التعبير الجيني 41. وبالتالي، يمكن زرع microbead أن يكون وسيلة فعالة لاستكشاف الأنسجة الأخرى، مثل الأديم المتوسط ​​وسيط (IM) والذي يؤدي إلى الكلى. على وجه التحديد، فإنه يساعد في الدراسات التنموية الكلى، لمعرفة كيف جزيئات مختلفة تؤثر كليون تجزئة 42 و tubulogenesis 43،44، والعمليات التي يتم فهمها بشكل سطحي فقط في الوقت الحاضر. وعلاوة على ذلك، بدأت microbead زرع لاستخدامها في مسمارويمكن تكييف العمليات ذ تجديد في الزرد 29] وللاستخدام مع أي عدد من النماذج تجديد الجهاز، مثل التالية الاستئصال بالليزر من الأنسجة الجنينية مثل كليون 45 أو بالاشتراك مع الأساليب التي صيغت لإجراء الأبحاث مع الهياكل الكبار المقابلة 46-49. أخيرا، microbead زرع لديه القدرة على أن تستخدم في نماذج من الأمراض التي تصيب البشر، مثل السرطان 50،51 أو الأنسجة انحطاط 52،53. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح طريقة زرع microbead في الأجنة الزرد، والتي كما وصفت بالمثل من قبل باحثين آخرين، ولكن لا يظهر من خلال بروتوكولات فيديو 1. مع الحد الأدنى من الممارسة تمكنا من زرع بلي بمعدل تقريبي من 8-10 الأجنة / ساعة، والتي تتعلق جدوى هذا الإجراء مرة واحدة الباحث لديه بعض الخبرة. وتبين النتائج الموضحة في هذه الوثيقة تثبت أن حبات من مختلف ديمكن زرع imensions في مراحل مبكرة، وذلك مع الرعاية، ويمكن تطبيق هذا الأسلوب التلاعب الأنسجة مع أقل قدر من الاضطراب الجسدي إلى الجنين. واحد التحسن الذي ينبغي التأكيد هو استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead إلى الجنين. هذه القطعة غير مكلفة نسبيا وبسيطة من المعدات عن نفس القطر كما microbead، من السهل الحصول على ويساعد على تسريع عملية الزرع. يمكن قطع الخط الطولي / السوط إلى الطول المطلوب لإنتاج الشركة بعد الدقيقة أداة التعامل مع حبة، وهذا يتوقف على مهارة الباحث والتفضيل. وأخيرا، في حين وصفنا هنا كيفية التعامل مع جسديا بلي والأجنة الزرد لأداء زرع، وهذا البروتوكول لا تحدد إجراءات التعامل مع محددة للمخدرات أو الببتيدات مختلفة. بشكل عام، يجب زرع بلي المعالجة كيميائيا في الحيوان مع النفعية، لتجنب الآثار غير المرغوب فيها في مناطق أخرى من الحي، وينبغي أن يكون الباحثون أيضا فيشكلت حول مخاوف تتعلق بالسلامة المحتملة المرتبطة أي من هذه المواد الكيميائية قبل بدء دراستهم. باختصار، لقد أثبتنا طريقة بسيطة وفعالة نسبيا microbead زرع مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تستخدم المواد التي تتوافر بسهولة في المختبر. في نهاية المطاف، ونحن نأمل ان يكون هذا الدليل سوف يساعد الباحثين مع طبيعة حساسة من التلاعب الأنسجة الزرد.

الباحثين البيولوجيا التطورية تستخدم مجموعة واسعة من وسائل الخلوية والجزيئية والجينية للكشف عن الآليات التي تتحكم في كيفية تشكيل كائن حي. من بين هذه المناهج، والتلاعب الأنسجة هو أداة رئيسية في فك رموز أسئلة معقدة حول مصير الخلية، والحركة الخلوية، وتنظيم الأنسجة. طريقة واحدة لتغيير البيئات الأنسجة المحلية من خلال تطبيق الجراحي للبلي التي تستخدم لتوصيل مصدر البؤري من البروتينات أو غيرها من الجزيئات يشير الى 1. وقد نفذت على نطاق واسع هذا النوع من التلاعب التجريبية في الكلاسيكية نماذج علم الأجنة الفقارية، مثل الضفادع وفرخ 2. أصبح الزرد كائن نموذجا الفقاريات المهم لدراسة توالد ويوفر أيضا العديد من المزايا الفريدة لنمذجة مرض 3-5 كما أنهما يشتركان الحفظ وراثية عالية مع البشر 6. ولا سيما الشفافية البصرية والسابقينتطوير ternal الجنين الزرد تقدم وجهة نظر لا مثيل لها لمراقبة الأنسجة تطور الجنين 3-5. وقد ولدت تنفيذ شاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع مستودع قوية من سلالات متحولة الزرد لمزيد من الدراسة 7،8، وتحديد أساليب الفحص البديلة التي يمكن أن تتم بكفاءة على نطاق أضيق في المختبرات واحدة 9،10. مزيد من العمل التجريبي مع الزرد وقد سهلت من خلال التقدم في منهجيات المعدلة وراثيا وعكس النهج الوراثية 11،12، وكذلك الوراثة الكيميائية 13-15. تقنيات التلاعب الأنسجة، مثل تنفيذ بلي، لم تكن كما تستخدم على نطاق واسع في الزرد، ولكن مع ذلك توفر أداة مفيدة لزيادة فهم الإشارات الخلوية خلال التنمية. وقد استخدم Microbead زرع للتحقيق في عمليات تشكيل جهاز في شبكية العين الزرد16،17، 18 القلب والدماغ 19-22، العصبية قمة 23، وزعنفة 24،25. في هذه الدراسات وغيرها، وقد تم تطبيق الخرز أثناء التطور في فهم انتشار الجزيئات مما يشير 26، وكيف تؤثر التدرجات الهجرة الخلية 27 و 28 محوري الزخرفة. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بلي لتقييم آليات التجديد في الزرد البالغين 29. في الدراسات التنموية، على سبيل المثال، وفرت العمل microbead الزرد نظرة ثاقبة آليات تشكيل أطرافهم من خلال دراسات من الزعنفة الصدرية 25. برعم الزعنفة الصدرية الزرد هو مثلي إلى برعم forelimb في الماوس 30 و 31 فرخ. برعم الفقاريات أطرافهم واثنين من العقد إشارة أساسية: منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) التي تنص على محور الأمامي-لاحق من خلال التعبير عن القنفذ الصوتي (Shh على) والأهداف هوكس الجين المصب،ومرتفعات الأدمة القمي (AER) الحالي في طرف برعم الطرف، الذي يعمل على إنشاء الأقرب إلى هوية البعيدة من الأطراف من خلال التعبير عن عوامل النمو الأرومية الليفية (FGFs). وبزرع بلي صندوق الأجيال القادمة غارقة في المسوخ الوراثية SHH الزرد والمحققين حددت جمعية جيل المستقبل أمر ضروري لتقدم دورة الخلية ونمو الأطراف الفقارية 25. بالإضافة الى جمعية جيل المستقبل وShh على إشارات أجهزة الطرد المركزي التي تحدد هوية الموضعية، ودراسات رائدة باستخدام برعم فرخ الطرف حددت حمض الريتينويك (RA) كناقل التي يمكن أن تحاكي العمل في المنطقة الاستقطاب لإنشاء الأمامية إلى الخلفية هوية 32. هذه التجارب المعنية وضع شرائح صغيرة من RA غارقة ورقة هتما في أطرافهم فرخ لتقييم أرقام الزخرفة 32. وعلاوة على ذلك، فقد أجرى الباحثون دراسات أخرى أنيقة توظيف استخدام بلي، زرع الخلايا، والخارجيةالعلاجات RA في الزرد لتحديد أن RA يعمل على توفير بعيدة المدى العظة الموضعية داخل الدماغ المؤخر الزرد والأديم المتوسط ​​28. ومع ذلك، في الوقت الحاضر العديد من الأسئلة تبقى حول أدوار يشير العوامل مثل جمعية جيل المستقبل وRA خلال العديد من جوانب التنمية الفقاريات. آثار يشير من RA، بوصفها محدثة التخلق تأثير والعديد من الأجهزة 33، مثل القلب النامية البالغ عددها 34 والأسلاف الكلى، حيث يحدد RA خلايا الكلى القريبة نوع مصائر 35-39. مزيد من الفهم لهذه الموضوعات يمكن أن تستفيد كثيرا من الدراسات التجريبية باستخدام تقنيات التلاعب الأنسجة وmicrobead الزرع. في حين تم إجراء عدد أقل من الدراسات مع microbead زرع في الزرد، بالمقارنة مع نماذج مثل الفرخ، وتلك التي نفذت كانت مفيدة للغاية. أحد أسباب ندرة microbead زرع المستندة إلى الأبحاث في الجنين الزرد هو likelذ فكرة أن هناك تحديات فنية صعبة، استنادا إلى حجم الجنين، والتي تشكل عائقا أمام أداء مثل هذه التلاعبات بنجاح. ومع ذلك، زرع microbead في الأجنة الزرد التي يمكن استخلاصها مع الممارسة والمساعدة من خلال الملاحظة البصرية لهذه التقنية، وبالتالي يمكن متابعتها باعتبارها وسيلة لاستجواب آليات التنمية. هنا، علينا أن نظهر أن التطبيق الدقيق لmicrobead في الجنين الزرد، والتي يمكن استخدامها لإجراء مجموعة واسعة من فحوصات على تكوين الأنسجة والتشكل الخلوي.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

برزت الزرد كنظام نموذج الجيني قيمة لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض. الزرد تبادل درجة عالية من الحفظ الجيني، فضلا عن التشابه في العمليات الخلوية والجزيئية والفيزيولوجية، والفقاريات الأخرى بما في ذلك البشر. أثناء تطور الجنين في وقت مبكر والأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح للباحثين لتصور ديناميات توالد باستخدام stereomicroscope بسيط. زرع Microbead هو الطريقة التي تمكن التلاعب الأنسجة من خلال تغيير العوامل في البيئات المحلية. هذا يسمح للباحثين لفحص آثار أي عدد من الجزيئات يشير المصالح، مثل الببتيدات يفرز عند نقاط المكانية والزمانية محددة داخل الجنين النامي. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لكيفية التعامل مع وحبات الزرع خلال تطوير الزرد في وقت مبكر.

عدة أنواع من أدوات التلاعب مفيدة للتعامل مع بلي خلال التطبيقات البحثية (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، قالب الاغاروز بسيط مع آبار صغيرة يمكن استخدامها لعقد الجنين الزرد، وهو أمر حيوي لتنفيذ هذه التجارب في الوقت المناسب وبطريقة فعالة (الشكل 1). وغرس microbead لا يمكن أن يؤديها في موقف المكانية والزمانية مرحلة من الفائدة، الذي يسمح للباحثين لتضييق نافذة معينة من العمل لجزيء من الفائدة. هنا، تم زرع بلي واحدة في الأجنة الزرد في مرحلة ذيل برعم أو في نقاط زمنية لاحقة خلال مراحل somitogenesis (الشكل 3). اثنين بلي مختلفة الحجم، تشطف مع حل قارع الأجراس وحده، تم استخدامها في هذه التظاهرة بروتوكول (الشكل 3A، 3B و 3C). هذا الزرع microbead في غياب أي مترافقجزيئات صغيرة تبين أن حبة زرع لا يمكن أن يتحقق من دون آثار المورفولوجية الجسيمة خلال التنمية السليمة للجنين الزرد (الشكل 4). والتجريبي قد تواجه صعوبات في المناورة microbead في حفرة ثقب التي أدلى بها إبرة التنغستن فوق الجنين. لتحقيق أفضل معالجة للmicrobead مرة واحدة وضعت على الجنين عن طريق إبرة صغيرة، يمكن استخدام الخط الطولي / أداة الرموش. وهذا يمكن أن تصاغ مع تسليط طبيعي القطط أو الكلاب شعيرات، على الرغم من غيرها من شعيرات الرموش الطبيعية أو الاصطناعية يمكن استخدامها (الشكل 1). ودفع لطيف من microbead مع أي الإبرة التنغستن أو أداة الطولي يجب أن نرى microbead تغرق في حل رينغر من العفن. مرة واحدة وقد غرقت microbead في القالب كان ينبغي نقلها لمسافات كبيرة إذا لزم الأمر باستخدام إبرة التنغستن ومرة ​​واحدة فوق الجنين الأداة إبرة أو الطولي يمكن استخدامها لpositioن microbead إلى الجنين. نجاح زرع microbead يمكن قياس على الفور من خلال التصور في stereomicroscope، وحبة ستبقى في وضع مستقر في الأنسجة. لتقييم الموقف حبة مع مرور الوقت، ولا يمكن تصوير كل عينة الجنين من خلال العيش الوقت دورة التصوير الفوتوغرافي أو التحقق في فترات دورية (كما هو مبين في الشكل 4) لضمان أن موقع حبة لم تحول خلال مدة التجربة بسبب الأنسجة الذاتية التشكل. فهم موقف حبة مع مرور الوقت أمر بالغ الأهمية لتفسير أكثر استنارة من النتائج، مثل تقييم تأثير جزيء صغير على النسيج المستهدف أو العملية التنموية. فإن استخدام هذه الخطوات المذكورة أعلاه توفر بيئة مثالية حيث لإطمر بلي في الجنين الزرد في الوقت المطلوب والموقف. في تجربتنا، مستخدمين المبتدئين من هذا البروتوكول microbead زرع اكتسبت عادة في شمال شرق المهارةcessary لأداء زرع الجراحية ثابت من بلي في الجنين الزرد بعد حوالي أسبوع واحد من الممارسة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> الشكل 1. الأدوات المستخدمة لأداء microbead الزرع. (A) علبة زرع حبة (يسار، 15 سم القطر) مع قوالب الجنين (على اليسار) وعلبة microbead الحضانة (على اليمين، 6 سم القطر). هذا صينية تعمل تمكن الباحث لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب لmicrobead الزرع، وأن تكون لديهم بلي مستعدة لزرع على مقربة في محطة المجهر. وينبغي حضنت بلي في جزيء صغير (ق) و / أو السيارة ثم تشطف في لوحة microbead منفصلة (اليمين) قبل وضعها في علبة زرع حبة أن يتم وضع تحت المجهر محطة. (B) وسوف تستخدم اثنين من أزواج من ملقط غرامة لإزالة تشوريعلى المحيطة بكل الجنين الزرد وأيضا لكسر نهاية الإبرة microcapillary. سيتم توظيف (C) A التنغستن إبرة لجعل ثقب دقيق جدا في الجنين الزرد التي لوضع microbead. (D) وسيتم استخدام ماصة نقل microcapillary لالتقاط ووضع على microbead على رأس الجنين الزرد بالقرب من موقع للثقب. (E) والطولي / أداة السوط سيتيح تحديد المواقع لطيف من microbead في موقع شق داخل الجنين التي تم إجراؤها من قبل الإبرة التنغستن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> الشكل 2. تخطيطي لإجراء microbead الزرع. (A) A غرس صينية microbead مع بلي soakiنانوغرام في محلول الغسيل المطلوبة تم إعدادها في إطار محطة stereomicroscope، والأجنة وضعه مع الأنسجة متجهة لأعلى. (B) عن طريق إبرة التنغستن، شق صغير في الجنين ويمكن إجراء مع حركة قوية بعد طفيفة. (C) باستخدام ماصة نقل microcapillary، يمكن التقاطها في microbead المرغوب فيه من الغرفة microbead حضانة في علبة، وتقع على الحق، وتقديمهم إلى المقصورة اليسرى حيث يقع في منطقة العمل الجنين. يجب أن تودع في microbead بالقرب من موقع الشق، ثم وضعه برفق في موقع شق أدلى بها الإبرة التنغستن باستخدام الطولي / أداة الرموش. بمجرد ناور على microbead في موقع شق، ينبغي مطوي في الأنسجة (بعيدا عن شق) لوضع مستقر وmicrobead ومنع حركة لاحقة من الجنين مع استمرار التنمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>تأجير انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> يمكن زرع الشكل 3. بلي إلى الأجنة في مراحل النمو المختلفة. تم زرعها (A) الأجنة الزرد مع microbead (قطرها حوالي 50 ميكرون) في الجذع في مرحلة ذيل مهدها. عندما بحثت في ال 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، والأجنة وضعت بشكل طبيعي وأظهرت microbead الحد الأدنى من الحركة أثناء مرور الوقت التنموي. (B) الأجنة الزرد مزروع مع بلي (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في الكيس المحي في المرحلة 3 الجسيدة (ق ق) المعروضة التطور الطبيعي لحركة حبة صغيرة نسبيا مع مرور الوقت. (C) بلي أكبر (قطرها حوالي 70 ميكرون) زرعت في جنين 7 SS أظهرت بالمثل تطور لاحق العادية، وكذلك مصغرةالقانون النموذجي للتحكيم إن وجدت الحركة من موقع الزرع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> الرقم 4. تطوير الإجمالي للجنين الزرد هو رابط الجأش التي كتبها وجود microbead خلال 72 hpbi. تم زرع الأجنة الزرد مع بلي غارقة في حل رينغر (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في المرحلة 7 الجسيدة (SS). تم إدراج كل microbead جراحيا في الجذع، وبين القطع البدنية النمطية 3 و 4. لم يترافق وجود حبة مع العيوب الظاهرة التنموية في 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، 48 hpbi، أو 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Immunology and Infection

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>توضيح سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة في تطور اليكتوم البصري لسمك الزرد

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: استخدام الزرد لاستكشاف هجرة الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الدماغ

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

الحقن المجهري للبطين الدماغي لعديد السكاريد الشحمي في يرقات الزرد لتقييم الالتهاب العصبي والسمية العصبية

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Microbead زرع الأجنة الزرد

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد

الحقن المجهري للبطين الدماغي لعديد السكاريد الشحمي في يرقات الزرد لتقييم الالتهاب العصبي والسمية العصبية