وأيد هذا العمل عن طريق منح DP2OD008470 المعاهد الوطنية للصحة.

تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام. إعداد الحل 1. رينغر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل من 116 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.9 ملي بوكل، 3.6 ملي CaCl 2، و 5 ملي HEPES مع عالى النقاء H 2 O من خلال التحريك المستمر لتفادي أي ترسيب الملح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة الأملاح وبينما الحل لا يزال يتحرك، إضافة 100 وحدة / مل البنسلين في و 100 ميكروغرام لكل مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة جميع المضادات الحيوية والأملاح، نفذ التعقيم مرشح من الحل وتخزينها في حاوية معقمة. ملاحظة: N-الفنيل (1-فينيل-2-ثيوريا) أو PTU يمكن أن تضاف إلى الحل رينغر لمنع تشكيل الصباغ في حبة الأجنة مزروع من دون عواقب سلبية على صحة الجنين. لإعداد / تصبغ عرقلة الحل رينغر، واستخدام تركيزاتtration من 0.003٪ PTU. نظرا لتركيز منخفض من PTU التي يمكن ان تضاف ينصح بأن حجم أكبر من الحل رينغر يتم، على الأقل 1 L، لتجنب إضافة كميات ضئيلة من مسحوق PTU. إضافة PTU خلال الخطوة 1.2، في حين أن الحل هو التحريك. </li></ol> 2. تريكين إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 غرام من إيثيل 3-أمينوبنزوات الملح methanesulfonate (تريكين) لكل لتر من محلول زائد 0.1 M تريس، من 1 M الأسهم متوازن لدرجة الحموضة من 9.5 و المصنوع من عالى النقاء H 2 O. ملاحظة: سيتم استخدام تريكين إلى الموت ببطء الأجنة الزرد في نقطة الوقت المطلوب لفحص حبة الظواهر الزرع. </li></ol> 3. E3 إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل من 0،25 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 12.5 ملي CaCl 2، و 16.6 ملي MgSO 4-1 لتر من الماء عالى النقاء لخلق 1 لتر من E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق إلى حل E3 لمنع نمو الفطريات. </li></ol>4. إبر سحب لنقل Microbead <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النار مصقول البورسليكات الزجاج مع خيوط في لOD: 1.0 مم، ID: 0.5 ملم، بطول 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الزجاج borosilicated إلى مجتذب micropipette لإعداد إبر رفيعة. ملاحظة: الأبعاد الأربعة التالية يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لسحب الإبر: الحرارة = 540، سحب = 245، السرعة = 200، والوقت = 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد سحب عدد كاف من الإبر، وتخزينها في البلاستيك مغطى أطباق بتري المتمركزة على شرائط من الصلصال أو شريط لاصق لمنع كسر رأس الإبرة، حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخفض رأس إبرة لحجم تجويف المطلوب، استخدام زوج من ملقط غرامة ليسجل نهاية الإبرة. ملاحظة: سوف إبرة حجم تتحمل تختلف تبعا لحجم microbead يجري استخدامها وكذلك تفضيلات التعامل مع المستخدم. وهناك نقطة انطلاق جيدة لأحجام الحرفية تحمل في نطاق بين 100 و 200 ميكرون إذا كان سيتم استخدام بلي تتراوح 50-100 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PRIOص الاستخدام، وادخال الإبرة قلصت إلى حامل الأنابيب الشعرية إلى صياغة وثيقة نقل microbead الانتهاء. </li></ol> 5. الشارب / لاش إعداد أداة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الخط الطولي، السوط، أو غيرها من قطعة صغيرة بعد شركة من الطبيعي أو الاصطناعي خيوط الشعر. قطع بالقرب من قاعدة للخيوط في زاوية 45 درجة. تلتزم الخط الطولي لmicropipette غيض-P 1000 باستخدام دائم لاصق الغراء واضح. </li></ol> 6. Microbead زرع صينية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 2 غرام من الاغاروز مع 100 مل من محلول E3 لجعل 2٪ E3 agarose هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الحل الاغاروز 2٪ لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية في 250 مل دورق مخروطي، يحوم القارورة كل 30 ثانية من أجل تجنب جل من السطح من جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ غطاء لمدة 60 مم × 15 مم طبق بتري وضعه في أكبر 150 مم × 15 مم الطبق مع الداخلية التي تواجه التصاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب جل الاغاروز الساخن إلى 150 مم × 15 مم طبق بتري، والتأكد من أن يرسو أسفلغطاء للطبق أصغر مع السبابة. ملاحظة: السماح طبقة رقيقة من الاغاروز تحت غطاء من طبق أصغر لإزالة التكثيف التي ستشكل عند صب جل. وهذا سيجعل حبات السهل أن نرى تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يبرد الاغاروز، ولكن قبل أن يتصلب، ضع القالب بشكل جيد على هلام. وهذا سوف يسمح لوضع أسهل من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: من أجل تجنب فقاعات في الآبار، ضع القالب ببطء في زاوية حتى يعوم على الجزء العلوي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام microspatula، وإزالة بعناية القالب جيدا مرة واحدة وقد عزز الجل. إضافة E3 الحل وتخزينها في 4 ° C. </li></ol> 7. الأجنة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرف التزاوج، مفصولة فواصل، عن طريق ملء لهم حتى مع الماء النظام، ومن ثم وضع الذكور البالغين الزرد (ق) والإناث (ق) أزواج في غرف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض المخصب باستخدام غرامة سلكية مصفاة (المراحل الجنينية سوف تختلف قليلا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع البويضة الملقحة في، 10 سم طبق بتري قطر نظيفة من خلال تحويل مصفاة رأسا على عقب والشطف مع تيار غرامة E3 حتى لا توجد البيض تترك في مصفاة، وهناك ما يقرب من 25 مل من محلول E3 في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع وتقسيم البيض في عدة أطباق (حوالي 50-60 بيضة في طبق) لتجنب الاكتظاظ، والتي قد تؤدي إلى اتواقت التنموي داخل مخلب وجعل جمع المرجوة الأوقات نقاط صعبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في حل E3 في 28.5 ° C لتمكين التقييم التنموي وفقا لمعيار الزرد سلسلة انطلاق 40. ملاحظة: يجب أن يتم نقل الأجنة إلى E3 / PTU في 24 التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تطور الصباغ إذا التلاعب في مراحل قديمة تتطلب الوضوح البصري. </li></ol> 8. حبة زرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بلي في المطلوب تركيز جزيء اختبار أو ليالي السيارة المقابلةolution للمرة المطلوبة في حجم مناسب. ملاحظة: الباحثة يمكن استخدام أطباق بتري معقمة تتراوح بين 3-6 سم في القطر، أو لوحات متعددة أيضا، وكلاهما تمكين التصور من بلي في الحل. قد تختلف الوقت اعتمادا على نوع وكمية من جزيء من الفائدة، والباحث يجب الرجوع إلى الشركة المصنعة أو توصيات تنشر لمدة الحضانة وغيرها من الجوانب مثل الحساسية للضوء والحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد وصلت الأجنة في نقطة زمنية التنموية المرجوة، وإزالة الأجنة من chorions الخاصة بهم باستخدام ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في حل قارع الأجراس التي تمت تصفيتها مع المضادات الحيوية لمدة 10 دقيقة حتى يتأقلم منهم إلى الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الأجنة والتأقلم، ونقل بلي في لوحة microbead التي تقع داخل علبة زرع وشطف لهم في حل قارع الأجراس لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: زرع حبات بعد 50 دقيقة بعد الوصول إلى هذه النقطة. هذا ثسوء تقليل احتمال أن أحدا لن زرع حبة مع تركيز أقل من جزيء من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة من الأجنة في آبار من الدرج microbead الزرع، مع الحرص على توجيههم حتى مجال الاهتمام حيث سيتم زرع microbead يمكن الوصول إليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير على الجنين باستخدام إبرة التنغستن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل microbead على الجنين باستخدام ماصة نقل microcapillary: الاكتئاب لمبة من ماصة، وسحب بلطف microbead في العمود الشعري، ومن ثم الافراج عن الضغط لنقل microbead في الوجهة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead داخل الجنين. ملاحظة: تأكد من وضع microbead في الأنسجة بعيدا من موقع شق ذلك لن يتم طرد microbead من الجنين لأنه يشفي. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

على مدى القرن الماضي، وفهم خطة الهيئة الزخرفة وتوالد شهدت تقدما هائلة. وكانت تقنيات التلاعب الأنسجة الحيوية في الكشف عن المعلومات الأساسية عن هذه العمليات الحيوية. التعديل الوراثي هو واحد من أكثر الطرق شيوعا للتحقق من وظيفة الجين، وطرق التحليل فسيفساء، مثل زرع الخلايا، وتوفر مناهج مفيدة لفهم استقلالية وظيفة الجين. يوفر زرع Microbead مكان آخر لاستجواب كيف جزيئات خاصة تغيير ديناميات النمو، كما تمكن هذه الطريقة الباحث إلى تغيير بيئة الأنسجة المحلية من خلال تقديم إشارات جزيئات أو مثبطات. وهناك مجموعة من بلي مختلفة متاحة تجاريا، والتي أحجام مختلفة وغيرها من الخصائص الفيزيائية وجود (على سبيل المثال، تهمة) بحيث أنها يمكن أن تستخدم للظروف تجريبية من الفائدة. وبالتالي، من خلال زرع بلي التي هي غارقة في البروتين أو كيماويةكال المصالح داخل كائن حي، يمكن للباحثين التحقيق في آثار محلية خلال تطوير وإيجاد صلة بين الجينات أو جزيء من الفائدة وبشكل خاص النمط الظاهري البيولوجي (ق). دراسات مثل تلك التي تقوم بها وادا وزملاؤه تستخدم microbead زرع من أجل تقييم تأثير زيادة الإشارات القنفذ في الزخرفة الهيكل العظمي في neurocranium الأمامي (ANC) في الزرد 23. وقد أظهرت دراسات سابقة أن Shh على مطلوب لتكوين حزب المؤتمر الوطني الافريقي 14. حددت باستخدام بلي Shh على المغلفة الباحثون أن هذه الإشارة تشجع تكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. تم استخدام عملية زرع microbead على إثبات وجود صلة واضحة بين القنفذ الإشارات وتكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. لوحظ آخر مثال رئيسي لهذه التقنية التلاعب الأنسجة في الزرد في الدراسات حيث يدرس العلماء سيطرة النسخي من ورم أرومات الحمر السادسة والعشرون (ETS) و مجالجزيء المتعلقة ETS الجهات الفاعلة (إدارة مخاطر المؤسسات) وتورام محسن المنشط 3 (Pea3) من خلال جمعية جيل المستقبل الإشارات في وقت مبكر خلال نمو الدماغ الزرد 19. من خلال microbead تجارب زرع، أنهم كانوا قادرين على إظهار أن Fgf8 وFgf3 يمكن تنشيط ectopically التعبير عن إدارة مخاطر المؤسسات وpea3. وتوضح هذه الأمثلة فائدة بلي لتوفير نظرة ثاقبة الآليات التنموية التي تتعاون أثناء تكوين الأنسجة، والتي يمكن وصفها بشكل جيد من خلال استخدام أساليب لتقييم التعبير الجيني 41. وبالتالي، يمكن زرع microbead أن يكون وسيلة فعالة لاستكشاف الأنسجة الأخرى، مثل الأديم المتوسط ​​وسيط (IM) والذي يؤدي إلى الكلى. على وجه التحديد، فإنه يساعد في الدراسات التنموية الكلى، لمعرفة كيف جزيئات مختلفة تؤثر كليون تجزئة 42 و tubulogenesis 43،44، والعمليات التي يتم فهمها بشكل سطحي فقط في الوقت الحاضر. وعلاوة على ذلك، بدأت microbead زرع لاستخدامها في مسمارويمكن تكييف العمليات ذ تجديد في الزرد 29] وللاستخدام مع أي عدد من النماذج تجديد الجهاز، مثل التالية الاستئصال بالليزر من الأنسجة الجنينية مثل كليون 45 أو بالاشتراك مع الأساليب التي صيغت لإجراء الأبحاث مع الهياكل الكبار المقابلة 46-49. أخيرا، microbead زرع لديه القدرة على أن تستخدم في نماذج من الأمراض التي تصيب البشر، مثل السرطان 50،51 أو الأنسجة انحطاط 52،53. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح طريقة زرع microbead في الأجنة الزرد، والتي كما وصفت بالمثل من قبل باحثين آخرين، ولكن لا يظهر من خلال بروتوكولات فيديو 1. مع الحد الأدنى من الممارسة تمكنا من زرع بلي بمعدل تقريبي من 8-10 الأجنة / ساعة، والتي تتعلق جدوى هذا الإجراء مرة واحدة الباحث لديه بعض الخبرة. وتبين النتائج الموضحة في هذه الوثيقة تثبت أن حبات من مختلف ديمكن زرع imensions في مراحل مبكرة، وذلك مع الرعاية، ويمكن تطبيق هذا الأسلوب التلاعب الأنسجة مع أقل قدر من الاضطراب الجسدي إلى الجنين. واحد التحسن الذي ينبغي التأكيد هو استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead إلى الجنين. هذه القطعة غير مكلفة نسبيا وبسيطة من المعدات عن نفس القطر كما microbead، من السهل الحصول على ويساعد على تسريع عملية الزرع. يمكن قطع الخط الطولي / السوط إلى الطول المطلوب لإنتاج الشركة بعد الدقيقة أداة التعامل مع حبة، وهذا يتوقف على مهارة الباحث والتفضيل. وأخيرا، في حين وصفنا هنا كيفية التعامل مع جسديا بلي والأجنة الزرد لأداء زرع، وهذا البروتوكول لا تحدد إجراءات التعامل مع محددة للمخدرات أو الببتيدات مختلفة. بشكل عام، يجب زرع بلي المعالجة كيميائيا في الحيوان مع النفعية، لتجنب الآثار غير المرغوب فيها في مناطق أخرى من الحي، وينبغي أن يكون الباحثون أيضا فيشكلت حول مخاوف تتعلق بالسلامة المحتملة المرتبطة أي من هذه المواد الكيميائية قبل بدء دراستهم. باختصار، لقد أثبتنا طريقة بسيطة وفعالة نسبيا microbead زرع مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تستخدم المواد التي تتوافر بسهولة في المختبر. في نهاية المطاف، ونحن نأمل ان يكون هذا الدليل سوف يساعد الباحثين مع طبيعة حساسة من التلاعب الأنسجة الزرد.

الباحثين البيولوجيا التطورية تستخدم مجموعة واسعة من وسائل الخلوية والجزيئية والجينية للكشف عن الآليات التي تتحكم في كيفية تشكيل كائن حي. من بين هذه المناهج، والتلاعب الأنسجة هو أداة رئيسية في فك رموز أسئلة معقدة حول مصير الخلية، والحركة الخلوية، وتنظيم الأنسجة. طريقة واحدة لتغيير البيئات الأنسجة المحلية من خلال تطبيق الجراحي للبلي التي تستخدم لتوصيل مصدر البؤري من البروتينات أو غيرها من الجزيئات يشير الى 1. وقد نفذت على نطاق واسع هذا النوع من التلاعب التجريبية في الكلاسيكية نماذج علم الأجنة الفقارية، مثل الضفادع وفرخ 2. أصبح الزرد كائن نموذجا الفقاريات المهم لدراسة توالد ويوفر أيضا العديد من المزايا الفريدة لنمذجة مرض 3-5 كما أنهما يشتركان الحفظ وراثية عالية مع البشر 6. ولا سيما الشفافية البصرية والسابقينتطوير ternal الجنين الزرد تقدم وجهة نظر لا مثيل لها لمراقبة الأنسجة تطور الجنين 3-5. وقد ولدت تنفيذ شاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع مستودع قوية من سلالات متحولة الزرد لمزيد من الدراسة 7،8، وتحديد أساليب الفحص البديلة التي يمكن أن تتم بكفاءة على نطاق أضيق في المختبرات واحدة 9،10. مزيد من العمل التجريبي مع الزرد وقد سهلت من خلال التقدم في منهجيات المعدلة وراثيا وعكس النهج الوراثية 11،12، وكذلك الوراثة الكيميائية 13-15. تقنيات التلاعب الأنسجة، مثل تنفيذ بلي، لم تكن كما تستخدم على نطاق واسع في الزرد، ولكن مع ذلك توفر أداة مفيدة لزيادة فهم الإشارات الخلوية خلال التنمية. وقد استخدم Microbead زرع للتحقيق في عمليات تشكيل جهاز في شبكية العين الزرد16،17، 18 القلب والدماغ 19-22، العصبية قمة 23، وزعنفة 24،25. في هذه الدراسات وغيرها، وقد تم تطبيق الخرز أثناء التطور في فهم انتشار الجزيئات مما يشير 26، وكيف تؤثر التدرجات الهجرة الخلية 27 و 28 محوري الزخرفة. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بلي لتقييم آليات التجديد في الزرد البالغين 29. في الدراسات التنموية، على سبيل المثال، وفرت العمل microbead الزرد نظرة ثاقبة آليات تشكيل أطرافهم من خلال دراسات من الزعنفة الصدرية 25. برعم الزعنفة الصدرية الزرد هو مثلي إلى برعم forelimb في الماوس 30 و 31 فرخ. برعم الفقاريات أطرافهم واثنين من العقد إشارة أساسية: منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) التي تنص على محور الأمامي-لاحق من خلال التعبير عن القنفذ الصوتي (Shh على) والأهداف هوكس الجين المصب،ومرتفعات الأدمة القمي (AER) الحالي في طرف برعم الطرف، الذي يعمل على إنشاء الأقرب إلى هوية البعيدة من الأطراف من خلال التعبير عن عوامل النمو الأرومية الليفية (FGFs). وبزرع بلي صندوق الأجيال القادمة غارقة في المسوخ الوراثية SHH الزرد والمحققين حددت جمعية جيل المستقبل أمر ضروري لتقدم دورة الخلية ونمو الأطراف الفقارية 25. بالإضافة الى جمعية جيل المستقبل وShh على إشارات أجهزة الطرد المركزي التي تحدد هوية الموضعية، ودراسات رائدة باستخدام برعم فرخ الطرف حددت حمض الريتينويك (RA) كناقل التي يمكن أن تحاكي العمل في المنطقة الاستقطاب لإنشاء الأمامية إلى الخلفية هوية 32. هذه التجارب المعنية وضع شرائح صغيرة من RA غارقة ورقة هتما في أطرافهم فرخ لتقييم أرقام الزخرفة 32. وعلاوة على ذلك، فقد أجرى الباحثون دراسات أخرى أنيقة توظيف استخدام بلي، زرع الخلايا، والخارجيةالعلاجات RA في الزرد لتحديد أن RA يعمل على توفير بعيدة المدى العظة الموضعية داخل الدماغ المؤخر الزرد والأديم المتوسط ​​28. ومع ذلك، في الوقت الحاضر العديد من الأسئلة تبقى حول أدوار يشير العوامل مثل جمعية جيل المستقبل وRA خلال العديد من جوانب التنمية الفقاريات. آثار يشير من RA، بوصفها محدثة التخلق تأثير والعديد من الأجهزة 33، مثل القلب النامية البالغ عددها 34 والأسلاف الكلى، حيث يحدد RA خلايا الكلى القريبة نوع مصائر 35-39. مزيد من الفهم لهذه الموضوعات يمكن أن تستفيد كثيرا من الدراسات التجريبية باستخدام تقنيات التلاعب الأنسجة وmicrobead الزرع. في حين تم إجراء عدد أقل من الدراسات مع microbead زرع في الزرد، بالمقارنة مع نماذج مثل الفرخ، وتلك التي نفذت كانت مفيدة للغاية. أحد أسباب ندرة microbead زرع المستندة إلى الأبحاث في الجنين الزرد هو likelذ فكرة أن هناك تحديات فنية صعبة، استنادا إلى حجم الجنين، والتي تشكل عائقا أمام أداء مثل هذه التلاعبات بنجاح. ومع ذلك، زرع microbead في الأجنة الزرد التي يمكن استخلاصها مع الممارسة والمساعدة من خلال الملاحظة البصرية لهذه التقنية، وبالتالي يمكن متابعتها باعتبارها وسيلة لاستجواب آليات التنمية. هنا، علينا أن نظهر أن التطبيق الدقيق لmicrobead في الجنين الزرد، والتي يمكن استخدامها لإجراء مجموعة واسعة من فحوصات على تكوين الأنسجة والتشكل الخلوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

برزت الزرد كنظام نموذج الجيني قيمة لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض. الزرد تبادل درجة عالية من الحفظ الجيني، فضلا عن التشابه في العمليات الخلوية والجزيئية والفيزيولوجية، والفقاريات الأخرى بما في ذلك البشر. أثناء تطور الجنين في وقت مبكر والأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح للباحثين لتصور ديناميات توالد باستخدام stereomicroscope بسيط. زرع Microbead هو الطريقة التي تمكن التلاعب الأنسجة من خلال تغيير العوامل في البيئات المحلية. هذا يسمح للباحثين لفحص آثار أي عدد من الجزيئات يشير المصالح، مثل الببتيدات يفرز عند نقاط المكانية والزمانية محددة داخل الجنين النامي. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لكيفية التعامل مع وحبات الزرع خلال تطوير الزرد في وقت مبكر.

عدة أنواع من أدوات التلاعب مفيدة للتعامل مع بلي خلال التطبيقات البحثية (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، قالب الاغاروز بسيط مع آبار صغيرة يمكن استخدامها لعقد الجنين الزرد، وهو أمر حيوي لتنفيذ هذه التجارب في الوقت المناسب وبطريقة فعالة (الشكل 1). وغرس microbead لا يمكن أن يؤديها في موقف المكانية والزمانية مرحلة من الفائدة، الذي يسمح للباحثين لتضييق نافذة معينة من العمل لجزيء من الفائدة. هنا، تم زرع بلي واحدة في الأجنة الزرد في مرحلة ذيل برعم أو في نقاط زمنية لاحقة خلال مراحل somitogenesis (الشكل 3). اثنين بلي مختلفة الحجم، تشطف مع حل قارع الأجراس وحده، تم استخدامها في هذه التظاهرة بروتوكول (الشكل 3A، 3B و 3C). هذا الزرع microbead في غياب أي مترافقجزيئات صغيرة تبين أن حبة زرع لا يمكن أن يتحقق من دون آثار المورفولوجية الجسيمة خلال التنمية السليمة للجنين الزرد (الشكل 4). والتجريبي قد تواجه صعوبات في المناورة microbead في حفرة ثقب التي أدلى بها إبرة التنغستن فوق الجنين. لتحقيق أفضل معالجة للmicrobead مرة واحدة وضعت على الجنين عن طريق إبرة صغيرة، يمكن استخدام الخط الطولي / أداة الرموش. وهذا يمكن أن تصاغ مع تسليط طبيعي القطط أو الكلاب شعيرات، على الرغم من غيرها من شعيرات الرموش الطبيعية أو الاصطناعية يمكن استخدامها (الشكل 1). ودفع لطيف من microbead مع أي الإبرة التنغستن أو أداة الطولي يجب أن نرى microbead تغرق في حل رينغر من العفن. مرة واحدة وقد غرقت microbead في القالب كان ينبغي نقلها لمسافات كبيرة إذا لزم الأمر باستخدام إبرة التنغستن ومرة ​​واحدة فوق الجنين الأداة إبرة أو الطولي يمكن استخدامها لpositioن microbead إلى الجنين. نجاح زرع microbead يمكن قياس على الفور من خلال التصور في stereomicroscope، وحبة ستبقى في وضع مستقر في الأنسجة. لتقييم الموقف حبة مع مرور الوقت، ولا يمكن تصوير كل عينة الجنين من خلال العيش الوقت دورة التصوير الفوتوغرافي أو التحقق في فترات دورية (كما هو مبين في الشكل 4) لضمان أن موقع حبة لم تحول خلال مدة التجربة بسبب الأنسجة الذاتية التشكل. فهم موقف حبة مع مرور الوقت أمر بالغ الأهمية لتفسير أكثر استنارة من النتائج، مثل تقييم تأثير جزيء صغير على النسيج المستهدف أو العملية التنموية. فإن استخدام هذه الخطوات المذكورة أعلاه توفر بيئة مثالية حيث لإطمر بلي في الجنين الزرد في الوقت المطلوب والموقف. في تجربتنا، مستخدمين المبتدئين من هذا البروتوكول microbead زرع اكتسبت عادة في شمال شرق المهارةcessary لأداء زرع الجراحية ثابت من بلي في الجنين الزرد بعد حوالي أسبوع واحد من الممارسة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> الشكل 1. الأدوات المستخدمة لأداء microbead الزرع. (A) علبة زرع حبة (يسار، 15 سم القطر) مع قوالب الجنين (على اليسار) وعلبة microbead الحضانة (على اليمين، 6 سم القطر). هذا صينية تعمل تمكن الباحث لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب لmicrobead الزرع، وأن تكون لديهم بلي مستعدة لزرع على مقربة في محطة المجهر. وينبغي حضنت بلي في جزيء صغير (ق) و / أو السيارة ثم تشطف في لوحة microbead منفصلة (اليمين) قبل وضعها في علبة زرع حبة أن يتم وضع تحت المجهر محطة. (B) وسوف تستخدم اثنين من أزواج من ملقط غرامة لإزالة تشوريعلى المحيطة بكل الجنين الزرد وأيضا لكسر نهاية الإبرة microcapillary. سيتم توظيف (C) A التنغستن إبرة لجعل ثقب دقيق جدا في الجنين الزرد التي لوضع microbead. (D) وسيتم استخدام ماصة نقل microcapillary لالتقاط ووضع على microbead على رأس الجنين الزرد بالقرب من موقع للثقب. (E) والطولي / أداة السوط سيتيح تحديد المواقع لطيف من microbead في موقع شق داخل الجنين التي تم إجراؤها من قبل الإبرة التنغستن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> الشكل 2. تخطيطي لإجراء microbead الزرع. (A) A غرس صينية microbead مع بلي soakiنانوغرام في محلول الغسيل المطلوبة تم إعدادها في إطار محطة stereomicroscope، والأجنة وضعه مع الأنسجة متجهة لأعلى. (B) عن طريق إبرة التنغستن، شق صغير في الجنين ويمكن إجراء مع حركة قوية بعد طفيفة. (C) باستخدام ماصة نقل microcapillary، يمكن التقاطها في microbead المرغوب فيه من الغرفة microbead حضانة في علبة، وتقع على الحق، وتقديمهم إلى المقصورة اليسرى حيث يقع في منطقة العمل الجنين. يجب أن تودع في microbead بالقرب من موقع الشق، ثم وضعه برفق في موقع شق أدلى بها الإبرة التنغستن باستخدام الطولي / أداة الرموش. بمجرد ناور على microbead في موقع شق، ينبغي مطوي في الأنسجة (بعيدا عن شق) لوضع مستقر وmicrobead ومنع حركة لاحقة من الجنين مع استمرار التنمية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>تأجير انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> يمكن زرع الشكل 3. بلي إلى الأجنة في مراحل النمو المختلفة. تم زرعها (A) الأجنة الزرد مع microbead (قطرها حوالي 50 ميكرون) في الجذع في مرحلة ذيل مهدها. عندما بحثت في ال 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، والأجنة وضعت بشكل طبيعي وأظهرت microbead الحد الأدنى من الحركة أثناء مرور الوقت التنموي. (B) الأجنة الزرد مزروع مع بلي (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في الكيس المحي في المرحلة 3 الجسيدة (ق ق) المعروضة التطور الطبيعي لحركة حبة صغيرة نسبيا مع مرور الوقت. (C) بلي أكبر (قطرها حوالي 70 ميكرون) زرعت في جنين 7 SS أظهرت بالمثل تطور لاحق العادية، وكذلك مصغرةالقانون النموذجي للتحكيم إن وجدت الحركة من موقع الزرع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> الرقم 4. تطوير الإجمالي للجنين الزرد هو رابط الجأش التي كتبها وجود microbead خلال 72 hpbi. تم زرع الأجنة الزرد مع بلي غارقة في حل رينغر (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في المرحلة 7 الجسيدة (SS). تم إدراج كل microbead جراحيا في الجذع، وبين القطع البدنية النمطية 3 و 4. لم يترافق وجود حبة مع العيوب الظاهرة التنموية في 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، 48 hpbi، أو 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.0K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

فعالية "تجريد الهواء" في "اثنين من أسماك السلمون"، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus Mykiss) وسمك السلمون المرقط البنى (Salmo Trutta مورفى فريو)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...