עבודה זו נתמכה על ידי מימון למעבדת מחקר Wingert מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרץ # ענק הפרס 5-FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים פול ט &#39;Kroeger, ג&#39; וניור למתן משוב ביקורתי על כתב היד. אנו מודים לצוות מהמחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטר דאם על מסירותם היוצאת מן הכלל בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברי researהמעבדה ch להערות, הדיונים שלהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

גנטיקה כימית בדג הזברה יכולה לעשות השפעה קריטית על ההתקדמות של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מספק שיטת תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם רצון לקריאה החוצה, בצורה יעילה ומאפשר צוות בודד או קטן לנהל מסך מולקולה קטן. שיטה המינימלית של משאביי-זה מרחיבה את הכדאיות של גנטיקה כימית לקבוצות מחקר רבות. באופן ספציפי, אסטרטגית מסך זה מספקת אלטרנטיבה חשובה לשימוש במכשור רובוטי, כמו מערכות כאלה הן לא רחבה נגישות בכל מחלקות מחקר. מסך במדריך זה מאפשר לו אדם אחד כדי לבדוק את הצלחת גם אחד 96 של תרכובות עם קריאה רוצה בשבוע עבודה בן 6 ימים. מאז דג הזברה הם מֵטִיל בֵּיצִים, עם העוברים מתפתחים מחוץ להורה, ואת העוברים הם גדולים מספיק כדי לראות בעין בלתי מזוינת (בין 1-3 מ&quot;מ), הם נוחים לטיפול ידני במכשירים פשוטים והחוקר יכול דגימות מערך בצלחות רבות גם ללא שימוש במיקרוסקופ. יתר על כן, מאז דג הזברה מתפתחת במהירות, חשיפת מולקולה קטנה יכולה להיות יעילה בטיפול יחיד של מתחם, ולא במינונים חוזרים ונשנים, אשר ממזער עיבוד ידני נוסף. עוברי דג הזברה בקלות מתורבתים כי החלמון שלהם מספק מקור תזונה עד 5-6 ימים לאחר הפריה, אשר מבטלת את הסיבוך של דגיגי האכלה. בנוסף, הרוב המכריע של איברי הזחל פיתח והפך פונקציונלי בתקופה זו, המספקת ההזדמנות ללמוד מגוון רחב של שאלות מחקר. בנוסף הפשוט של מולקולות קטנות לתקשורת הדגירה העובר אינו פולשני ומאפשר לחוקר (ים) כדי לבחור למנת תרופה, זמן של בנוסף, ומשך זמן של מתן שליטה הדוקה על משתנים רבים ומאפשרת לתהליכים התפתחותיים ספציפיים ובכך-חשיפה של ריבית ששאל. כפי שתואר כאן, הפרודוקטיביות מחקר משמעותית יכולה להיות מושגת בtimefr קצרהame שימוש במתודולוגיה מסך במדריך זה. מניסיוננו, יש תשואה גבוהה על המאמץ שהושקע, שיכול להיות מודגשת על ידי שימוש בספרייה כימית ביו ידוע לנתח תהליך של עניין, כגון פילוח נפרון במהלך פיתוח כליות (איור 4; Poureetezadi וWingert, לא פורסם). המסך כימי הוראות שמתואר כאן הוא תכליתי במיוחד משום שהיא כוללת assay על דגימות דג הזברה קבועות. לדוגמא, אסטרטגיה זו יכולה להיות מתוקנת כדי לבדוק כמה צלחות של תרכובות בשבוע אחד ולאחר מכן להבקיע עוברים בשבוע הבא. מבחני חלופיים על דגימות דג הזברה קבועות, כגון הכנות אימונוהיסטוכימיה או צביעת רקמות אחרת, יכולים גם להיות תחליף לרצון קריאה החוצה. אסטרטגיות ניסיוניות לביצוע מבחני סלולריים בדג הזברה הם ישימים בשל הבהירות והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות מוקדמים. יתר על כן, חוקרים יכולים לעכב פיגמנטציה בSTA מאוחר יותרGES שימוש בכימיקלים או להימנע מהסיבוך של פיתוח פיגמנט לגמרי באמצעות השימוש בקווים גנטיים פיגמנט-פחות כמו קספר או דג הזברה מוחלט 13. זה אפשרי לנהל באופן ידני מולקולות קטנות, לעבד את הכתם (ים) של עניין, ולהבקיע באופן ידני עובר באמצעות סטראו פשוט. עם זאת, חשוב לזכור כי ניתוח תמונה אוטומטי יכול להתבצע, ועשוי למעשה להיות נדרשים לניתוח פנוטיפ ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זה יכול להיות עדיף על מערכת ניתוח תמונה אוטומטית עם assay ישיר, שותף כגון כתב מהונדס, כמו זה מייעל את העיבוד הידני של דגימות, מכמת הבדלים לא בקלות ניתן להבחין בעין בלתי מזוינת, ומבטל הטיה חוקר 15. למרבה המזל, כמה מערכות הדמיה אוטומטיות שניהם ידידותי למשתמש וחסכוני במונחים של עלויות תוכנת 15. השימוש והיכולות של מערכות אוטומטיות אחרות במהירות התפתחו ויכוליםלהיות בשימוש לאורגניזמים אוריינט, לנהל טיפולים תרופתיים, ואפילו להעתיק את מקום מגורי אורגניזמים 12,15. מערכות אוטומטיות אלה בישרו עידן טכנולוגי חדש של מחקר וספקו פתרונות חדשניים כדי לתפעל כמויות גדולות של נבדקים ובכך לבצע HTS וHCS גישות באורגניזמים שלמים 12,15. בעוד מכונות כאלה הן ללא ספק כלים שימושיים, הם גם מאוד יקרים ונמצאים מחוץ להישג ידם של רבים מעבדות מחקר בסיסיות. ללא גישה ליכולות האוטומטיות אלה זה אולי נראה כי מסכי כימיים אינם אפשריים. עם זאת, פרוטוקול זה מתאר מדריך לכיצד לנהל מסך במדריך, שניתן להשתמש כדי להשלים את מסך גנטיקה כימית באופן מעשי על פרק זמן סביר. חסרונות לשתי הגנטיקה הקרנה וכימית המדריך באופן כללי קיימים, וצריכים להישמר בחשבון כאשר שוקלים מסך כימי. בפרט, השיטה הפגינה כאן מחייבת מידה מתונהשל מיומנות פיזית. חשש זה הוא מצומצם או בטל לגמרי דרך חזרה, כמו מיומנות תשפר עם תרגול. בנוסף, יש מקום מינימאלי לשגיאה גסה, שכן יש רק 10 עובר לכל גם לניתוח. מולקולות קטנות יכולות להשתנות בחדירות של פנוטיפ שנגרם, כך משטר ניקוד סביר לזהות תרכובות של עניין יש לדבוק. זה חיוני כי חוקרי ניצול פרוטוקול זה להמציא קריטריונים קפדניים כראוי למה שהם ישקלו להיט. כמו כן, חשוב לזכור שהטבע של צורה זו של מסך יהיה ככל הנראה להניב חלק מסוים של תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיות שמסומן באמצעות עבודה-עד כימית נוספת. יתר על כן, זה קריטי לשלב עוברים מדויקים ולאסוף מצמדים להקרנה זמן קצר לאחר הפריה, כמו פיתוח אסינכרוני יכול להוביל לסיבוכים באופן מדויק להעריך את ההשפעה של טיפולים תרופתיים. יתר על כן, בכל הקשור להקרנה כימית לשעבראסטרטגית perimental, יש שורה של מגבלות. מסיסות ורעילות של מולקולות נושאת מתחם (לדוגמא, sulfoxide דימתיל (DMSO)) יכולים גם להציג נושא ויכולים להיות מונע בבדיקת מולקולות רבות. סיסית יכול לשמש גם מחסום לחשיפה לסמים. לבסוף, למרות שדג זברה היא מודל רב עוצמה וtranslational לגנטיקה כימית, טיפול צריך תמיד לקחת בקביעה האם אסטרטגית מסך כימית חלופית, למשל, שימוש במערכת במבחנה כגון שורת תאים, ניתן להחליף לשימוש בכל בעלי חיים. עם זאת, טיפול כימי במערכת דג הזברה השלמה נחשב עדיף על ניהול גישות דומות ביונקים, כפי שהיא מספקת את היתרון של איסוף ההשפעות המערכתיות של התרכובות ויכולה לאפשר לחוקרים למיין את רשימת התרכובות להיבדק במודל של יונקים. עד כה, מסכי כימיים דג הזברה סיפקו לא כלי ניסיוני חזקo להתוות המנגנונים של פיתוח ולוודא סוכנים תרופתיים מועמד לשימוש ברפואה, כגון זיהוי של מולקולות מסוגלת למנוע פתולוגיות מחלה. לדוגמא, מחקר על ידי ברנס ועמיתיו פיתח assay מיקרו-ואוטומטי לקצב לב לשימוש בעוברי דג הזברה מהונדסים שהביעו GFP בשריר הלב 42. הם השתמשו בקו מהונדס זה כדי לנתח את קצב לב בפיתוח וכיצד הוא הושפע על טיפול תרופתי 42. מחקר אחר, על ידי בדיקת צפיפות האוכלוסייה של תאי גזע hematopoietic בעובר דג הזברה, זיהה שE2 פרוסטגלנדין מסדיר את הנישה HSC 23. ממצא זה קבל תוקף בעכבר, ולאחר מכן בוצע לבדיקה קלינית בהשתלות טבורי אנושיות 23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). באמצעות מספר מחקרים שנעשה לאחרונה, גנטיקה כימית הוכיחה להיות שימושי בלימוד מחלת כליות באמצעות דג הזברה <sעד&gt; 43. כליות דג הזברה מספקת פרדיגמה מצוינת ללמוד nephrogenesis או התחדשות של נפרון, היחידה התפקודית המרכיבות את הכליות במהלך פציעת פיתוח וכליות חריפות 43. מבנה נפרון הוא שמור ביותר בין הכליה עוברית דג הזברה והמבוגרת בכליות יונקים 44-50. מספר מחקרים שבחנו את הכליה העוברית דג הזברה להדגים בבירור את פוטנציאל translational הטבוע בו כאשר יחד עם גנטיקה כימית. מסך גנטיקה כימית בוצע בשני מוטנטים דג הזברה שמופו לpkd2 גנים וift172, אשר ידוע להיות שחקני מפתח במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34. המסך הביא זיהוי deacetylase פאן-היסטון (HDAC) מעכב trichostatin (TSA) כמולקולה קטנה שיכול לבטל את הפגמים מורפולוגיים נראים בדרך כלל בעוברי המוטציה. גישה שונה ננקטה על ידי דה Groh ועמיתים הוקרנה תרכובות הinducבצקת ed בעוברי דג הזברה wild-type, דבר המצביעים הפרעה בתפקוד כליות 35. לאחר זיהוי PTBA כלהיט, הם הבחינו כי בנוסף לגרימת בצקת, PTBA גם הגדיל את הביטוי של pax2a, סמן לאבות כליות. חשוב לציין, נגזר ממוטב של PTBA אז הראה ירידת התמותה אחוזים של דג הזברה מבוגרת שעברה נזק לכליות הנגרם גנטמיצין ויתר על כן, האיץ את ההתאוששות של עכברים שסבלו מנזק כלייתי 27. יחדיו, תרומות אלה מגנטיקה כימית דג הזברה להציג הסוגים של תגליות שיכולים להתבצע תוך שימוש בשיטה שתוארה בפרוטוקול זה. למרות שמחקרי גנטיקה כימית נושאים הכשרון ניכר, זה לא בלי אתגרים מסוימים. אך ורק תוך שימוש בגישה גנטיקה כימית יכול לעשות את זה מסובך כדי לקבוע את הגן הספציפי או גנים המושפעים מתחם. גם אם יעד (ים) נמצא, siפער gnificant יכול להישאר בין הזדהות מתחם והבנת המנגנון (ים) של פעולה שבה המולקולה הקטנה מתנהגת. לדוגמא, זה יכול להיות קשה לקבוע את המנגנון שבו מולקולה קטנה פועלת כי מתחם אחד מסוגל לנהל מגוון של אפקטים שונים בתוך האורגניזם. עם זאת, עם כניסתו של טכנולוגיה חדשה והמסכים גנטיים כימיים יותר הושלמה בדג זברה, הבעיה של קביעת מנגנון מתכווצת. שיטה אחת כדי לקבוע את ההשפעות מולקולריות של תרכובות שזוהו היא לבחור ספריית תרופות של bioactives הידוע להקרנה, שבו מנגנונים ניתן להסיק שעלולה להיות מהנתונים מבואר בעבר. בנוסף, אלגוריתמי chemoinformatic, כמו שער גילוי, זמינים לשימוש שיכול להשוות דמיון מבני של מתחם מול מסד נתונים של תרכובות עם מנגנונים מיוחסים 14. דרך נוספת על מנת להבהיר את המנגנון של מתחם תהיה ליצור MICRoarray פרופיל לאחר טיפול ולאחר מכן לבצע שאילתא פרופיל זה באוסף של פרופילי תרופת microarray, כגון קישוריות מפה, מחפשת תרכובות מוגדרות באופן מכניסטי שתעוררנה אפקט דומה 14. גם גישה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות גנטיות שיש לו השפעה דומה לזו של תרכובת של עניין. מציאת קשר בין מתחם ומוטציה יכולה להציע שהמתחם פועל במעלה הזרם או במורד הזרם מולקולריים של הגן קשור, אשר יכול להיות שמסומן על ידי טיפול במוטציות עם המתחם וmorpholinos. אפשרות נוספת תהיה ספקטרומטריה, שממשיכה להיות אופטימלי יותר לדג זברה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להתוות שינויים ספציפיים חלבון או שלאחר translational שינויים לאחר טיפול תרופתי. לבסוף, מולקולות קטנות או אפילו ספריות שלמות הן לפעמים מסוגלים להיות מתויג לנפתח של שותפים המחייבים. זה גם ראוי לציין, כי בעוד שהמנגנון של איך פונקציות מולקולה קטנות אנישל יבוא משמעותי, יש תרופות שאושרו ע&quot;י ה- FDA שלמנגנונים אינם ידועים. למרות שדג זברה תערוכת קווי דמיון רב ליונקים שני גנטית ופיסיולוגי, יש עדיין בעיה של מוצלב התרופה 14. מחקר בדק את היכולת המוצלב של הלהיטים ממסך למעכבי מחזור התא בעוברי דג הזברה 50. המסך גרם לזיהויו של 14 להיטים שלא היו ידועים קודם לכן לבעלי פעילות מחזור התא. מתוך 14 תרכובות אלו, 6 נמצאו כבעלי פעילות מחזור תא בשני מבחני תרבית תאים אנושיים ודג זברה, 3 הוצגו להיות סרום מומת במבחני תרבית תאים, 1 היה פעיל רק בתאי דג הזברה, ו- 4 לא היו פעילות בכל אחד מ דג הזברה או מבחני תרבית תאי אדם, אבל רק בכל אורגניזם דג הזברה. יש לציין, 4 תרכובות שרק פעילות בדג הזברה מראות כי יש הבדלים בין דג הזברה ויונקים שעשויים prohiנשך את פוטנציאל translational של תרכובות מסוימות. זהו שיקול חשוב להיות מודע ל, עם זאת יש דוגמאות של מולקולות קטנות, כמו PGE 2 שמגביר את היכולת של HSCs לנקלט במקבלים אנושיים וPTBA נגזרים המשפרים את קצב התאוששות כליות אצל יונקים, ובכך לספק ההוכחה עיקרון מוצלב שאפשר 23,31-33. ללא קשר למלכודות הללו, גנטיקה כימית וגישה מינימאלי-משאב זה יש הרבה מה להציע לקהילת המחקר. גנטיקה כימית שימושית במיוחד בדג הזברה ותמשיך לשחק תפקיד קריטי בחקירת מסלול מולקולרית וגילוי סמים. מסכי כימיים המבוססים על מטרות מולקולריות בדידות שהיו בשיעור כישלון גבוה מבחינה היסטורית בשל מה שמכונה קבוצת הכוכבים של ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ומאפיינים טוקסיקולוגית (ADMET) 51. מסכי כימיים ניצול דג הזברה ללהתמקד בתהליך, ולא יעד דיסקרטי, יכול לעקוף כמה בעיות ADMET ולזהות תרכובות שנמצאות יעילים בהקשר של האורגניזם כולו. עם הבריכה הולכת וגדל של משאבים זמינים למחקר דג הזברה, כוללים זנים מוטנטים הנוכחיים ואת היכולת להשתמש בעריכת הגנום ליצור מוטציות גנטיות ממוקדות וtransgenics, יש כמעט מספר בלתי מוגבל של מסכים גנטי כימי פוטנציאלי באמצעות דג הזברה. ספריות כימיות רבות כבר אצרו, ואוספי תוחלת עם bioactives הידוע, תרכובות רומן, מבחינה מבנית מגוונות ומבני דומות. ריאגנטים אלה מספקים שפע של הזדמנויות עבור שילובי מסך שכרגע זמינים וצפויים לגדול עוד יותר בשנים הקרובות. עם אפשרויות אלה ביד, פרוטוקול ידני ותפוקה גבוהה זה מספק דרך מעשית וידידותי למשתמש כדי להגדיל את היכולת של קבוצות מחקר לבצע מסכי גנטיים כימיים באמצעות דג הזברה.

זיהוי של סמי מרפא יעילים לטיפול במחלה אנושית הוא סוף המשחק להרבה חוקרים ביו-רפואיים. בעוד זיהוי והאפיון של סוכנים תרופתיים פוטנציאל ליישומים קליניים יש ערך ברור לבריאות, היא נותרה אתגר משמעותי. סופו של דבר, את הפיתוח של תרכובות רבות טיפוליות מגיע מהידע של איך סוגי תאים מסוימים או לפתח או פונקציה. דג הזברה, Danio rerio, היא חוליות מים מתוקים של משפחת Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל הזרם המרכזי בביולוגיה התפתחותית 1. דג הזברה הן גנטי חוליות צייתניות כי הם קל לשמור ולטפל במחקרים מדעיים 2,3. עוברים דג הזברה הוא שקוף, מופרה חיצוני, ויכול להיות מיוצר על ידי מאות מזוג הזדווגות מבוגר יחיד בשבוע 2,3 בלבד. יתר על כן, מערכות דג הזברה מניות עיקריות באיברים ויש ד גדולegree של דמיון גנטי ליונקים, כולל בני אדם 4. באופן מפתיע, 70% מהגנים באדם יש orthologue דג הזברה 4. בשל דמיון זה, דג הזברה הייתה מערכת ניסיונית רלוונטית ביותר לחקר המנגנונים של התפתחות חוליות ופיזיולוגיה, והיית מועסק לשחזר מספר רב של מחלות בבני אדם 5-7. מסיבות אלה, בין השאר, הפכו את המועמד אידיאלי דג הזברה להמשך חקירות גנטיות והביאה לייסוף במגמת עלייה מתמדת לשירות של דג הזברה במחקר ביו-רפואי 6,7. במהלך העשורים האחרונים, שפע של כלים גנטיים פותחו בדג הזברה. הגנום דג הזברה ניתן לmutagenesis וtransgenesis 3. עד כה, שפע של קדימה לאחור מחקרים גנטיים בוצעו, הוביל לדור של מעל 9,000 מוטציות 3. יתר על כן, קווים מהונדסים רבים יש להיותen יצר, אשר איפשר התיוג ובידוד של סוגי תאים מסוימים 3. היו מאמצים מתמשכים משמעותיים לרכז ולחלק את המשאבים הללו לקהילת המחקר, אשר נגישים למעבדות בעלות נמוכה למדי באמצעות מרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (Zirc) 8. יתר על כן, מאגר נרחב של מידע ביולוגי וכלים מולקולריים, הנעים בין דפוסי ביטוי גנים לMorpholino רצפים ופרוטוקולים, כבר מבואר בהדרגה ברשת הזברה המידע (ZFIN) 9-11. תשתיות מחקר דג הזברה אלה מתאפשרות באמצעות תמיכת NIH משמעותית וסנגור של מודל זה חי 8. מטמון זה של מוטנטים דג הזברה, קווים מהונדסים, ומידע רלוונטי ממשיך להיות של ערך יוצא דופן לקהילת המחקר הביולוגית בכללותו. עם זאת, בזמן שדג זברה היא עכשיו אורגניזם מודל מבוסס היטב ומראש יחסנים, הם מייצגים להrgely מאגר שלא נוצל ללמוד ביולוגיה ומחלות התפתחותיות באמצעות השימוש במסכים גנטיים כימיים. גנטיקה כימית היא השימוש במולקולות קטנות, כגון תרופות או חומרים אחרים, כדי להשפיע על תהליך ביולוגי בתוך מערכת חיים 12. יכולה להיות מיושמת גנטיקה כימית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד גן, כגון לזהות סוכני הצלה שאו להחמיר פגם גנטי ספציפי 12. יתר על כן, גנטיקה כימית מייצגת שדרת אחת גדולה בכדי לבצע מחקר translational 12. בעוד מסכי גנטיים קדימה מסורתיים במודלים של בעלי חיים היו מאוד חזקים בקישור גנים ספציפיים למחלות, שאין להם ממד זמן, ולכן קשה או לפעמים אי אפשר לצפות פנוטיפים שיקומו לאחר עובר מוקדם. בנוסף, יתירות גן יכולה להפוך את התוצאות שנצפו מגנטיקה קדימה קשה לפרש. לחלופין, מסכי גנטיים כימייםלאפשר לשליטה זמנית בסדר ובו זמנית מספק נקודת התחלה רבת ערך לגילוי סמים 12,13. ניתן לבצע גנטיקה כימית באמצעות במערכות חוץ גופית (לדוגמא, שורות תאים, חלבונים) או באמצעות מערכת in vivo, כגון האורגניזם כולו. שימוש במערכת במבחנה לגנטיקה כימית יכולה להיות מועילה, כי זה פשוט יותר מאשר מערכת האורגניזם שלמה, קל יותר לעבוד עם בקנה מידה גדול, פחות יקר, ופחות זמן רב. כתוצאה מכך, במבחנה מערכות מאפשרות לשניהם תפוקה גבוהה הקרנה (HTS) וגבוהה הקרנת תוכן (HCS). יש מספר היתרונות לשימוש במערכת במבחנה שיש לשקול בעת התקרבות גנטיקה כימית, אלא גם מגבלות משמעותיות. מגבלה עיקרית אחת לשימוש בשורת תאים היא שמולקולות קטנות יכולות להיות יעילות ולא רעילים בשורת תאים ספציפית, עדיין להיות רעיל כאשר הציגו את האורגניזם כולו. כך, עיקרמהעניין הוא שבמבחנת מערכות אינן ממצות את ההקשר הרחב של האורגניזם ובשל כך אינן תמיד מסוגל לחקות במדויק את מה שקורה באורגניזם שלם. בעוד בדיקת מתחם בכל האורגניזמים יכולה לעקוף בעיות אלה, השימוש במודלי האורגניזם שלמים יונקים מציב מספר המגבלות פיזיות ומוסריות. לדוגמא, הקרנת סמים בעכבר מתעכבת מבחינה לוגיסטית על ידי המרחב וההוצאות הדרושים כדי לבדוק גודל מדגם הולם. בנוסף, שאלות התפתחותיות יכולות להיות קשות ללמוד, בשל העובדה שהיונקים להתפתח ברחם. לבסוף, בעוד שההתנהלות של מחקר הביו-רפואי יש ערך חברתי עצום, יש בכל זאת צרכי משמעותיים כדי להגן על רווחת בעלי חיים על ידי הגבלת לימודים אינטנסיביים והקלת הכאב וסבל של בעלי חיים המשמשים למחקר. דג הזברה תהווה תחליף בר-קיימא לעבודה עם חוליות גבוהות כמו יונקים, ויתר על כן, ניתן ללמוד נושאים רבים באמצעות גנטיקה כימית בהשלבים העובריים וזחל כאשר עיבוד נוירולוגיות נעדר או אופרטיבי ברמה נמוכה 12,13. עד כה, מספר עצום של מסכי גנטיים כימיים בוצעו שימוש בעוברי דג הזברה בפרט, כמסירת מתחם יכולה להיות מושלמת על ידי שיקוע של עוברים בתקשורת המכילים את התרופה של העניין 12-15. יתר על כן, הייתה התקדמות מדעית וטכנולוגית רבות כדי להפוך את המסך גנטי כימי אפשרי והניהול 16-20. פיטרסון ועמיתיו היו הראשון שהשתמש בדג זברה במסך גנטי כימי בשנת 2000, ומאוחר יותר בשנת 2004 זוהה תרכובת שדוכאה מוטציה קוארקטציה של אב העורקים ב21,22 דג הזברה. מסכי כימיים מאז יושמו ללמוד כמה רקמות מתפתחות (לדוגמא, לב, דם, כלי) 23-25, פונקציות פיסיולוגיות (למשל, בסיס הנוירולוגי להתנהגות) 26, התחדשות מבוגרת 27,28, וdiseas<html> מודלים דואר (לדוגמא, מחלת ניוון שרירים וסרטן) 29,30. מבין המסכים כימי דג הזברה אלה, הגילוי שפרוסטגלנדינים להסדיר בתאי גזע hematopoietic נלקח לניסויים קליניים בבני אדם, הממחיש את הכח לעבור מ&quot; טנק למיטה &quot;23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). לאחרונה, תרופות מועמד מבטיחים צמחו לאיברים מורכבים כמו הכליות, שתקנו פתולוגיה הסלולרית במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34 וניזק כלייתי חריף 27,35, אם כי אלה עדיין לא לעבור לניסויים קליניים. מסכי גנטיים הכימיים אלה באופן רחב להדגים את התועלת של בדיקת תרכובות קטנות של דג הזברה פיתוח והיכולת ליישם את גנטיקה כימית לחקור תפקוד רקמות בוגר. יתר על כן, יש רשימה הולכת וגדלה של אוספי פרמקולוגיה זמינים מסחרי הניתנים ללימודים אקדמיים 19. ove_content &quot;&gt; בשנים האחרונות, חל התקדמות בולטת בטכנולוגית סינון גנטית כימית, כוללים השימוש במערכות אוטומטיות של רובוטים מחלק סמים וטיפול, יחד עם מערכות הדמיה אוטומטיות 36-38. מערכות כאלה מאפשרות לאפשרות של בדיקת אלפים רבים של תרכובות להשיג שני HTS וHCS 36-38. למרבה הצער, ההתחייבות של מסכי גנטיים כימיים עם ארגונים רובוטית החדשניים אלה בדרך כלל דורשות משאבים רבים. משאבים אלו סוגי מכשול משמעותי למוסדות רבים שאין להן ההון כדי לרכוש , תתפעל, תתחזק ומכשור כזה. בזמן הקמת התשתית לטיפול רובוטית של ספריות כימיות, ובכלל זה העברת עוברים לערוכות צלחות, נשאר עלותו למעבדות רבות, הדמיה ממוחשבת, ובניתוח היא בדרך כלל נגישה יותר 12. הקרנת תמונה אוטומטית מאפשרת כימות מחדש מהונדס ניאוןסבלים ומאפשרים ניתוח פנוטיפי הספציפי 12,15. למרות שמערכות אוטומטיות מייצגות התקדמות טכנולוגית שימושית, ניתן לטפל שאלות רבות על ידי מסכי מדריך לממוקדים יותר, כגון השאילתה של כמה אלף תרכובות פעילות ביולוגית על תהליך התפתחותי עם כל הר הכלאה באתר קריאה (רוצה) 39. יתר על כן, בעוד שמספר הולך וגדל של מעבדות לגייס לעזרתם מסכי כימי דג הזברה לחקור שאלת מחקר, כמה הרוויה ונושאים רבים (אם בכלל) מאמצים הגיעו טרם נפרצו בעזרת גנטיקה כימית. ניתן לבצע מסכי כימיים באמצעות מושבה דג הזברה קטנה המכילה רק כמה סוג בר או טנקים מהונדסים. לכן, זה סוג של חקירה גנטית צריך להיות בר-השגה על ידי רוב קבוצות מחקר דג הזברה מעוניינת להרחיב / גיוון לזירה זו. ספריות כימיות בגדלים שונים יכולות להיות רכש ממפיץ ו / או col מסחרייםlaborators. מסיבות אלה, גנטיקה כימית יכולה להיות כדאי מבחינה כלכלית גם באקלים מימון קשה. עם זאת, ישנם מכשולים למתחילים מסך גנטיקה כימית, כגון איך לתכנן היבטים לוגיסטיים של המסך: למשל, באופן ידני דגימות תהליך של מצבת כוח האדם הדרוש למסך מוצלח, הקצאת הזמן הייעודי ולצרף יחד פרוטוקול פיזי מספר שממאה לכמה אלף. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעובר דג הזברה עם רצון כמו קריאה מתוך. שיטה זו כרוכה טיפול תרופתי של עוברי דג הזברה, ואחריו זיהוי riboprobe של תעתיקי mRNA. שימוש בפרוטוקול זה, צוות קטן או אפילו אדם אחד יכול להקרין באופן סביר ולנתח ספרייה כימית צנועה כ -600 תרכובות בפרק הזמן של 9 שבועות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:252px;">JoVE 51922 MATERIALS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:252px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 - 10 &#965;L natural pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">USA Scientific</td>
			<td>1111-3800</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 50X E3 and DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB11072</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-3225</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">20X SSC</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB13156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td>35-3226</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs - boil then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plate</td>
			<td style="width:191px;">CytoOne</td>
			<td>CC7672-7548</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">50 X E3</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 deep well plate</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>100-11-940</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate sealing mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-946</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B8503</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mg/mL using 100% DMF - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">block solution</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00448</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &#176;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:349px;">Consult the manufacturer procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00450</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">4716728001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-1005</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epT.I.P.S 20-300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>22492284</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">E7023</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16140089</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430516</td>
			<td style="width:349px;">0.45 &#965;m CA / 1L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">fine forceps</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:101px;">RS-1050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:252px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00600</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass basin 90 x 50</td>
			<td>Kimax Kimble</td>
			<td>23000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass pipette</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glass vial</td>
			<td style="width:191px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">225012</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G7893</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G8898</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycogen</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">HYB+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 &#965;L/&#965;L heparin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">INT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">I8377</td>
			<td style="width:349px;">Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:252px;">MAB</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MABT</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MeOH</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">34860-4L</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:191px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:101px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:191px;">Mediatech</td>
			<td style="width:101px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 30 - 300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.051</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">nanodrop</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">NBT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">N6876</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:101px;">19210</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR-Film adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>30127.48</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plate container (Pencil Box)</td>
			<td style="width:191px;">Sterilite</td>
			<td>1722</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pronase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11459643001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3335399001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rubber bulb</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11487671001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 45 &#965;L of NBT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 31.5 &#965;L of INT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:101px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11031171001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10881775001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:191px;">Samco</td>
			<td style="width:101px;">202, 204</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB02038</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">waterbath</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">51221073</td>
			<td style="width:349px;">(Model # 2831)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

דג הזברה הפכה אורגניזם מודל בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ביולוגיה התפתחותית ולמחקר של מחל מחלות של בני אדם בשל המידה הניכרת של שימור גנטי בבני אדם. גנטיקה כימית כרוכה בבדיקת ההשפעה שיש לי מולקולות קטנות בתהליך ביולוגי והופכת לשיטת מחקר translational פופולרית לזהות תרכובות טיפוליות. דג הזברה פונה באופן ספציפי לשימוש עבור גנטיקה כימית בגלל היכולת שלהם לייצר אחיזה גדולה של עוברים שקופים, שמופרים באופן חיצוני. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים להיות בקלות בסמים מטופלים על ידי התוספת הפשוטה של ​​מתחם לתקשורת העובר. שימוש בכל הר הכלאה באתר (רוצה), ביטוי mRNA ניתן בבירור דמיין בתוך עוברי דג הזברה. יחד, בעזרת גנטיקה כימית ומאחלים, דג הזברה הופכת הקשר האורגניזם שלם חזק בו כדי לקבוע את סלולארי ופיזיולוגיהשפעות של מולקולות קטנות. התקדמות חדשנית נעשתה בטכנולוגיות שעושות שימוש בהליכי מיון המבוסס על מכונה, אך למעבדות רבות אפשרויות כגון אינן נגישות או להישאר עלות אוסרני. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע מסך מדריך לתפוקה גבוהה כימי גנטי שדורש משאבים בסיסיים ויכולים להתבצע על ידי צוות בודד או קטן אחת בתקופה יעילה של זמן. כך, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה אפשרית שיכול להיות מיושמת על ידי קבוצות מחקר לבצע גנטיקה כימית בדג זברה, אשר יכולה להיות שימושית להשגת תובנות יסוד לתהליכים התפתחותיים, מנגנוני מחלה, ולזהות תרכובות חדשות ומסלולי איתות שיש לי יישומים רלוונטיים מבחינה רפואית .

הגישה הידנית המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה לנהל תפוקה גבוהה גנטיקה כימית מולקולה קטנה מסך באמצעות מודל דג הזברה עובר (איור 1). באמצעות שיטה זו, זה מעשי לאדם אחד לבצע מסך גנטיקה כימית, כך שבמשך 9 שבועות אדם אחד (מחויב לשבוע עבודה של 40 שעות) יכול לבצע את סקר של כ -600 תרכובות (איור 1) . כך, בפעם הספסל של אדם אחד יכולה לעקוף את הצורך בציוד בדרישה גבוה משאבים, מערכות אוטומטיות כמו. Trade-off הוא שמסך ידני דורש מספר שבועות של מאמץ ייעודי. בניגוד לכך, השימוש במערכות אוטומטיות יכול לדחוס את הזמן הכרוך ב1-2 שבועות של זמן רובוטית, ועלולים להיות כרוכה במאמץ חוקר יחסית מינימאלי כוללת. אחת דרכים להגדיל את היעילות ו / או היקף מסך במדריך היא לגייס 2-3 חוקרים בסך הכל, שתאפשר הקרנה מ &#39;תרכובות עפרות, ריכוז תרכובת שונה, ו / או הקרנה על פני תקופה קצרה של זמן. מעורבים בפרוטוקול כדי להשלים מסך גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם קריאת משאלת הצעדים העיקריים מומחשים כתרשים זרימה (איור 2). ניתן לחלק את משימות הניסוי לשני סוגים של שבועות עבודה: (1) חשיפה לכימיקלים ותיוג עובר, ו- (2) ניתוח והדמיה. בשבוע עבודת חשיפה לכימיקלים, צעדים אלה כוללים הקמת מבוגרים דג הזברה (יום 1), אוסף עובר, עובר עֲרִיכָה וטיפול תרופתי (יום 2), הכנת עוברים לכלאה באתר (יום 3), וכלאה באתר (יום 4 -6). בשבוע ניתוח / הדמיה, חוקר מנתח ביטוי mRNA להבקיע עוברים ולהיטי תמונה (יום 7-11). חלק קריטי בביצוע מסך גנטיקה כימית הוא לתייג גם באופן עקבי ומדויק במקומות. כp מסך גנטיקה הכימיתrocess מפורט כאן כרוך בהעברת קבוצות של עוברים מהיטב בצלחת אחת לגם בצלחת שונה מספר פעמים, את הצורך בתיוג מדויק וברור הוא בעל חשיבות עליונה, כך שכאשר להיט כימי הוא הבקיע זה יכול להיות ליניארי ובקלות נעוצים לזהותה בתוך הספרייה הכימית (איור 3). דרך קלה כדי לוודא שזה היא תווית הצלחות בצורה כזאת, כי בכל עת את המיקום גם עבור קבוצה של עוברים שטופלו על ידי תרכובת ישירות מתאים למיקום הכימי ספריית צלחת תרופה גם של המתחם משמש לטיפול בעוברים אלה (איור 3). כאן, מערכת כפולה של תוויות צבע קידוד ומספריים היא מנוצלת כדי לארגן את הדגימות, שנוספו לצלחות המסך באמצעות סמנים קבע (איור 3). כאשר מנתחים את התוצאות של מסך תפוקה גבוהה, יש צורך קריטי לפתח שיטה לארגן בצורה נכונה, ביאורים, ולנתח את המולקולה קטנה פוטנציאליתלהיטים. לכן, מסך גנטיקה כימית חייב להיות מערכת לדירוג יסודית וברורה שתוכננה בקפידה וציית באופן קפדני ל. מערכת כזו צריכה בקלות ובאופן מוחלט להעביר את הדינמיקה החשובה של מתחם ולספק דרך תמציתית להציג את התוצאות של המסך המוגמר. אחת דרכים לבנות מערכת כזו היא עוברי כיתה באמצעות מערכת כיתה, מה שמסביר את החומרה מורפולוגיים כוללת וביטחון של להיט. יתר על כן, הקטגוריות המעמדיות יכולות להיות בשילוב עם (+) או (-), כדי לתאר השפעה מרחיבה או מצמצמת באזור (ים) של עניין. כאן, עוברי דג הזברה היו נתונים לתרכובות בודדות מספרייה ביו (אנזו כימיקלים) מepiboly 50% ל- 24 hpf, ולאחר מכן assayed ידי משאלה באמצעות קוקטייל של שלוש riboprobes לזהות פלחי נפרון (איור 4 א). כמערכת לדירוג דוגמא, גם שמכיל קבוצה של עוברים שהיו לי convolu הפרוקסימלי מוגדל באופן דרמטיאבובית טד (PCT) של כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה העוברית דג הזברה, תגרום למתחם המשמש לטיפול שכן להיות מסווג כ( Class I), אשר במקרה זה היה לייצג את המעמד הקשורות לפגם החמור ביותר וברמה הגבוהה ביותר של אמון בפנוטיפ נצפה (איור 4). המתחם היה אז להיות מבואר ב( PCT) ו( +), להיות סימון המלא (Class I - + PCT) (איור 4). תפיסה זו של סיווג מספקת דרך פשוטה ומהירה כדי לתאר מידע רב הנוגע למולקולה קטנה של עניין, ובכלל זה את חומרת השפעת התרכובות על האורגניזם, האזור שמושפע מהסמים ואת האופן שבי האזור מושפע (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. &amp; #160;. אסטרטגית מסך כימי עובר דג הזברה ידנית חוקר יתכן יכול לבדוק צלחת גם 96 של כימיקלים על עוברי דג הזברה ולבצע עיבוד המשאלה הבא במהלך שבוע אחד. ביצוע שבועיים של בדיקות כימיות (שבוע 1 (יום 1-6) ושבוע 2 (יום 7-12)) ניתן לשייך שבוע המוקדש ללדגום ניתוח שלישי. כ יכולות להיות הבקיע שתי צלחות 96 שווה של דגימות מסך וצלמו שבוע 3 (יום 13-17). תרחיש זה מסתכם בהקרנה של כ -200 תרכובות בתקופת זמן 3 שבוע, שהשוותה ל ספרייה קטנה של כ -600 תרכובות הוקרנו לחלוטין על ידי 9 שבועות. אסטרטגית מדריך זה יכול להיות שונה בהתאם למשאבים הזמינים. לדוגמא, שלושה חוקרים יכולים להפחית את הזמן כדי להשלים את המסך של כ -600 תרכובות עד 3 שבועות בהשוואה ל 9 השבועות זה ייקח עם חוקר אחד. ניתן להתאים אסטרטגיות סקירה על ידי הקצאת חוקרים להיבטים ספציפיים של המסך, כגון טיפול תרופתיment וכלאה באתר או מכוונים את החוקרים לבצע באופן עצמאי את תהליך המיון כולו בחלקים נפרדים של הספרייה הכימית. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> תרשים זרימה 2. איור:. פירוט העבודה מסך 6 ימים תהליך המיון הכימי יכול להיות שבור למטה דיסקרטית ל -6 ימים. יום 1 מורכב של הקמת זוגות הזדווגות דג הזברה (= /&gt; 25) לספק עובר לכל צלחת גם 96 שיוקרה. היום 2 כרוך באיסוף עובר מן תאי ההזדווגות ועֲרִיכָה בצלחת גם עמוקה 96, ואחריו טיפול תרופתי. ביום 3, עובר מוכנים לתרצה, כולל dechorionation, קיבעון רקמות, והתייבשות עובר. לבסוף, רצון הוא מבוצע בעוברים דרך יום 4-6. אנא שים לב כי נהלי צביעה חלופיים על דגימות קבועות יכול להיות בקלות שלubstituted למשאלה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> סכמטית איור 3. פלייט תיוג העברה. עוברי דג הזברה מפוזרים וסמים שטופלו בצלחת גם 96 ולאחר מכן עברה לצלחת גם 24 להסרת פסולת וחשיפת pronase. אז העוברים עברו 48 צלחות גם להכנת עובר, תרצה, וקיבוע רקמה. בשלב הבא, עוברים מועברים 12 צלחות גם לניקוד, הדמיה, ואחסון. עֲרִיכָה המדויקת של עוברים מושגת על ידי השימוש בשיטת קוד-צבעים, המאפשרת לחוקר לעקוב אחר כימי ממוצא עבור כל מדגם בדיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,063 / 52063fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; מערכת איור 4. דוגמא לדירוג:. assay פילוח כליות ניסוי מאחלים מאפשר לחוקר להכתים סוגי תאים ספציפיים המבוססים על הזהות של הבדיקות שנבחרו, ומאפשר ההערכה של שינויים בפנוטיפים עובר בהתאם לשינויים במיקום שעתוק mRNA ו / או רמות. כדוגמא, שלושה מגזרים של הכליה העוברית דג הזברה, כִּליַת רֵאשִׁית, תויגו באמצעות מיקס מסך 1. מערבבים מסך 1 הוא קוקטייל של בדיקות מורכבות של wt1b, אשר דווקא localizes בpodocytes (P), slc20a1a אשר מסמן את הפרוקסימלי מפותל אבובית (PCT), וslc12a1 אשר תוויות המגזר המוקדם דיסטלי (DE) 47. סמל (+) לצד תווית אזור משמש כדי להוסיף הערות על ההתרחבות או שינוי חיובי של האזור, ואילו (-) שימוש בסמל למכתיב את ההתמעטות של אזור. הנה, אותםיש לי bryos סמים מטופלים עם RA 13-cis אבובית הפרוקסימלי מפותל מוגדלת והפסד של המגזר המוקדם דיסטלי ללא השפעה נראית לעין על podocytes מלא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

a-manual-small-molecule-screen-approaching-high-throughput-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Views.  University of Notre Dame.  דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה. 

Video: A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...