עבודה זו נתמכה על ידי מימון למעבדת מחקר Wingert מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרץ # ענק הפרס 5-FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים פול ט &#39;Kroeger, ג&#39; וניור למתן משוב ביקורתי על כתב היד. אנו מודים לצוות מהמחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטר דאם על מסירותם היוצאת מן הכלל בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברי researהמעבדה ch להערות, הדיונים שלהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

גנטיקה כימית בדג הזברה יכולה לעשות השפעה קריטית על ההתקדמות של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מספק שיטת תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם רצון לקריאה החוצה, בצורה יעילה ומאפשר צוות בודד או קטן לנהל מסך מולקולה קטן. שיטה המינימלית של משאביי-זה מרחיבה את הכדאיות של גנטיקה כימית לקבוצות מחקר רבות. באופן ספציפי, אסטרטגית מסך זה מספקת אלטרנטיבה חשובה לשימוש במכשור רובוטי, כמו מערכות כאלה הן לא רחבה נגישות בכל מחלקות מחקר. מסך במדריך זה מאפשר לו אדם אחד כדי לבדוק את הצלחת גם אחד 96 של תרכובות עם קריאה רוצה בשבוע עבודה בן 6 ימים. מאז דג הזברה הם מֵטִיל בֵּיצִים, עם העוברים מתפתחים מחוץ להורה, ואת העוברים הם גדולים מספיק כדי לראות בעין בלתי מזוינת (בין 1-3 מ&quot;מ), הם נוחים לטיפול ידני במכשירים פשוטים והחוקר יכול דגימות מערך בצלחות רבות גם ללא שימוש במיקרוסקופ. יתר על כן, מאז דג הזברה מתפתחת במהירות, חשיפת מולקולה קטנה יכולה להיות יעילה בטיפול יחיד של מתחם, ולא במינונים חוזרים ונשנים, אשר ממזער עיבוד ידני נוסף. עוברי דג הזברה בקלות מתורבתים כי החלמון שלהם מספק מקור תזונה עד 5-6 ימים לאחר הפריה, אשר מבטלת את הסיבוך של דגיגי האכלה. בנוסף, הרוב המכריע של איברי הזחל פיתח והפך פונקציונלי בתקופה זו, המספקת ההזדמנות ללמוד מגוון רחב של שאלות מחקר. בנוסף הפשוט של מולקולות קטנות לתקשורת הדגירה העובר אינו פולשני ומאפשר לחוקר (ים) כדי לבחור למנת תרופה, זמן של בנוסף, ומשך זמן של מתן שליטה הדוקה על משתנים רבים ומאפשרת לתהליכים התפתחותיים ספציפיים ובכך-חשיפה של ריבית ששאל. כפי שתואר כאן, הפרודוקטיביות מחקר משמעותית יכולה להיות מושגת בtimefr קצרהame שימוש במתודולוגיה מסך במדריך זה. מניסיוננו, יש תשואה גבוהה על המאמץ שהושקע, שיכול להיות מודגשת על ידי שימוש בספרייה כימית ביו ידוע לנתח תהליך של עניין, כגון פילוח נפרון במהלך פיתוח כליות (איור 4; Poureetezadi וWingert, לא פורסם). המסך כימי הוראות שמתואר כאן הוא תכליתי במיוחד משום שהיא כוללת assay על דגימות דג הזברה קבועות. לדוגמא, אסטרטגיה זו יכולה להיות מתוקנת כדי לבדוק כמה צלחות של תרכובות בשבוע אחד ולאחר מכן להבקיע עוברים בשבוע הבא. מבחני חלופיים על דגימות דג הזברה קבועות, כגון הכנות אימונוהיסטוכימיה או צביעת רקמות אחרת, יכולים גם להיות תחליף לרצון קריאה החוצה. אסטרטגיות ניסיוניות לביצוע מבחני סלולריים בדג הזברה הם ישימים בשל הבהירות והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות מוקדמים. יתר על כן, חוקרים יכולים לעכב פיגמנטציה בSTA מאוחר יותרGES שימוש בכימיקלים או להימנע מהסיבוך של פיתוח פיגמנט לגמרי באמצעות השימוש בקווים גנטיים פיגמנט-פחות כמו קספר או דג הזברה מוחלט 13. זה אפשרי לנהל באופן ידני מולקולות קטנות, לעבד את הכתם (ים) של עניין, ולהבקיע באופן ידני עובר באמצעות סטראו פשוט. עם זאת, חשוב לזכור כי ניתוח תמונה אוטומטי יכול להתבצע, ועשוי למעשה להיות נדרשים לניתוח פנוטיפ ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זה יכול להיות עדיף על מערכת ניתוח תמונה אוטומטית עם assay ישיר, שותף כגון כתב מהונדס, כמו זה מייעל את העיבוד הידני של דגימות, מכמת הבדלים לא בקלות ניתן להבחין בעין בלתי מזוינת, ומבטל הטיה חוקר 15. למרבה המזל, כמה מערכות הדמיה אוטומטיות שניהם ידידותי למשתמש וחסכוני במונחים של עלויות תוכנת 15. השימוש והיכולות של מערכות אוטומטיות אחרות במהירות התפתחו ויכוליםלהיות בשימוש לאורגניזמים אוריינט, לנהל טיפולים תרופתיים, ואפילו להעתיק את מקום מגורי אורגניזמים 12,15. מערכות אוטומטיות אלה בישרו עידן טכנולוגי חדש של מחקר וספקו פתרונות חדשניים כדי לתפעל כמויות גדולות של נבדקים ובכך לבצע HTS וHCS גישות באורגניזמים שלמים 12,15. בעוד מכונות כאלה הן ללא ספק כלים שימושיים, הם גם מאוד יקרים ונמצאים מחוץ להישג ידם של רבים מעבדות מחקר בסיסיות. ללא גישה ליכולות האוטומטיות אלה זה אולי נראה כי מסכי כימיים אינם אפשריים. עם זאת, פרוטוקול זה מתאר מדריך לכיצד לנהל מסך במדריך, שניתן להשתמש כדי להשלים את מסך גנטיקה כימית באופן מעשי על פרק זמן סביר. חסרונות לשתי הגנטיקה הקרנה וכימית המדריך באופן כללי קיימים, וצריכים להישמר בחשבון כאשר שוקלים מסך כימי. בפרט, השיטה הפגינה כאן מחייבת מידה מתונהשל מיומנות פיזית. חשש זה הוא מצומצם או בטל לגמרי דרך חזרה, כמו מיומנות תשפר עם תרגול. בנוסף, יש מקום מינימאלי לשגיאה גסה, שכן יש רק 10 עובר לכל גם לניתוח. מולקולות קטנות יכולות להשתנות בחדירות של פנוטיפ שנגרם, כך משטר ניקוד סביר לזהות תרכובות של עניין יש לדבוק. זה חיוני כי חוקרי ניצול פרוטוקול זה להמציא קריטריונים קפדניים כראוי למה שהם ישקלו להיט. כמו כן, חשוב לזכור שהטבע של צורה זו של מסך יהיה ככל הנראה להניב חלק מסוים של תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיות שמסומן באמצעות עבודה-עד כימית נוספת. יתר על כן, זה קריטי לשלב עוברים מדויקים ולאסוף מצמדים להקרנה זמן קצר לאחר הפריה, כמו פיתוח אסינכרוני יכול להוביל לסיבוכים באופן מדויק להעריך את ההשפעה של טיפולים תרופתיים. יתר על כן, בכל הקשור להקרנה כימית לשעבראסטרטגית perimental, יש שורה של מגבלות. מסיסות ורעילות של מולקולות נושאת מתחם (לדוגמא, sulfoxide דימתיל (DMSO)) יכולים גם להציג נושא ויכולים להיות מונע בבדיקת מולקולות רבות. סיסית יכול לשמש גם מחסום לחשיפה לסמים. לבסוף, למרות שדג זברה היא מודל רב עוצמה וtranslational לגנטיקה כימית, טיפול צריך תמיד לקחת בקביעה האם אסטרטגית מסך כימית חלופית, למשל, שימוש במערכת במבחנה כגון שורת תאים, ניתן להחליף לשימוש בכל בעלי חיים. עם זאת, טיפול כימי במערכת דג הזברה השלמה נחשב עדיף על ניהול גישות דומות ביונקים, כפי שהיא מספקת את היתרון של איסוף ההשפעות המערכתיות של התרכובות ויכולה לאפשר לחוקרים למיין את רשימת התרכובות להיבדק במודל של יונקים. עד כה, מסכי כימיים דג הזברה סיפקו לא כלי ניסיוני חזקo להתוות המנגנונים של פיתוח ולוודא סוכנים תרופתיים מועמד לשימוש ברפואה, כגון זיהוי של מולקולות מסוגלת למנוע פתולוגיות מחלה. לדוגמא, מחקר על ידי ברנס ועמיתיו פיתח assay מיקרו-ואוטומטי לקצב לב לשימוש בעוברי דג הזברה מהונדסים שהביעו GFP בשריר הלב 42. הם השתמשו בקו מהונדס זה כדי לנתח את קצב לב בפיתוח וכיצד הוא הושפע על טיפול תרופתי 42. מחקר אחר, על ידי בדיקת צפיפות האוכלוסייה של תאי גזע hematopoietic בעובר דג הזברה, זיהה שE2 פרוסטגלנדין מסדיר את הנישה HSC 23. ממצא זה קבל תוקף בעכבר, ולאחר מכן בוצע לבדיקה קלינית בהשתלות טבורי אנושיות 23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). באמצעות מספר מחקרים שנעשה לאחרונה, גנטיקה כימית הוכיחה להיות שימושי בלימוד מחלת כליות באמצעות דג הזברה <sעד&gt; 43. כליות דג הזברה מספקת פרדיגמה מצוינת ללמוד nephrogenesis או התחדשות של נפרון, היחידה התפקודית המרכיבות את הכליות במהלך פציעת פיתוח וכליות חריפות 43. מבנה נפרון הוא שמור ביותר בין הכליה עוברית דג הזברה והמבוגרת בכליות יונקים 44-50. מספר מחקרים שבחנו את הכליה העוברית דג הזברה להדגים בבירור את פוטנציאל translational הטבוע בו כאשר יחד עם גנטיקה כימית. מסך גנטיקה כימית בוצע בשני מוטנטים דג הזברה שמופו לpkd2 גנים וift172, אשר ידוע להיות שחקני מפתח במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34. המסך הביא זיהוי deacetylase פאן-היסטון (HDAC) מעכב trichostatin (TSA) כמולקולה קטנה שיכול לבטל את הפגמים מורפולוגיים נראים בדרך כלל בעוברי המוטציה. גישה שונה ננקטה על ידי דה Groh ועמיתים הוקרנה תרכובות הinducבצקת ed בעוברי דג הזברה wild-type, דבר המצביעים הפרעה בתפקוד כליות 35. לאחר זיהוי PTBA כלהיט, הם הבחינו כי בנוסף לגרימת בצקת, PTBA גם הגדיל את הביטוי של pax2a, סמן לאבות כליות. חשוב לציין, נגזר ממוטב של PTBA אז הראה ירידת התמותה אחוזים של דג הזברה מבוגרת שעברה נזק לכליות הנגרם גנטמיצין ויתר על כן, האיץ את ההתאוששות של עכברים שסבלו מנזק כלייתי 27. יחדיו, תרומות אלה מגנטיקה כימית דג הזברה להציג הסוגים של תגליות שיכולים להתבצע תוך שימוש בשיטה שתוארה בפרוטוקול זה. למרות שמחקרי גנטיקה כימית נושאים הכשרון ניכר, זה לא בלי אתגרים מסוימים. אך ורק תוך שימוש בגישה גנטיקה כימית יכול לעשות את זה מסובך כדי לקבוע את הגן הספציפי או גנים המושפעים מתחם. גם אם יעד (ים) נמצא, siפער gnificant יכול להישאר בין הזדהות מתחם והבנת המנגנון (ים) של פעולה שבה המולקולה הקטנה מתנהגת. לדוגמא, זה יכול להיות קשה לקבוע את המנגנון שבו מולקולה קטנה פועלת כי מתחם אחד מסוגל לנהל מגוון של אפקטים שונים בתוך האורגניזם. עם זאת, עם כניסתו של טכנולוגיה חדשה והמסכים גנטיים כימיים יותר הושלמה בדג זברה, הבעיה של קביעת מנגנון מתכווצת. שיטה אחת כדי לקבוע את ההשפעות מולקולריות של תרכובות שזוהו היא לבחור ספריית תרופות של bioactives הידוע להקרנה, שבו מנגנונים ניתן להסיק שעלולה להיות מהנתונים מבואר בעבר. בנוסף, אלגוריתמי chemoinformatic, כמו שער גילוי, זמינים לשימוש שיכול להשוות דמיון מבני של מתחם מול מסד נתונים של תרכובות עם מנגנונים מיוחסים 14. דרך נוספת על מנת להבהיר את המנגנון של מתחם תהיה ליצור MICRoarray פרופיל לאחר טיפול ולאחר מכן לבצע שאילתא פרופיל זה באוסף של פרופילי תרופת microarray, כגון קישוריות מפה, מחפשת תרכובות מוגדרות באופן מכניסטי שתעוררנה אפקט דומה 14. גם גישה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות גנטיות שיש לו השפעה דומה לזו של תרכובת של עניין. מציאת קשר בין מתחם ומוטציה יכולה להציע שהמתחם פועל במעלה הזרם או במורד הזרם מולקולריים של הגן קשור, אשר יכול להיות שמסומן על ידי טיפול במוטציות עם המתחם וmorpholinos. אפשרות נוספת תהיה ספקטרומטריה, שממשיכה להיות אופטימלי יותר לדג זברה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להתוות שינויים ספציפיים חלבון או שלאחר translational שינויים לאחר טיפול תרופתי. לבסוף, מולקולות קטנות או אפילו ספריות שלמות הן לפעמים מסוגלים להיות מתויג לנפתח של שותפים המחייבים. זה גם ראוי לציין, כי בעוד שהמנגנון של איך פונקציות מולקולה קטנות אנישל יבוא משמעותי, יש תרופות שאושרו ע&quot;י ה- FDA שלמנגנונים אינם ידועים. למרות שדג זברה תערוכת קווי דמיון רב ליונקים שני גנטית ופיסיולוגי, יש עדיין בעיה של מוצלב התרופה 14. מחקר בדק את היכולת המוצלב של הלהיטים ממסך למעכבי מחזור התא בעוברי דג הזברה 50. המסך גרם לזיהויו של 14 להיטים שלא היו ידועים קודם לכן לבעלי פעילות מחזור התא. מתוך 14 תרכובות אלו, 6 נמצאו כבעלי פעילות מחזור תא בשני מבחני תרבית תאים אנושיים ודג זברה, 3 הוצגו להיות סרום מומת במבחני תרבית תאים, 1 היה פעיל רק בתאי דג הזברה, ו- 4 לא היו פעילות בכל אחד מ דג הזברה או מבחני תרבית תאי אדם, אבל רק בכל אורגניזם דג הזברה. יש לציין, 4 תרכובות שרק פעילות בדג הזברה מראות כי יש הבדלים בין דג הזברה ויונקים שעשויים prohiנשך את פוטנציאל translational של תרכובות מסוימות. זהו שיקול חשוב להיות מודע ל, עם זאת יש דוגמאות של מולקולות קטנות, כמו PGE 2 שמגביר את היכולת של HSCs לנקלט במקבלים אנושיים וPTBA נגזרים המשפרים את קצב התאוששות כליות אצל יונקים, ובכך לספק ההוכחה עיקרון מוצלב שאפשר 23,31-33. ללא קשר למלכודות הללו, גנטיקה כימית וגישה מינימאלי-משאב זה יש הרבה מה להציע לקהילת המחקר. גנטיקה כימית שימושית במיוחד בדג הזברה ותמשיך לשחק תפקיד קריטי בחקירת מסלול מולקולרית וגילוי סמים. מסכי כימיים המבוססים על מטרות מולקולריות בדידות שהיו בשיעור כישלון גבוה מבחינה היסטורית בשל מה שמכונה קבוצת הכוכבים של ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ומאפיינים טוקסיקולוגית (ADMET) 51. מסכי כימיים ניצול דג הזברה ללהתמקד בתהליך, ולא יעד דיסקרטי, יכול לעקוף כמה בעיות ADMET ולזהות תרכובות שנמצאות יעילים בהקשר של האורגניזם כולו. עם הבריכה הולכת וגדל של משאבים זמינים למחקר דג הזברה, כוללים זנים מוטנטים הנוכחיים ואת היכולת להשתמש בעריכת הגנום ליצור מוטציות גנטיות ממוקדות וtransgenics, יש כמעט מספר בלתי מוגבל של מסכים גנטי כימי פוטנציאלי באמצעות דג הזברה. ספריות כימיות רבות כבר אצרו, ואוספי תוחלת עם bioactives הידוע, תרכובות רומן, מבחינה מבנית מגוונות ומבני דומות. ריאגנטים אלה מספקים שפע של הזדמנויות עבור שילובי מסך שכרגע זמינים וצפויים לגדול עוד יותר בשנים הקרובות. עם אפשרויות אלה ביד, פרוטוקול ידני ותפוקה גבוהה זה מספק דרך מעשית וידידותי למשתמש כדי להגדיל את היכולת של קבוצות מחקר לבצע מסכי גנטיים כימיים באמצעות דג הזברה.

זיהוי של סמי מרפא יעילים לטיפול במחלה אנושית הוא סוף המשחק להרבה חוקרים ביו-רפואיים. בעוד זיהוי והאפיון של סוכנים תרופתיים פוטנציאל ליישומים קליניים יש ערך ברור לבריאות, היא נותרה אתגר משמעותי. סופו של דבר, את הפיתוח של תרכובות רבות טיפוליות מגיע מהידע של איך סוגי תאים מסוימים או לפתח או פונקציה. דג הזברה, Danio rerio, היא חוליות מים מתוקים של משפחת Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל הזרם המרכזי בביולוגיה התפתחותית 1. דג הזברה הן גנטי חוליות צייתניות כי הם קל לשמור ולטפל במחקרים מדעיים 2,3. עוברים דג הזברה הוא שקוף, מופרה חיצוני, ויכול להיות מיוצר על ידי מאות מזוג הזדווגות מבוגר יחיד בשבוע 2,3 בלבד. יתר על כן, מערכות דג הזברה מניות עיקריות באיברים ויש ד גדולegree של דמיון גנטי ליונקים, כולל בני אדם 4. באופן מפתיע, 70% מהגנים באדם יש orthologue דג הזברה 4. בשל דמיון זה, דג הזברה הייתה מערכת ניסיונית רלוונטית ביותר לחקר המנגנונים של התפתחות חוליות ופיזיולוגיה, והיית מועסק לשחזר מספר רב של מחלות בבני אדם 5-7. מסיבות אלה, בין השאר, הפכו את המועמד אידיאלי דג הזברה להמשך חקירות גנטיות והביאה לייסוף במגמת עלייה מתמדת לשירות של דג הזברה במחקר ביו-רפואי 6,7. במהלך העשורים האחרונים, שפע של כלים גנטיים פותחו בדג הזברה. הגנום דג הזברה ניתן לmutagenesis וtransgenesis 3. עד כה, שפע של קדימה לאחור מחקרים גנטיים בוצעו, הוביל לדור של מעל 9,000 מוטציות 3. יתר על כן, קווים מהונדסים רבים יש להיותen יצר, אשר איפשר התיוג ובידוד של סוגי תאים מסוימים 3. היו מאמצים מתמשכים משמעותיים לרכז ולחלק את המשאבים הללו לקהילת המחקר, אשר נגישים למעבדות בעלות נמוכה למדי באמצעות מרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (Zirc) 8. יתר על כן, מאגר נרחב של מידע ביולוגי וכלים מולקולריים, הנעים בין דפוסי ביטוי גנים לMorpholino רצפים ופרוטוקולים, כבר מבואר בהדרגה ברשת הזברה המידע (ZFIN) 9-11. תשתיות מחקר דג הזברה אלה מתאפשרות באמצעות תמיכת NIH משמעותית וסנגור של מודל זה חי 8. מטמון זה של מוטנטים דג הזברה, קווים מהונדסים, ומידע רלוונטי ממשיך להיות של ערך יוצא דופן לקהילת המחקר הביולוגית בכללותו. עם זאת, בזמן שדג זברה היא עכשיו אורגניזם מודל מבוסס היטב ומראש יחסנים, הם מייצגים להrgely מאגר שלא נוצל ללמוד ביולוגיה ומחלות התפתחותיות באמצעות השימוש במסכים גנטיים כימיים. גנטיקה כימית היא השימוש במולקולות קטנות, כגון תרופות או חומרים אחרים, כדי להשפיע על תהליך ביולוגי בתוך מערכת חיים 12. יכולה להיות מיושמת גנטיקה כימית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד גן, כגון לזהות סוכני הצלה שאו להחמיר פגם גנטי ספציפי 12. יתר על כן, גנטיקה כימית מייצגת שדרת אחת גדולה בכדי לבצע מחקר translational 12. בעוד מסכי גנטיים קדימה מסורתיים במודלים של בעלי חיים היו מאוד חזקים בקישור גנים ספציפיים למחלות, שאין להם ממד זמן, ולכן קשה או לפעמים אי אפשר לצפות פנוטיפים שיקומו לאחר עובר מוקדם. בנוסף, יתירות גן יכולה להפוך את התוצאות שנצפו מגנטיקה קדימה קשה לפרש. לחלופין, מסכי גנטיים כימייםלאפשר לשליטה זמנית בסדר ובו זמנית מספק נקודת התחלה רבת ערך לגילוי סמים 12,13. ניתן לבצע גנטיקה כימית באמצעות במערכות חוץ גופית (לדוגמא, שורות תאים, חלבונים) או באמצעות מערכת in vivo, כגון האורגניזם כולו. שימוש במערכת במבחנה לגנטיקה כימית יכולה להיות מועילה, כי זה פשוט יותר מאשר מערכת האורגניזם שלמה, קל יותר לעבוד עם בקנה מידה גדול, פחות יקר, ופחות זמן רב. כתוצאה מכך, במבחנה מערכות מאפשרות לשניהם תפוקה גבוהה הקרנה (HTS) וגבוהה הקרנת תוכן (HCS). יש מספר היתרונות לשימוש במערכת במבחנה שיש לשקול בעת התקרבות גנטיקה כימית, אלא גם מגבלות משמעותיות. מגבלה עיקרית אחת לשימוש בשורת תאים היא שמולקולות קטנות יכולות להיות יעילות ולא רעילים בשורת תאים ספציפית, עדיין להיות רעיל כאשר הציגו את האורגניזם כולו. כך, עיקרמהעניין הוא שבמבחנת מערכות אינן ממצות את ההקשר הרחב של האורגניזם ובשל כך אינן תמיד מסוגל לחקות במדויק את מה שקורה באורגניזם שלם. בעוד בדיקת מתחם בכל האורגניזמים יכולה לעקוף בעיות אלה, השימוש במודלי האורגניזם שלמים יונקים מציב מספר המגבלות פיזיות ומוסריות. לדוגמא, הקרנת סמים בעכבר מתעכבת מבחינה לוגיסטית על ידי המרחב וההוצאות הדרושים כדי לבדוק גודל מדגם הולם. בנוסף, שאלות התפתחותיות יכולות להיות קשות ללמוד, בשל העובדה שהיונקים להתפתח ברחם. לבסוף, בעוד שההתנהלות של מחקר הביו-רפואי יש ערך חברתי עצום, יש בכל זאת צרכי משמעותיים כדי להגן על רווחת בעלי חיים על ידי הגבלת לימודים אינטנסיביים והקלת הכאב וסבל של בעלי חיים המשמשים למחקר. דג הזברה תהווה תחליף בר-קיימא לעבודה עם חוליות גבוהות כמו יונקים, ויתר על כן, ניתן ללמוד נושאים רבים באמצעות גנטיקה כימית בהשלבים העובריים וזחל כאשר עיבוד נוירולוגיות נעדר או אופרטיבי ברמה נמוכה 12,13. עד כה, מספר עצום של מסכי גנטיים כימיים בוצעו שימוש בעוברי דג הזברה בפרט, כמסירת מתחם יכולה להיות מושלמת על ידי שיקוע של עוברים בתקשורת המכילים את התרופה של העניין 12-15. יתר על כן, הייתה התקדמות מדעית וטכנולוגית רבות כדי להפוך את המסך גנטי כימי אפשרי והניהול 16-20. פיטרסון ועמיתיו היו הראשון שהשתמש בדג זברה במסך גנטי כימי בשנת 2000, ומאוחר יותר בשנת 2004 זוהה תרכובת שדוכאה מוטציה קוארקטציה של אב העורקים ב21,22 דג הזברה. מסכי כימיים מאז יושמו ללמוד כמה רקמות מתפתחות (לדוגמא, לב, דם, כלי) 23-25, פונקציות פיסיולוגיות (למשל, בסיס הנוירולוגי להתנהגות) 26, התחדשות מבוגרת 27,28, וdiseas<html> מודלים דואר (לדוגמא, מחלת ניוון שרירים וסרטן) 29,30. מבין המסכים כימי דג הזברה אלה, הגילוי שפרוסטגלנדינים להסדיר בתאי גזע hematopoietic נלקח לניסויים קליניים בבני אדם, הממחיש את הכח לעבור מ&quot; טנק למיטה &quot;23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). לאחרונה, תרופות מועמד מבטיחים צמחו לאיברים מורכבים כמו הכליות, שתקנו פתולוגיה הסלולרית במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34 וניזק כלייתי חריף 27,35, אם כי אלה עדיין לא לעבור לניסויים קליניים. מסכי גנטיים הכימיים אלה באופן רחב להדגים את התועלת של בדיקת תרכובות קטנות של דג הזברה פיתוח והיכולת ליישם את גנטיקה כימית לחקור תפקוד רקמות בוגר. יתר על כן, יש רשימה הולכת וגדלה של אוספי פרמקולוגיה זמינים מסחרי הניתנים ללימודים אקדמיים 19. ove_content &quot;&gt; בשנים האחרונות, חל התקדמות בולטת בטכנולוגית סינון גנטית כימית, כוללים השימוש במערכות אוטומטיות של רובוטים מחלק סמים וטיפול, יחד עם מערכות הדמיה אוטומטיות 36-38. מערכות כאלה מאפשרות לאפשרות של בדיקת אלפים רבים של תרכובות להשיג שני HTS וHCS 36-38. למרבה הצער, ההתחייבות של מסכי גנטיים כימיים עם ארגונים רובוטית החדשניים אלה בדרך כלל דורשות משאבים רבים. משאבים אלו סוגי מכשול משמעותי למוסדות רבים שאין להן ההון כדי לרכוש , תתפעל, תתחזק ומכשור כזה. בזמן הקמת התשתית לטיפול רובוטית של ספריות כימיות, ובכלל זה העברת עוברים לערוכות צלחות, נשאר עלותו למעבדות רבות, הדמיה ממוחשבת, ובניתוח היא בדרך כלל נגישה יותר 12. הקרנת תמונה אוטומטית מאפשרת כימות מחדש מהונדס ניאוןסבלים ומאפשרים ניתוח פנוטיפי הספציפי 12,15. למרות שמערכות אוטומטיות מייצגות התקדמות טכנולוגית שימושית, ניתן לטפל שאלות רבות על ידי מסכי מדריך לממוקדים יותר, כגון השאילתה של כמה אלף תרכובות פעילות ביולוגית על תהליך התפתחותי עם כל הר הכלאה באתר קריאה (רוצה) 39. יתר על כן, בעוד שמספר הולך וגדל של מעבדות לגייס לעזרתם מסכי כימי דג הזברה לחקור שאלת מחקר, כמה הרוויה ונושאים רבים (אם בכלל) מאמצים הגיעו טרם נפרצו בעזרת גנטיקה כימית. ניתן לבצע מסכי כימיים באמצעות מושבה דג הזברה קטנה המכילה רק כמה סוג בר או טנקים מהונדסים. לכן, זה סוג של חקירה גנטית צריך להיות בר-השגה על ידי רוב קבוצות מחקר דג הזברה מעוניינת להרחיב / גיוון לזירה זו. ספריות כימיות בגדלים שונים יכולות להיות רכש ממפיץ ו / או col מסחרייםlaborators. מסיבות אלה, גנטיקה כימית יכולה להיות כדאי מבחינה כלכלית גם באקלים מימון קשה. עם זאת, ישנם מכשולים למתחילים מסך גנטיקה כימית, כגון איך לתכנן היבטים לוגיסטיים של המסך: למשל, באופן ידני דגימות תהליך של מצבת כוח האדם הדרוש למסך מוצלח, הקצאת הזמן הייעודי ולצרף יחד פרוטוקול פיזי מספר שממאה לכמה אלף. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעובר דג הזברה עם רצון כמו קריאה מתוך. שיטה זו כרוכה טיפול תרופתי של עוברי דג הזברה, ואחריו זיהוי riboprobe של תעתיקי mRNA. שימוש בפרוטוקול זה, צוות קטן או אפילו אדם אחד יכול להקרין באופן סביר ולנתח ספרייה כימית צנועה כ -600 תרכובות בפרק הזמן של 9 שבועות.

<table><tbody><tr><td>0.1 - 10 &amp;#956;l natural pipet tips</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td></td><td></td><td>Generate using 50x E3 and DI water.</td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS.</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>12-well staining dish</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3226</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1x PBS</td><td></td><td></td><td>Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>48 well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>50x E3</td><td></td><td></td><td>Generate 16.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 16.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water.</td></tr><tr><td>96 deep well plate</td><td>VWR</td><td>100-11-940</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate sealing mat</td><td>VWR</td><td>10011-946</td><td></td></tr><tr><td>anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>BCIP stock</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>block solution</td><td></td><td></td><td>Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &amp;deg;C.)</td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin) stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &amp;deg;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &amp;deg;C.)</td></tr><tr><td>DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Consult the manufacturer procedure.</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformaldehyde)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>embryo incubation dish</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S 20-300 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>22492284</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and 100% EtOH then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>FCS (fetal calf serum) stock</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>filter sterilization unit</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>0.45 &amp;#956;m CA / 1 L volume</td></tr><tr><td>fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td></td></tr><tr><td>flat-bottom microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>glass basin 90 x 50</td><td>Kimax Kimble</td><td>23000</td><td></td></tr><tr><td>glass pipette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>glass vial</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 &amp;#956;l/&amp;#956;l heparin</td></tr><tr><td>INT stock</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Then fill with deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 2 L and autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>mesh tea strainer</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>molecular grade distilled water</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.019</td><td></td></tr><tr><td>multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;#956;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>NBT stock</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O - freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Film adhesive</td><td>Eppendorf</td><td>30127.48</td><td></td></tr><tr><td>plate container (Pencil Box)</td><td>Sterilite</td><td>1722</td><td></td></tr><tr><td>pre-staining buffer</td><td></td><td></td><td>Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>RNase 1 inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>rubber bulb</td><td>Fisherbrand Fisher Scientific</td><td>03-448-22</td><td></td></tr><tr><td>staining solution-purple</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Generate using 45 &amp;#956;l of NBT and 35 &amp;#956;l of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.</td></tr><tr><td>staining solution-red</td><td></td><td></td><td>Generate using 31.5 &amp;#956;l of INT and 35 &amp;#956;l of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.</td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>transfer pipet</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>(Model # 2831)</td></tr></tbody></table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

דג הזברה הפכה אורגניזם מודל בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ביולוגיה התפתחותית ולמחקר של מחל מחלות של בני אדם בשל המידה הניכרת של שימור גנטי בבני אדם. גנטיקה כימית כרוכה בבדיקת ההשפעה שיש לי מולקולות קטנות בתהליך ביולוגי והופכת לשיטת מחקר translational פופולרית לזהות תרכובות טיפוליות. דג הזברה פונה באופן ספציפי לשימוש עבור גנטיקה כימית בגלל היכולת שלהם לייצר אחיזה גדולה של עוברים שקופים, שמופרים באופן חיצוני. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים להיות בקלות בסמים מטופלים על ידי התוספת הפשוטה של ​​מתחם לתקשורת העובר. שימוש בכל הר הכלאה באתר (רוצה), ביטוי mRNA ניתן בבירור דמיין בתוך עוברי דג הזברה. יחד, בעזרת גנטיקה כימית ומאחלים, דג הזברה הופכת הקשר האורגניזם שלם חזק בו כדי לקבוע את סלולארי ופיזיולוגיהשפעות של מולקולות קטנות. התקדמות חדשנית נעשתה בטכנולוגיות שעושות שימוש בהליכי מיון המבוסס על מכונה, אך למעבדות רבות אפשרויות כגון אינן נגישות או להישאר עלות אוסרני. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע מסך מדריך לתפוקה גבוהה כימי גנטי שדורש משאבים בסיסיים ויכולים להתבצע על ידי צוות בודד או קטן אחת בתקופה יעילה של זמן. כך, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה אפשרית שיכול להיות מיושמת על ידי קבוצות מחקר לבצע גנטיקה כימית בדג זברה, אשר יכולה להיות שימושית להשגת תובנות יסוד לתהליכים התפתחותיים, מנגנוני מחלה, ולזהות תרכובות חדשות ומסלולי איתות שיש לי יישומים רלוונטיים מבחינה רפואית .

הגישה הידנית המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה לנהל תפוקה גבוהה גנטיקה כימית מולקולה קטנה מסך באמצעות מודל דג הזברה עובר (איור 1). באמצעות שיטה זו, זה מעשי לאדם אחד לבצע מסך גנטיקה כימית, כך שבמשך 9 שבועות אדם אחד (מחויב לשבוע עבודה של 40 שעות) יכול לבצע את סקר של כ -600 תרכובות (איור 1) . כך, בפעם הספסל של אדם אחד יכולה לעקוף את הצורך בציוד בדרישה גבוה משאבים, מערכות אוטומטיות כמו. Trade-off הוא שמסך ידני דורש מספר שבועות של מאמץ ייעודי. בניגוד לכך, השימוש במערכות אוטומטיות יכול לדחוס את הזמן הכרוך ב1-2 שבועות של זמן רובוטית, ועלולים להיות כרוכה במאמץ חוקר יחסית מינימאלי כוללת. אחת דרכים להגדיל את היעילות ו / או היקף מסך במדריך היא לגייס 2-3 חוקרים בסך הכל, שתאפשר הקרנה מ &#39;תרכובות עפרות, ריכוז תרכובת שונה, ו / או הקרנה על פני תקופה קצרה של זמן. מעורבים בפרוטוקול כדי להשלים מסך גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם קריאת משאלת הצעדים העיקריים מומחשים כתרשים זרימה (איור 2). ניתן לחלק את משימות הניסוי לשני סוגים של שבועות עבודה: (1) חשיפה לכימיקלים ותיוג עובר, ו- (2) ניתוח והדמיה. בשבוע עבודת חשיפה לכימיקלים, צעדים אלה כוללים הקמת מבוגרים דג הזברה (יום 1), אוסף עובר, עובר עֲרִיכָה וטיפול תרופתי (יום 2), הכנת עוברים לכלאה באתר (יום 3), וכלאה באתר (יום 4 -6). בשבוע ניתוח / הדמיה, חוקר מנתח ביטוי mRNA להבקיע עוברים ולהיטי תמונה (יום 7-11). חלק קריטי בביצוע מסך גנטיקה כימית הוא לתייג גם באופן עקבי ומדויק במקומות. כp מסך גנטיקה הכימיתrocess מפורט כאן כרוך בהעברת קבוצות של עוברים מהיטב בצלחת אחת לגם בצלחת שונה מספר פעמים, את הצורך בתיוג מדויק וברור הוא בעל חשיבות עליונה, כך שכאשר להיט כימי הוא הבקיע זה יכול להיות ליניארי ובקלות נעוצים לזהותה בתוך הספרייה הכימית (איור 3). דרך קלה כדי לוודא שזה היא תווית הצלחות בצורה כזאת, כי בכל עת את המיקום גם עבור קבוצה של עוברים שטופלו על ידי תרכובת ישירות מתאים למיקום הכימי ספריית צלחת תרופה גם של המתחם משמש לטיפול בעוברים אלה (איור 3). כאן, מערכת כפולה של תוויות צבע קידוד ומספריים היא מנוצלת כדי לארגן את הדגימות, שנוספו לצלחות המסך באמצעות סמנים קבע (איור 3). כאשר מנתחים את התוצאות של מסך תפוקה גבוהה, יש צורך קריטי לפתח שיטה לארגן בצורה נכונה, ביאורים, ולנתח את המולקולה קטנה פוטנציאליתלהיטים. לכן, מסך גנטיקה כימית חייב להיות מערכת לדירוג יסודית וברורה שתוכננה בקפידה וציית באופן קפדני ל. מערכת כזו צריכה בקלות ובאופן מוחלט להעביר את הדינמיקה החשובה של מתחם ולספק דרך תמציתית להציג את התוצאות של המסך המוגמר. אחת דרכים לבנות מערכת כזו היא עוברי כיתה באמצעות מערכת כיתה, מה שמסביר את החומרה מורפולוגיים כוללת וביטחון של להיט. יתר על כן, הקטגוריות המעמדיות יכולות להיות בשילוב עם (+) או (-), כדי לתאר השפעה מרחיבה או מצמצמת באזור (ים) של עניין. כאן, עוברי דג הזברה היו נתונים לתרכובות בודדות מספרייה ביו (אנזו כימיקלים) מepiboly 50% ל- 24 hpf, ולאחר מכן assayed ידי משאלה באמצעות קוקטייל של שלוש riboprobes לזהות פלחי נפרון (איור 4 א). כמערכת לדירוג דוגמא, גם שמכיל קבוצה של עוברים שהיו לי convolu הפרוקסימלי מוגדל באופן דרמטיאבובית טד (PCT) של כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה העוברית דג הזברה, תגרום למתחם המשמש לטיפול שכן להיות מסווג כ( Class I), אשר במקרה זה היה לייצג את המעמד הקשורות לפגם החמור ביותר וברמה הגבוהה ביותר של אמון בפנוטיפ נצפה (איור 4). המתחם היה אז להיות מבואר ב( PCT) ו( +), להיות סימון המלא (Class I - + PCT) (איור 4). תפיסה זו של סיווג מספקת דרך פשוטה ומהירה כדי לתאר מידע רב הנוגע למולקולה קטנה של עניין, ובכלל זה את חומרת השפעת התרכובות על האורגניזם, האזור שמושפע מהסמים ואת האופן שבי האזור מושפע (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. &amp; #160;. אסטרטגית מסך כימי עובר דג הזברה ידנית חוקר יתכן יכול לבדוק צלחת גם 96 של כימיקלים על עוברי דג הזברה ולבצע עיבוד המשאלה הבא במהלך שבוע אחד. ביצוע שבועיים של בדיקות כימיות (שבוע 1 (יום 1-6) ושבוע 2 (יום 7-12)) ניתן לשייך שבוע המוקדש ללדגום ניתוח שלישי. כ יכולות להיות הבקיע שתי צלחות 96 שווה של דגימות מסך וצלמו שבוע 3 (יום 13-17). תרחיש זה מסתכם בהקרנה של כ -200 תרכובות בתקופת זמן 3 שבוע, שהשוותה ל ספרייה קטנה של כ -600 תרכובות הוקרנו לחלוטין על ידי 9 שבועות. אסטרטגית מדריך זה יכול להיות שונה בהתאם למשאבים הזמינים. לדוגמא, שלושה חוקרים יכולים להפחית את הזמן כדי להשלים את המסך של כ -600 תרכובות עד 3 שבועות בהשוואה ל 9 השבועות זה ייקח עם חוקר אחד. ניתן להתאים אסטרטגיות סקירה על ידי הקצאת חוקרים להיבטים ספציפיים של המסך, כגון טיפול תרופתיment וכלאה באתר או מכוונים את החוקרים לבצע באופן עצמאי את תהליך המיון כולו בחלקים נפרדים של הספרייה הכימית. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> תרשים זרימה 2. איור:. פירוט העבודה מסך 6 ימים תהליך המיון הכימי יכול להיות שבור למטה דיסקרטית ל -6 ימים. יום 1 מורכב של הקמת זוגות הזדווגות דג הזברה (= /&gt; 25) לספק עובר לכל צלחת גם 96 שיוקרה. היום 2 כרוך באיסוף עובר מן תאי ההזדווגות ועֲרִיכָה בצלחת גם עמוקה 96, ואחריו טיפול תרופתי. ביום 3, עובר מוכנים לתרצה, כולל dechorionation, קיבעון רקמות, והתייבשות עובר. לבסוף, רצון הוא מבוצע בעוברים דרך יום 4-6. אנא שים לב כי נהלי צביעה חלופיים על דגימות קבועות יכול להיות בקלות שלubstituted למשאלה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> סכמטית איור 3. פלייט תיוג העברה. עוברי דג הזברה מפוזרים וסמים שטופלו בצלחת גם 96 ולאחר מכן עברה לצלחת גם 24 להסרת פסולת וחשיפת pronase. אז העוברים עברו 48 צלחות גם להכנת עובר, תרצה, וקיבוע רקמה. בשלב הבא, עוברים מועברים 12 צלחות גם לניקוד, הדמיה, ואחסון. עֲרִיכָה המדויקת של עוברים מושגת על ידי השימוש בשיטת קוד-צבעים, המאפשרת לחוקר לעקוב אחר כימי ממוצא עבור כל מדגם בדיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,063 / 52063fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; מערכת איור 4. דוגמא לדירוג:. assay פילוח כליות ניסוי מאחלים מאפשר לחוקר להכתים סוגי תאים ספציפיים המבוססים על הזהות של הבדיקות שנבחרו, ומאפשר ההערכה של שינויים בפנוטיפים עובר בהתאם לשינויים במיקום שעתוק mRNA ו / או רמות. כדוגמא, שלושה מגזרים של הכליה העוברית דג הזברה, כִּליַת רֵאשִׁית, תויגו באמצעות מיקס מסך 1. מערבבים מסך 1 הוא קוקטייל של בדיקות מורכבות של wt1b, אשר דווקא localizes בpodocytes (P), slc20a1a אשר מסמן את הפרוקסימלי מפותל אבובית (PCT), וslc12a1 אשר תוויות המגזר המוקדם דיסטלי (DE) 47. סמל (+) לצד תווית אזור משמש כדי להוסיף הערות על ההתרחבות או שינוי חיובי של האזור, ואילו (-) שימוש בסמל למכתיב את ההתמעטות של אזור. הנה, אותםיש לי bryos סמים מטופלים עם RA 13-cis אבובית הפרוקסימלי מפותל מוגדלת והפסד של המגזר המוקדם דיסטלי ללא השפעה נראית לעין על podocytes מלא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

a-manual-small-molecule-screen-approaching-high-throughput-using

Research

JoVE Journal

Biology

17.5K Views.  University of Notre Dame.  דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה. 

Video: A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Developmental Biology

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Environment

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Immunology and Infection

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscience

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicine

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

בדיקת בהלה להערכת רעילות בעובר דג זברה

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

מחבר באור הזרקורים: בדיקת רעילות בתפוקה גבוהה באמצעות בדיקת תגובת בהלה של עובר דג זברה

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה