This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

التحضير 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور خط GAL4 3،22 سائق لUAS-GCaMP5G 19 الذباب (ث 1118؛ P {20XUAS-الحبس الاحتياطي، GCaMP5G} attP40). السماح للصليب أن تنمو في درجة حرارة 25 درجة مئوية. ملاحظة: توليد يطير مع نسخ متعددة من الجينات المحورة GAL4 أو UAS-GCaMP يمكن أن تساعد على تعزيز كثافة إشارة الفلورسنت. أظهر إصدار سابق من التحوير UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ضعيف جدا كثافة مضان عندما أعرب تحت سيطرة السائق Gr68a-GAL4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ومنفصلة حسب الجنس eclosed حديثا الذباب الكبار وزيادة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. ملاحظة: المستوى الأساسي من GCaMP5G تنوير هو الأمثل في الذباب الذين تتراوح أعمارهم بين 14-28 يوما. عزل الذباب حسب الجنس يحول دون إمكانية التفاعلات الاجتماعية التي قد تؤثر على الاستجابات العصبية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ذبابة تحت تيار خفيف من CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق ولاي لساترة الزجاج عن طريق وضع أول قطرة صغيرة من طلاء الأظافر في وسط ساترة 0.17 مم. وضع بلطف ذبابة على جانبها على قطرة من طلاء الأظافر واضحة والتأكد من أن الانخفاض بأكمله تغطيها الطاير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات 1.5 و 1.6 تحت مجهر تشريحي تشريح، وتستخدم في 8X التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة على مد الرجل الاماميه من الطيران. تأمين الرجل الاماميه في الموقف من خلال وضع اثنين من شرائح رقيقة من الشريط فوق الأولى والخامسة قطاعات الجفن (الشكل 2A). وهذا فضح شرائح الجفن T2-T4 للتصوير (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الخلايا العصبية الصورة على خرطوم الفيل، ضع شريطا ضيقا من الشريط على المنصة للخرطوم لفضح labellum (الشكل 2C، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم حاجز مسعور حول الطاير مع القلم PAP لمنع الحل من التدفق على سطح ساترة. إجراء قياسات في غضون 30 دقيقة من تصاعد. </li></ol> 2. إعداد خطة التحفيزحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع بروابط محبة للدهون (مثل CH503، المستخدمة في هذه الدراسة) في حل PBST: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 0.1٪ تريتون X-100 (ت / ت )؛ ودرجة الحموضة 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 1 ملغ / مل محلول المخزون من يجند باستخدام PBST. إعداد جميع التخفيفات لاحقة من محلول المخزون باستخدام PBST. ملاحظة: اعتمادا على ذوبان يجند من الفائدة، قد تكون هناك حاجة المذيبات المختلفة إلى حل يجند. ووصف ذوبان CH503 في المذيبات المختلفة في الجدول 1. وخلافا لغيرها من المذيبات، لم PBST لا ينتج زيادة في مضان. </li></ol></li></ol> 3. تحفيز الخلايا العصبية ذوقي والحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor 10 ميكرولتر، ضع 10 ميكرولتر من PBST على قطاعات عظم الكعب. ملاحظة: يرطب هذه الخطوة الساق ويمنع قطاعات الجفن من الانجراف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نظام بصري أن يحتوي على كاميرا من سوسرعة fficient وحساسية لتحقيق إشارة مضان جيدة في قرار الأوان. ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة كنا قرص الغزل المجهر متحد البؤر وكاميرا sCMOS (انظر قائمة المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار شريحة والخلايا العصبية الرصغي محددة للتصوير. الحصول على ثلاثة قبل التحفيز مبائر Z-المداخن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الناحية المثالية، إعدادات استخدام الاستحواذ، والتي هي سريعة بما يكفي للسماح قرار الوقت القصوى في حين لا يزال الاستيلاء على حجم الخلية بأكملها. ضبط اكتساب سبيل المثال هي: 200 التعرض مللي ثانية، binning 2 × 2 و 6 × 0.5 ميكرون 2 المقاطع البصرية، والقبض على كل 2 ثانية. ملاحظة: تم تصوير الساقين مشلول بنجاح لمدة تصل إلى 10 دقيقة، في 30 ثانية فترات، مع تبييض لا يمكن تمييزه من إشارة GCaMP. للمرة تسجيل أطول، تأكد من أن الساقين وعقد بحزم شديد في مكان على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين قوة الليزر لأعلى إشارة إلى الضوضاء يمكن تحقيقه مع الحد الأدنى من photobleaching من خلال معهد العالم العربي بأكملهجينج النظام. لوصف التجارب هنا، استخدم 491 نانومتر ليزر ديود (100 ميغاواط) في نقل 30٪ للتصوير على حد سواء Gr68a والذوقية ppk23 الخلايا العصبية على الساقين وخرطوم. استخدام 2 × 2 binning للسماح مرات التعرض أقصر في حين لا يزال تحقيق القرار المكانية كافية. ملاحظة: تم الأمثل إعدادات الطاقة ليزر للسماح للكشف عن تغيير الفلورسنت تتراوح بين زيادة 1.2- إلى 4.5 أضعاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 10 ميكرولتر من الحل التحفيز على قطاعات عظم الكعب. لتجارب السيطرة، إضافة 10 ميكرولتر آخر من PBST. على الفور الحصول على 117 وصور ما بعد التحفيز. ملاحظة: يعتمد عدد الصور بعد التحفيز حصلت على مقدار الوقت الذي تم التوصل التغيير القصوى في مضان (حوالي 2 دقيقة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة حاسمة: في حين pipetting لحل بشأن إعداد ولا للمس ذبابة مع طرف ماصة لأن هذا سوف يسبب الرجل الاماميه للخروج من الموقف. ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدموmicromanipulator لوضع بدقة الشعرية زجاجية تحتوي على مقربة من الحوافز للقطاع الرصغي إلى أن تصوير. تسليم وحدات التخزين التي تسيطر عليها من التحفيز باستخدام موزع حقن مكروي داخل الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol></li></ol> 4. معالجة الصور والتحليل: الكمي للاستجابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح سلسلة من مبائر Z-مداخن باستخدام فيجي ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 أو يماغيج ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) تحليل 24 صورة وبرامج معالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إسقاط مبلغ الشدة من جميع شرائح Z ستة لكل نقطة من النقاط الزمنية 120. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخيار &quot;المكدس&quot; تحت عنوان &quot;صورة&quot;. وعلاوة على ذلك، حدد الخيار &quot;Z الإسقاط&quot; وأدخل &quot;1&quot; شريحة بداية و &quot;4&quot;، كما توقف شريحة. لنوع الإسقاط، حدد R20؛ شرائح المبلغ &quot;من القائمة المنسدلة، واختيار&quot; جميع الأطر الزمنية &quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام أداة التحديد مرفوعة لرسم الحدود حول جسم الخلية أو الخلايا العصبية الإسقاط. انقر على علامة &quot;تحليل&quot; وحدد الخيار &quot;مدير العائد على الاستثمار&quot; تحت عنوان &quot;أدوات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان من العائد على الاستثمار عن طريق تحديد الخيار &quot;تعيين القياسات&quot;، ضمن القائمة &quot;تحليل&quot; والتحقق من صناديق لكثافة متكاملة، منطقة، يعني والحد الأقصى لقيمة الرمادي والتسمية. ثم، حدد الخيار &quot;المزيد&quot; ضمن القائمة مدير العائد على الاستثمار، وزيادة تحديد خيار &quot;مقياس متعدد&quot;. ملاحظة: هذا سيولد مربع منبثقة مع القيم لكل من المعلمات المحدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق أقصى قدر من القيم الرمادية لضمان أن أيا من بكسل وقد وصل إلى درجة التشبع (على سبيل المثال، 65535 لكاميرا 16 بت). ملاحظة: للحصول على هذه التجارب هو مبين في رتم قياس ورقته، والاستجابات إما من أجسام الخلايا العصبية أو إسقاطات، تبعا للمكان الذي لوحظ زيادة القصوى في ΔF / F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التغير النسبي الأقصى في مضان (ΔF / F) في وقت نقطة ر هي كما يلي: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان خلفية طرح من كل (الخلية) قيمة F. لقياس مضان الخلفية، وقياس كثافة متكاملة من العائد على الاستثمار من حجم يعادل وشكل من منطقة من الرجل الاماميه (أو خرطوم) يخلو من الخلايا العصبية التي يمكن اكتشافها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد ر بعد التحفيز مضان، F (الخلية)، وقياس كثافة متكاملة من العائد على الاستثمار من خلايا الجسم أو عملية في وقت نقطة &quot;تي&quot; بعد التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس مضان قبل التحفيز، F (الخلية) ر = 0، تحليل الصور قبل التحفيز من خلايا الجسم أو عملية في نفس الطريقة كماإشارة بعد التحفيز. استخدام كثافة متكاملة يعني من 3 صور لتحديد F (الخلية) ر = 0. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+taste+receptors+in+Drosophila.">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li><li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system.">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li><li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship.">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li><li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23(+)+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior.">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li><li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity.">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).</li><li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).</li><li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors.">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors.">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li><li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster:+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2.">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila.">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li><li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors.">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li><li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila.">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li><li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila.">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li><li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla.">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355 (2014).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode.">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li><li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor.">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design.">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li><li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2++imaging+of+single+chemosensory+neurons.">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+synthesis.+Part+250:+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster,+as+(3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers.">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li><li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila.">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li><li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship.">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance.">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements.">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li><li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems.">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53 (2010).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+signaling+from+O(2)+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state.">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li></ol>

The authors declare that there are no competing financial interests.

نحن هنا وصف طريقة لأداء التصوير الكالسيوم الحية من الخلايا العصبية الطرفية ذبابة الفاكهة في 2 مختلفة الحواس. كا 2+ -evoked الردود الفلورسنت GCaMP في Gr68a الخلايا العصبية الناجمة عن يجند فرمون كانت CH503 الجرعة التي تعتمد على والكمية. كان من الممكن أيضا أن نتبين مختلف ...

الحيوانات تعتمد على المعلومات الشمية والذوقية للتوسط القرارات الضرورية من أجل البقاء والتكاثر. فهم كيفية العظة حسي كيميائي يتم الكشف عنها ومعالجتها من قبل الجهاز العصبي يتطلب تحديد مستقبلات الحسية (ق) وبروابط كيميائية المقابلة. ذبابة الفاكهة كشف مجموعة متنوعة مذهلة من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة والتي تشكل نموذجا ممتازا للدراسة الفسيولوجية الآليات الكامنة chemosensation. في حين أن أجهزة الشم تنظر الجزيئات غير المستقرة، وأجهزة الذوقية المتخصصة للكشف عن المركبات تقلبات منخفضة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لقياس مباشرة الاستجابات العصبية من أجهزة طعم ذبابة الفاكهة إلى المنخفض التقلب، بروابط محبة للدهون. وتشمل أجهزة الذوقية من ذبابة اليدين، خرطوم، والأجنحة. وزعت على السطح من أجهزة طعم لا يشبه الهياكل الشعر المعروفة باسم الشعيرات التي تستجيب إلى sugars، والبيرة، والأملاح والماء والفيرومونات 8. تم تصنيف الشعيرات شكليا إلى شعيرات طعم ومذاق أوتاد 9. وهناك حوالي 31 شعيرات الذوق على labellum التي يتم تصنيفها إلى طويلة (ل-نوع)، قصيرة (الصورة من نوع) والمتوسطة (ط من نوع) الأشكال التضاريسية. و&#39;ل&#39; و &#39;S&#39; الشعيرات منزل 4 الخلايا العصبية الحسية التي تستجيب من الناحية الفسيولوجية للسكر (الخلية S)، قليل الملح (الخلية L1)، الملح العالية والمركبات المريرة (الخلية L2) والمياه (الخلية W) 10 11. و&#39;ط&#39; بيت 2 الخلايا العصبية الشعيرات الحسية، واحدة من الذي يستجيب على حد سواء لانخفاض الملح والسكر، في حين أن يستجيب أخرى إلى الملح ارتفاعه 12. هناك ما يقرب من 41 الشعيرات الذوق في الذكور و 26 من الإناث الشعيرات في توزيعها على كل من اليدين. لكل من الذكور والإناث، وهناك 21 الشعيرات على midleg، وحوالي 22 الشعيرات على hindleg 13. الخلايا العصبية الذوقية المحاطة الشعيرات الذوق على الساقين هي أيضا جlassified إلى أنواع L1، L2، W و S. واحد طريقة معيارية لقياس النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية واحدة يستخدم أقطاب الخلية أو الخلايا لتسجيل تدفق أيون. تسمح قياسات الكهربائي وظيفة الخلايا العصبية التي يتعين دراستها في الكائنات غير النموذجية مثل الأنواع ذبابة الفاكهة، العث، والنحل التي تفتقر إلى أدوات جينية شاملة لوضع العلامات العصبية. ومع ذلك، في حين أن الطرق الكهربية استخدمت بشكل روتيني لقياس النشاط من ذبابة الفاكهة طعم الشعيرات 4،13،14، وتطبيق هذا النهج يقدم العديد من التحديات التقنية. أولا، تذوق الشعر الخشن لا بد من تحديد القائمة على التشكل والموقع المكاني. على تعريف وقياس الكهربية يمكن يعوقه حجم صغير من الشعيرات، وسهولة الوصول محدودة بسبب الموقف، وصعوبة في تطبيق مجلدات تسيطر على التحفيز الكيميائي لتذوق الشعر الخشن. أيضا، وتحفيز الشعيرات قد تولد إشارات من أكثر من واحدنوع الخلايا العصبية 15. الثانية، والكشف عن إشارات كهربائية يمكن أن تتغير نتيجة للضجيج في الخلفية الناتجة عن الاهتزازات الميكانيكية والضوضاء من المعدات الإلكترونية. ثالثا، استخدام القطب شحذ يمكن أن تلحق الضرر إعداد الطاير، إذا ما استخدمت بشكل غير صحيح (14). وأخيرا، وتجميع وتلاعب الكهربية يتطلب المكونات الإلكترونية المتخصصة لتقديم الحوافز، وتسجيل إشارة، وتحليل البيانات ويمكن أن يكون مكلفا. في د. البطن، وقد سهلت توافر أدوات ترميز وراثيا لتطوير تقنيات التصوير التي تسمح ردود المجموعات الصغيرة من الخلايا العصبية التي يتعين دراستها. أحد هذه التوجهات هو استخدام لمراسل CaLexA 16. في هذه الطريقة، وتنصهر تسلسل الجينات التي تشفر عامل النسخ LexA-VP16 والكالسيوم حساسة NFAT البروتين معا. تفعيل الكالسيوم من الكالسينيورين بروتين الفوسفاتيز يحفز-الفسفرة دي من NFAT، وبدوره، facilitaقسم التدريب والامتحانات وارداتها إلى النواة. داخل النواة، يربط المجال LexA لعزر ملزمة LexAop الحمض النووي التي توجه التعبير مراسل الأخضر بروتين فلوري (GFP)، مما يتيح تحديد المستدام من الخلايا العصبية تنشيط وظيفيا. وقد استخدم النهج بنجاح لقياس استجابة من الكبيبات حاسة الشم محددة في الفص antennal بعد التعرض للذباب حية إلى الرائحة 16. مؤخرا، تم قياس الاستجابات الفسيولوجية للIR52c الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية من الذباب الحية باستخدام CaLexA 7. ومع ذلك، من أجل هذه الدراسة، كان من الضروري أن الذباب العمر لمدة تصل إلى 6 أسابيع لتعزيز GFP النسخ. في حين المناعية مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP يمكن استخدامها لتعزيز إشارة CaLexA، فإن هذا الأسلوب يتطلب تثبيت الأنسجة، مما يحول دون إمكانية التصوير الخلية الحية. كما استخدمت الكالسيوم البروتين مؤشر GCaMP المشفرة وراثيا على نطاق واسع لدراسة استجابات الخلايا العصبية في عدد منالأنواع 17. وGCaMP البروتين تتفلور مع كثافة منخفضة قبل لتحفيز الخلايا العصبية. تطبيق التحفيز يؤدي إمكانات العمل في الخلايا العصبية، مما أدى إلى تدفق الكالسيوم 2+. GCaMP، منضما إلى الكالسيوم 2+، يخضع لتغيير متعلق بتكوين، الامر الذي ادى الى يتألق مع كثافة أكثر إشراقا (الشكل 1). تم استخدام نهج التصوير الكالسيوم الخلايا العصبية واحدة وضعت مؤخرا لتحديد الجلوكوز كما يجند لالرجل الاماميه محددة الخلايا العصبية الذوقية Gr61a 18. في هذه الدراسة، تمت تغطية اليدين تشريح من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا معربا عن GCaMP في الخلايا العصبية الذوقية Gr61a مع طبقة من الاغاروز قبل التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام تشريح الأنسجة يمكن أن يسبب المتهدمة في نهاية المطاف التعبير GCaMP، مما يحد من قياس الوقت وحساسية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، الاغاروز يمكن أن تحد من حساسية بسبب مستويات خلفية عالية من مضان وخصائص تشتت الضوء فيها. تس معالجة بعض من هذه العيوب، وصفنا استخدام التصوير الكالسيوم بوساطة GCaMP لتسجيل الاستجابات الفسيولوجية من الرجل الاماميه وخرطوم الخلايا العصبية الذوقية للحيوانات سليمة. نقدم لك مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية للGr68a والخلايا العصبية ppk23 معربا عن المشفرة وراثيا GCaMP5G 19 إلى الدهن فرمون ذبابة الفاكهة، (3 R، 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11،19-octacosadien-1-را (CH503) 20، 21. يتم قياس الاستجابات العصبية عن طريق قياس الزيادة في مضان من إشارة GCaMP5G خلال التحفيز فرمون. في هذا البروتوكول، ويتم تصوير الخلايا العصبية لمدة إجمالية قدرها 120 ثانية، وهو ما يكفي لتمييز أنماط تفعيل الخلايا العصبية في الخلايا الفردية.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

على عكس الثدييات والحشرات مثل ذبابة الفاكهة لديها عدة أجهزة طعم. الخلايا العصبية حسي كيميائي على الساقين، خرطوم، والأجنحة وحامل البيض من ذبابة الفاكهة تعبر عن مستقبلات الذوقية 1،2، القنوات الأيونية 3-6، ومستقبلات ionotropic 7 التي تشارك في الكشف عن العظة الحسية المتطايرة وغير المتطايرة. هذه الخلايا العصبية الاتصال مباشرة tastants مثل المواد الغذائية والمواد الضارة والفيرومونات، وبالتالي تؤثر على العديد من السلوكيات المعقدة مثل التغذية، وضع البيض والتزاوج. التسجيلات الكهربائي والتصوير الكالسيوم وقد استخدمت على نطاق واسع في الحشرات لقياس الاستجابات العصبية التي حركها هذه tastants. ومع ذلك، الكهربية يتطلب معدات متخصصة وقياسات الحصول على من sensillum وطعم واحد يمكن أن يكون تحديا تقنيا تبعا لنوع الخلايا، حجم، وموقف. وبالإضافة إلى ذلك، القرار الخلايا العصبية واحد في ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون من الصعب تحقيقها منذ هوى طعم الشعيراتحد ذاته أكثر من نوع واحد من الخلايا العصبية حسي كيميائي. طريقة التصوير الكالسيوم الحية وصفها هنا يسمح استجابات الخلايا العصبية الذوقية واحدة في الذباب الحية لقياسها. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة لتصوير الاستجابات العصبية للالفيرومونات الدهون وأنواع يجند الأخرى التي لديها القابلية للذوبان في المذيبات انخفاض المياه القائمة.

وأعرب عن مؤشر الكالسيوم GCaMP وراثيا باستخدام Gr68a-GAL4 أو السائقين ppk23-GAL4. وصفت السكان متميزة من الخلايا العصبية والخلايا الرجل الاماميه الدعم غير العصبية من قبل كل سائق (الشكل 3A-C). وقد لوحظت ردود يجند محددة لCH503 فرمون دهون في Gr68a-GAL4 والخلايا ppk23-GAL4<...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K Views.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

Video: Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Developmental Biology

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

مراقبة أحداث الصرع في ذبابة الفاكهة عن طريق تصوير الكالسيوم

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

تسليط الضوء على المؤلف: نظرة ثاقبة على تقنيات ونتائج التطورات الحديثة في أبحاث الصرع 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للاستجابات العصبية الناجمة عن التذوق في ذبابة الفاكهة البالغة

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

التصوير الكالسيوم في

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للاستجابات العصبية الناجمة عن التذوق في ذبابة الفاكهة البالغة