This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

أجريت التعامل مع الحيوانات والتجارب التي وافقت عليها لجنة جامعة غوتنغن لأخلاقيات التجارب على الحيوانات: ملاحظة. 1. إعداد أدوات وماصة تلفيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الإعداد Electroporation لليتكون من stereomicroscope مع المسافة العمل كبيرة ومجهزة الإضاءة الفلورسنت وتصفية مجموعات للصبغة المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل electroporation استخدام إما electroporator خلية واحدة مخصصة أو عام مولد النبض مربع تعلق على الذبذبات. ربط مخرجات electroporator إلى حامل ماصة والقطب حمام. توصيل الطرف الموجب للمولد النبض لصاحب ممص مكروى والسالب إلى القطب حمام. ضمان كلا من حامل ماصة والقطب حمام يحتوي الأسلاك الفضة المطلية بطبقة رقيقة من كلوريد الفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل حامل ماصة على micromanipulator للسماح تحديد المواقع بدقة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال بال micropipettes Electroporation للمن الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط الداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجتذب micropipette الأفقي وتطبيق البروتوكول المعدل لتصنيع الماصات للتجارب المشبك التصحيح كما وصفها Bestman وآخرون 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكيف مع المعلمات لإنتاج ساق طويلة وفتحة طرف أصغر مما أدى إلى مقاومة ماصة ارتفاع حوالي 15-20 MOHM ل electroporation خلية واحدة. يجب أن تكون المقاومة ماصة أقل من ذلك، على سبيل المثال، 3-4 MOHM، لوضع العلامات على مجموعات من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس المقاومة ماصة إما مباشرة مع electroporator وحيدة الخلية مخصص أو حساب مع قانون أوم بعد قياس تدفق التيار مع الذبذبات بعد تطبيق نبضة الجهد المحددة. </li></ol> 2. إعداد Electroporation للحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل ديكستران يقترن fluorophore في المسابقة ضفدع (98 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملم CaCl 2، 2 مم MGCL 2، 5 ملي الجلوكوز، 5 ملي نا البيروفات، 10 ملي HEPES، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.8، وكانت الأسمولية 230 mOsmol / لتر) بتركيز 3 مم. الخلايا قد لا تكون كذلك وصفت الزاهية إذا تم استخدام تركيزات أقل الصبغة. إعداد محلول المخزون الحجم الكبير وتقسيمه إلى مأخوذة الصغيرة. تجميدها للتخزين (مستقر لعدة أشهر). هي Dextrans المتاحة في مختلف الأحجام ومجموعة متنوعة من الانبعاثات / الإثارة أطياف (على سبيل المثال، اليكسا 488 ديكستران 10kD، اليكسا 546-ديكستران 10kD، اليكسا 568 ديكستران 10kD، اليكسا 594-ديكستران 10kD، TMR-ديكستران 3kD.): ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الردم على ممص مكروى مع تلميح ماصة ممدود مع كمية صغيرة من محلول ديكستران (1-5 ميكرولتر). نفض الغبار بعناية ممص مكروى مع إصبع لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب ممص مكروى في حامل ماصة. تأكد من أن أسلاك الفضة داخل ماصة على اتصال مع محلول الصبغة. </li></ol> 3. اختيار اليرقية اكس. المورق &lt;/ EM&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اليرقات البيضاء من X. المورق للتجارب. الحيوانات البرية نوع تمتلك melanophores مليئة الصباغ التي تظهر انبعاث تألق ذاتي خلال متحد البؤر / التصوير multiphoton وبالتالي فهي لا تصلح لوصف التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيم الضفادع الصغيرة premetamorphotic بعد Nieuwkoop وفابر 14. اختيار الضفادع الصغيرة من مراحل 45-53 للتجارب. </li></ol> 4. Electroporation للمن جانب Dextrans Fluorophore- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة صغيرة من الأنسجة في طبق بتري وتغطية ذلك مع كمية صغيرة من المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين (الأثيل methanesulfonate 3-أمينوبنزوات، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الضفادع في المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين. بعد بعض دقائق من الحيوانات تتوقف عن التحرك. تأكيد التخدير المناسبة من خلال لمس الضفادع الصغيرة. ينبغي أن تكون غير مستجيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الشرغوف من مخدر إلى الأنسجة مغطاة طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من إلكترونيات حمامقصيدة إغلاق الدائرة Electroporation لل. تأكد من أن القطب هو في اتصال مع النسيج الرطب. على اتصال مباشر مع الشرغوف ليست ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وثيقة ممص مكروى تلميح إلى الجهاز باستخدام حاسة الشم مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختراق الجلد تغطي الجهاز الشمي مع طرف ماصة والتقدم بحذر طرف في طبقة الخلايا العصبية الحسية في موقع مركزي من الظهارة الشمية الرئيسية أو ظهارة الميكعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يؤدي البقول الإيجابية الجهد مربع لنقل الصبغة في الخلايا العصبية الحسية. تطبيق الجهد نبض واحد (على سبيل المثال، 25 V، طول النبض 25 ميللي ثانية) أو القطارات من البقول متعددة (على سبيل المثال، 50 V، طول النبض μsec 300، 400 ميللي ثانية مدتها القطار بسرعة 200 هرتز). ملاحظة: تحديد المعايير المثلى نبض الجهد المطلوب للتمديد لوضع العلامات. تقليل الجهد نبض السعة والمدة وعدد من حالات التكرار إلى خفض عدد الخلايا المسمى. تطبيق أعلى الجهد نبض السعة والمدة وعدد من صulses لوضع العلامات أكثر انتشارا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور ناجح قذف الصبغة و electroporation بواسطة نبضات أثار استخدام إضاءة الفلورسنت من stereomicroscope. الصبغة ينتشر بسرعة في جسم الخلية والتغصنات بعد Electroporation للنجاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،5-4،9 عن الجهاز الشمي الثاني من الشرغوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرغوف في كوب مملوء بالماء النقي لتحقيق الانتعاش. بعد حوالي 5 دقائق الشراغيف يستيقظ من التخدير وتبدأ حركات السباحة العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ينتشر الصبغة electroporated في الخلايا العصبية الحسية وتصل إلى البصلة الشمية عبر نقل محور عصبي في نهاية المطاف. </li></ol> 5. الحيوانات تركيب لفي فيفو التصور من الخلايا والعمليات محور عصبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الضفادع في المياه التي تحتوي على 0.02٪ تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الضفادع الصغيرة إلى غرفة التصوير، على سبيل المثال، تغطي المطاط السيليكون صغير طبق بتري مع توقف دام الشرغوف الحجم. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع مستطيل صغير في شريط من بارافيلم. تغطية الشرغوف مع بارافيلم، وترك الدماغ الانتهائي الأمامي يتعرض من خلال النافذة خفض التدريجي. إصلاح بارافيلم مع الإبر على طبق دون إصابة الشرغوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من الشرغوف مغمورة في الماء كافية تحتوي على 0.02٪ تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غرفة التصوير على مسرح المجهر multiphoton تستقيم أو متحد البؤر المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على كومة ثلاثي الأبعاد من الصور من البصلة الشمية. ضمان إجراء التصوير هو قصيرة قدر الإمكان و لا تتجاوز 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الشرغوف في الماء العادي في خزان منفصل ومنع التعرض للضوء. بعد 5 دقائق، الشرغوف يستيقظ من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،1-5،7 بعد فترات زمنية محددة، على سبيل المثال، كل يوم. </li></ol> 6. الحيوانات تركيب لفيفو السابقين التصور من الخلايا والعمليات محور عصبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك إلى القسم 5من البروتوكول، استخدم إعداد الدماغ رفعه لتصور الخلايا العصبية الحسية المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير وقتل الشرغوف من قبل transection من الدماغ في الانتقال إلى الحبل الشوكي. استئصال كتلة من الأنسجة التي تحتوي على أجهزة الشم وحاسة الشم الأعصاب والدماغ الانتهائي الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كتلة الأنسجة لضفدع حل المسابقة وإزالة النسيج الضام مع مقص غرامة لفضح الجانب البطني من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كتلة الأنسجة إلى غرفة التصوير واصلاحها مع إطار البلاتين الوترية بخيوط النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غرفة التصوير على مسرح المجهر متحد البؤر / multiphoton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على كومة ثلاثي الأبعاد من الصور من البصلة الشمية. </li></ol> 7. معالجة الصور وتقييم البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 تحسين وتطبيق الوسائل غير الحكومية المحلية من الترشيح لتحسين جودة الصورة والتصور الهياكل العصبية كما وصفها كوبيه، P. وآخرون.. وغالبا ما تكون صاخبة بيانات من تجارب التصوير في طبقات الأنسجة العميقة من العينات الحية: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلق توقعات كثافة القصوى للمداخن صورة لمحة عامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن الوقت الفاصل بين شاشة تجارب التصوير مجموعات البيانات لاحد محاور تحديدها بشكل لا لبس فيه من الخلايا العصبية الحسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة التشكل الخلوي عن طريق تتبع بمساعدة برنامج العمليات العصبية كما وصفها بنغ وآخرون 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+olfactory+neural+stem+cells+to+tissue+maintenance+and+regeneration.">Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration.</a> Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).</li><li>Lodovichi, C., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptors+in+the+formation+of+the+olfactory+bulb+circuitry.">Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry.</a> Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).</li><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain).">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain).</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+in+vitro+electroporation+allows+visualization,+recording,+and+calcium+imaging+of+local+neuronal+circuits.">A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits.</a> J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), (2008).</li><li>Gliem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+processing+of+olfactory+information+in+an+amphibian+nose:+odor+responses+segregate+into+a+medial+and+a+lateral+stream.">Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream.</a> Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).</li><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules.">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Coup&#233;, P., Munz, M., Manj&#243;n, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CANDLE+for+a+deeper+in+vivo+insight.">A CANDLE for a deeper in vivo insight.</a> Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Nezlin, L. P., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+olfactory+sensory+neurons+project+into+more+than+one+glomerulus+in+Xenopus+laevis+tadpole+olfactory+bulb.">Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li><li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2++imaging+of+local+neuronal+circuits.">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الإجراء التجريبي وصفها هنا يسمح وضع العلامات الخلايا العصبية الحسية من الجهاز الشمي من اليرقات X. المورق بواسطة الصعق الكهربائي من dextrans يقترن fluorophore والتصور اللاحق للنمو محور عصبي حسي في الحيوانات الحية. من خلال تغيير معالم Electroporation للفي الجسم الحي من الممكن السيطرة على عدد الخلايا العصبية الحسية المسمى. وبالتالي فمن الممكن لتسمية مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الحسية من الظهارة، وعدد قليل جدا أو حتى خلايا مفردة. لضمان تمديد المطلوب لوضع العلامات العصبية من المهم توخي الحذر بشكل خاص حول خصائص ممص مكروى والبقول Electroporation لل. يمكن المقاومات ماصة أعلى والحد من الجهد نبض السعة والمدة وعدد من حالات التكرار تقلل من كمية الخلايا المسمى، في حين خفض المقاومة ماصة وارتفاع الجهد نبض السعة والمدة وعدد النبضات يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات أكثر انتشارا. عشراستخدام البريد من dextrans الفلورسنت ل electroporation يوفر ملاحظات مرئية فورية إذا كان تطبيق الإعدادات المناسبة. يجب الحرص على أن استخدام المعلمات لاتساع ومدة وعدد النبضات التي تتجاوز القيم المنصوص عليها في بروتوكول يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا أو حتى موت الخلايا 17. انسداد أو مكسورة نصائح من بال micropipettes يمكن أيضا أن تعيق Electroporation للنجاح. في الجسم الحي Electroporation للفي الجهاز الشمي من X. المورق يقتصر على مراحل اليرقات منذ جلد الضفادع postmetamorphotic هو أكثر صرامة والتي لا يمكن اختراقها بسهولة مع ممص مكروى. التصور في الجسم الحي من العمليات العصبية يمكن أن يعوق تناثر الضوء الإثارة / الانبعاثات في المناطق الأكثر عمقا في الدماغ أو عن طريق الأوعية الدموية. تصبح هذه مشكلة واضحة خاصة في مراحل اليرقات أعلى بسبب الدماغ أكبر ويمكن أن يؤدي إلى إشارات صاخبة جعل تحديد واضح لعمليات محور عصبي غرامة أكثر صعوبة. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; تصاريح بروتوكول المعروضة لتصور الخلايا العصبية الحسية في نظام حاسة الشم سليمة دون تشريح الحيوان، وإتلاف الخلايا خلال وضع العلامات، وإعداد شرائح الأنسجة أو إصلاح الأنسجة عند الضرورة لطرق بديلة، مثل وضع العلامات في التصحيح خلية كاملة تجارب -clamp 18. عند الجمع بين العلامات القليلة احدة أو الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي مع مرور وقت التصوير، فمن الممكن تصور الاتصالات الكبيبي واحدة من الخلايا العصبية الحسية الناضجة على مدى فترات زمنية طويلة. بهذه الطريقة فإنه من الممكن أيضا لمراقبة تطور أنماط إسقاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية غير الناضجة على مدى عدة أسابيع. هذا الخيار الأخير هو اهتمام بوجه خاص لأنه يتيح مراقبة أنماط نمو محاور عصبية واحدة في الحيوانات الحية. هذا يفتح إمكانية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في توجيه محور عصبي والاستطلاعية. عدة عوامل، بما في ذلك مستقبلات الرائحة التعبير، ومختلف الذخائر المتروكةوقد تبين أن الجزيئات التوجيه ن والتي يسببها الرائحة / النشاط العفوي من الخلايا العصبية الحسية لتنظيم النتيجة المستهدفة من محاور الخلايا العصبية الحسية 4،5. ولا يقتصر تطبيق البروتوكول إلى الخلايا العصبية الحسية الشمية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا الجذعية / السلف من المناطق العصبية من الدماغ النامي أو الخلايا التاجية من البصلة الشمية. بالإضافة إلى تقنية أثبتت ويمكن أيضا أن تستخدم في تركيبة مع dextrans الحساسة الكالسيوم أو حقن الأصباغ الكالسيوم غشاء منفذ للحصول على المعلومات الوظيفية حول الخلايا العصبية المسماة و / أو الدوائر المتصلة 7،19. توفر مجموعة واسعة من fluorophores إلى جانب dextrans يسمح وضع العلامات من الخلايا الفردية متعددة أو السكان مع ألوان مختلفة. البلازميد أيضا حل الحمض النووي، على سبيل المثال لترميز البروتينات الفلورية، هو مناسبة ل electroporation ويمكن زيادة تعزيز versatiliتاي وفائدة هذه التقنية 6. يمكن زيادة تعزيز بروتوكول للسماح للElectroporation للمجتمعة dextrans وDNA أو morpholinos تهمة التلاعب التعبير الجيني 13،17. الطريقة الموصوفة يمثل بالتأكيد أداة جديدة للتحقيق في مجمع والعمليات لا تزال غير مفهومة تماما أن تنظيم التوجيه محور عصبي في النظام الشمي الفقاريات.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

ويمكن تطبيق بروتوكول صفها بنجاح ول electroporation في الجسم الحي التصور العمليات محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية للنظام حاسة الشم من اكس تخدير المورق، وذلك باستخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهري أو multiphoton (الشكل 1). Electroporation للتسمح dextrans يقترن fluorophore للدخول وانتشرت بسرعة داخل خلايا الجهاز الشمي. فإنه من المفيد أن تطبيق إضاءة الفلورسنت للتحقق من وضع العلامات ناجحة بعد مما اثار نبضات الجهد. اعتمادا على المعلمات Electroporation لل، على سبيل المثال، المقاومة ماصة، وصفت مجموعات من الخلايا (الشكل 2A، B) أو الخلايا واحد (الشكل 2C) من جهاز حاسة الشم. محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية وصفت يمكن تصور في العصب الشمي (الشكل 2D) وعمليات محور عصبي يمكن ملاحظتها أيضا في البصلة الشمية، عادة 24 ساعة بعد Electroporation للنجاح(الشكل 3). Electroporation للمن مجموعات من الخلايا العصبية الحسية يسمح تصور أنماط الأسلاك الخشنة في البصلة الشمية (الشكل 3A). يمكن تطبيقها Electroporation للخلية واحدة للتحقيق في أنماط الفردية محور عصبي إسقاط، التشعبات محور عصبي والربط مع الهياكل الكبيبي في البصلة الشمية (الشكل 3C-E). الضفادع الصغيرة البيضاء الشفافة من X. تصريح المورق في الجسم الحي أو متحد البؤر التصوير multiphoton من الخلايا العصبية الحسية وصفت في الدماغ سليمة من الشرغوف تخدير. يمكن تتبع تطور أنماط النمو محور عصبي على مدى عدة أيام / أسابيع بواسطة المتكررة في التصور المجراة من نفس المسمى الخلايا العصبية الحسية (الشكل 4). اعتمادا على نضج الخلايا العصبية الحسية في نقطة زمنية من Electroporation للنمط محور عصبي في البصلة الشمية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. الخلايا العصبية الناضجة تمتلك بالفعل محور عصبي الفروع تفصيلا التي تتميز خصلالمناطق إد متصل الكبيبات. نمط النمو محور عصبي من الخلايا العصبية الناضجة مستقرة نوعا ما، ولكن استطالة فروع محور عصبي والتحسينات من خصلات الكبيبي ملحوظة (الشكل 4A-E). ويمكن ملاحظة الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي لفترات زمنية طويلة، على سبيل المثال، أكثر من ثلاثة أسابيع (الشكل 4F-I). من ناحية أخرى، محاور عصبية من الخلايا العصبية غير الناضجة لا تزال في طور النمو الأولي، لا يملكون arborizations معنقدة ولم إتصال بعد إلى أهدافهم النهائية الكبيبي. بروتوكول تجريبي يسمح تتبع تطور هذه العصبونات أثناء النضج، على سبيل المثال، استطالة المحور، التشعبات وإنشاء arborizations معنقدة (الشكل 4J-L). لمزيد من الأمثلة انظر أيضا Hassenklöver ومانزيني 12. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; الشكل 1. نظرة تخطيطية للبروتوكول تجريبي. (A) الخلايا العصبية الحسية في الظهارة الشمية الرئيسية (وزارة التربية) أو الجهاز الميكعي الأنفي (VNO) من جهاز حاسة الشم من اكس تخدير وصفت المورق اليرقات عبر Electroporation للباستخدام ماصة زجاجية مملوءة بمحلول ديكستران الفلورسنت. يمكن أن يتبع من محاور الخلايا العصبية المسماة عبر العصب الشمي (ON) وتصل في نهاية المطاف إلى البصلة الشمية (OB). وتخدير (ب) الشرغوف ويتم التحقيق في الخلايا العصبية وصفت مرارا باستخدام مجهر متحد البؤر أو multiphoton في فترات زمنية محددة. (ج) زيادة تطوير أنماط النمو محور عصبي من الخلايا المسمى يمكن اتباعها على مدى فترات زمنية من أيام إلى أسابيع. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. كهربائيtroporation من الخلايا العصبية الحسية في الجهاز الشمي. (A) Electroporation للمع الماصات مقاومة منخفضة يؤدي إلى وضع العلامات من عدة خلايا في الجهاز الشمي. في هذا المثال التمثيلي كانت ملطخة متعددة الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs، النصال شغل) واثنين من خلايا عمودية على شكل دعم (SCS، العلامات النجمية). الخطوط المتقطعة ترسيم حدود ظهارة الشم (عمر الفاروق). (ب) صقل المعلمات Electroporation لل، على سبيل المثال، زيادة مقاومة ماصة، يحد من عدد من الخلايا المسمى. في هذا المثال، تم صبغ الخلايا العصبية الحسية واحدة (النصال شغل) واحد المجاورة دعم الخلية (النجمة) بعد Electroporation لل. ملاحظة محور عصبي واحد ترك الظهارة الشمية (النصال مفتوحة). (C) الناجح Electroporation للخلية واحدة يؤدي إلى وسم خاص من الخلايا العصبية الحسية الفردية (شغل رأس السهم) ومحور عصبي متصل بها (النصال مفتوحة) في الظهارة الشمية. <sترونج&gt; (D) محور عصبي واحد المسمى (النصال مفتوحة) يمكن اتباعها من خلال العصب الشمي (ON) في البصلة الشمية. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> الشكل 3. تصور التوقعات محور عصبي حاسة الشم في البصلة الشمية رفعه. (A) وطوبولوجيا الخشنة من التوقعات محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية في البصلة الشمية يمكن تصور استخدام أقل الماصات Electroporation للمقاومة. وصفت واحدة الشم نصف الكرة مبة وما يرتبط بها من العصب الشمي لها (ON). تم electroporated أربعة dextrans إلى جانب fluorophores مختلفة في أربعة أماكن بعيدة من الجهاز الشمي: الجانبي (الأخضر)، متوسطة (الصفراء)، وسطي زارة التربية والتعليم (أحمر) وVNO (البرتقالي). وهذا يسمح تصور لمبة حاسة الشم التبعي (AOB) وحقول الإسقاط الثلاثة الرئيسية من البصلة الشمية الرئيسية (MOB). <strأونج&gt; (ب) أنماط مختلفة من نمو محور عصبي واحد الخلايا العصبية الحسية الشمية فرضه على بنية البصلة الشمية. صورت يتم الجمع بين ثلاث عمليات إعادة البناء الأبعاد المتعددة stainings وحيدة الخلية المستمدة من عينات اليرقات المختلفة. (CE) أمثلة على محاور عصبية شمية واحدة توقع في البصلة الشمية وتشكيل arborizations معنقدة / نقاط الاشتباك العصبي في الكبيبات كروية (النصال شغل). لاحظ أنه في اكس المورق محاور عصبية شمية المشعب بانتظام (النصال مفتوحة) قبل الاتصال احدا أو اثنين أو متعددة الكبيبات (النصال شغلها، كما يرى Hassenklöver ومانزيني 12). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> الرقم 4. في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير احدة من محاور الخلايا العصبية الشمية. (AE)بعد نجاح Electroporation للخلية واحدة محور عصبي وصفت يمكن تصور مرارا في البصلة الشمية (OB). يوضح هذا المثال محور عصبي الفردية التي تم التحقيق لمدة أسبوع واحد. لا يغير مورفولوجيا العام إلى حد كبير ويمكن تحديد نقطتين المتفرعة الكبرى (النصال مفتوحة). لاحظ أنه على مدار الوقت، خصل الكبيبي واحد يخضع تخفيض مستمر (شغل رأس السهم)، في حين لا تزال الأخريين خصلات الكبيبي مستقرة (النجمة). (FI) يوضح هذا المثال التمثيلي جدوى من الملاحظات على المدى الطويل كما تم التحقيق هذا محور عصبي معين لأكثر من ثلاثة أسابيع. ويمكن الكشف عن أي تغيير واضح من نمط نموها. (JL) ويصور مثال على محور عصبي حسي غير ناضجة في عملية النمو. لم ترتبط بعد ذلك إلى الكبيبات وخصلات الكبيبي مميزة مفقودة. بعد 5 أيام وممدود الفروع محور عصبي، منقسمة محور عصبي عدة مرات وarborizations الجميلة هيأنشئت.

Watch this Scientific Journal Video about The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo at JoVE.com

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

the-olfactory-system-as-model-to-study-axonal-growth-patterns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.8K Views.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Video: The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

A Free-breathing fMRI Method to Study Human Olfactory Function

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, evaluation of the functions of the human central olfactory system with functional magnetic resonance imaging (fMRI) is still a challenge because of several technical difficulties. There are some significant variables to take into account when considering an effective method for mapping the function of the central olfactory system using fMRI, including proper odorant selection, the interaction between odor presentation and respiration, and potential anticipation of or habituation to odorants. An event-related, respiration-triggered olfactory fMRI technique can accurately administer odorants to stimulate the olfactory system while minimizing potential interference. It can effectively capture the precise onsets of fMRI signals in the primary olfactory cortex using our data post-processing method. The technique presented here provides an efficient and practical means for generating reliable olfactory fMRI results. Such a technique can ultimately be applied in the clinical realm as a diagnostic tool for diseases associated with olfactory degeneration, including Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease, as we begin to further understand the complexities of the human olfactory system.

We present the technical challenges and solutions for obtaining reliable functional magnetic resonance imaging (fMRI) data from the human central olfactory system. This includes special considerations in olfactory fMRI paradigm design, descriptions of fMRI data acquisition with an MRI-compatible olfactometer, odorant selection, and a special software tool for data post-processing.

A التنفس-- التنفس طريقة الرنين المغناطيسي الوظيفي لدراسة وظيفة الإنسان الشمية

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

جراحة الأعصاب الوجه في نموذج الفئران لدراسة تثبيط أكسونال وتجديد

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

توليد الجيل من 3D الكولاجين القائم على Hydrogels لتحليل النمو المحوري والسلوك أثناء تطوير الجهاز العصبي

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

الاستفادة من التثقيب الكهربائي بعد الولادة في الجسم الحي لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وتطوير المشبك

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

تحسين الإعداد والظروف لمخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي لدراسة وظيفة شبكية العين في العيون الصغيرة والكبيرة

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

في الموقع تصور نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مزارع شرائح الدماغ الجنينية الحادة خارج الجسم الحي

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...