This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.

1. بصري المعايرة: قياس الضوء الناتج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد جهاز تسليم خفيفة، توصيل مصدر الضوء النطاق العريض (على سبيل المثال، زينون أو مصباح التنجستن) لامدادات الطاقة المناسب. ضع العدسة الموازاة أمام مصدر الضوء لإنتاج شعاع موازى للضوء. تمرير الضوء من خلال مرشح الحرارة السائل لإزالة معظم الحرارة من شعاع ضوء. اعتمادا على التطبيق، والتركيز شعاع موازى إلى فتحة مدخل دليل ضوء السائل، والذي ينص على تسليم أكثر مرونة من الضوء (على سبيل المثال، إلى حاضنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الطرف الآخر من دليل ضوء السائل، ضع العدسة الموازاة الثانية ثم حامل للتدخل ومرشحات الكثافة محايدة. تحقق من أن هذا الترتيب ينتج بقعة مضيئة بالتساوي من ضوء و waveband المطلوب وشدة. ملاحظة: المسافة بين نهاية نور الهداية والطائرة العينة قد تحتاج إلى تختلف تبعا لالمنطقة التي يجب أن تكون مضيئة، ولكن تذكر أن والمسافة من نهاية الزيادات دليل الخفيفة، وشدة الضوء ستنخفض. في هذه الدراسة، هذه المسافة هي ل 14cm وتنتج المقطع العرضي شعاع الذي ينير بالتساوي على المنطقة جيدا 3X3 على طبق من ذهب 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الضوء الشارد من مصباح والمكونات البصرية المرتبطة بها غير قادر على الوصول إلى العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على برودة الماء لتصفية حرارة السائل وضمان عدم وتبادل المياه من خلال سترة التصفية. بدوره على مصدر الطاقة مصباح والانتظار لمدة 5 دقائق على الأقل لمصدر ضوء النطاق العريض لتحقيق الاستقرار. ملاحظة: مطلوب استخدام برودة الماء لمنع الإفراط في التدفئة للجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر مرشح تدخل الضيق (التي توصف عادة من قبل الطول الموجي لها مركز، النفاذية الذروة والعرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) عرض النطاق الترددي) لتوليد و waveband المطلوب من الإضاءة. ملاحظة: وكانت المرشحات تدخل الضيق المستخدمة في الدراسة الحالية 442 نانومتر و 550 نانومتر، 671 نانومتر و 810 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الضوء التي تنتجها مصباح في الطائرة حيث العينة هو وضعه خلال فترة العلاج. قياس الضوء باستخدام مسبار الإشعاع معايرة (جيب التمام جامع) متصلة مقياس الطيف مناسبة، وذلك باستخدام برنامج اللياقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرشحات الكثافة محايدة لضبط شدة الضوء حتى يتم الحصول على النتيجة المرجوة. ملاحظة: في هذه الدراسة، ويتم ضبط شدة مرت من قبل كل مرشح تدخل ضوء لإعطاء ناتج كمي على قدم المساواة في كل من wavebands العلاج الأربعة. فمن المهم للتحقق من معايرة بانتظام، والإخراج المصباح هو عرضة للتغيير. ملاحظة: بعد مجموعة تتكون من جهاز، والخلايا جاهزة للمضيئة الشكل 1 هو تمثيل لجهاز تسليم ضوء المستخدمة في الدراسة الحالية. </li></ol><img alt="الشكل (1)"SRC = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 52221 / 52221fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. صورة الجهاز تسليم خفيفة. المصور هي مصدر الطاقة الخفيفة، مصباح زينون مع السكن، عدسة الموازاة، تصفية المياه، ومدخل الفتحة، دليل ضوء السائل، عدسة الموازاة الثانية، حامل مرشح، والإطار العلاج وغير لامع بطاقة سوداء. لاحظ أن الضيق الطول الموجي وشدة المرشحات لا تظهر. 2. خلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وR / NIR-LT طريقة التسليم وصفها يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا أو في نظام نموذجي المختبر. على هذا النحو الأوصاف التالية من زراعة الخلايا هي عامة، وذلك باستخدام تقنيات راسخة لورم القواتم الثقافة (PC12)، مولر (rMC1) وخلايا الشبكية المختلطة الابتدائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البذر خلية للعلاج الخفيفة والأكسدة الإجهاد الفحص، تخليد ثقافة الخلايا في وسائل الإعلام الخاصة النمو منها تحتوي على المكملات المناسبة (على سبيل المثال، FBS والمضادات الحيوية) في إف إل أي إس T75كانساس حتى 70-80٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل خلايا خلدت من قوارير T75، وذلك باستخدام الطريقة المناسبة لنوع من الخلايا لفحصها على سبيل المثال.، التربسين. إذا لزم الأمر، قبل الشروع في البذر من الخلايا في 96-جيدا لوحات الفحص والآبار لوحة معطف مقايسة مع 10μg / مل بولي-L-ليسين ل1H (على سبيل المثال، للخلايا PC12) أو 10μg / مل بولي-L-ليسين ل 1H يعقبه O / N الحضانة مع 10μg / مل laminin (على سبيل المثال، للخلايا الشبكية مختلطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي لجمع حسب الاقتضاء (على سبيل المثال، 3 دقائق في 405 x ج لخلايا PC12 أو 10 دقيقة في 218 x ج لخلايا rMC1)، وإزالة وطاف resuspend في 8 مل من المناسب سائل الإعلام ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا خلايا الشبكية مختلطة هي لاستخدامها، وإعداد من P0-5 الفئران الوليدة حديثي الولادة عن طريق الهضم الأنزيمي (غراء) وفقا للإجراءات المقررة 19 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد خلايا قابلة للحياة باستثناء 0.4٪ (ث / ت) صبغة زرقاء التريبان، وذلك باستخدام haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كثافة الخلية يرغب، يمثح أن الخلايا ستكون حوالي 70-80٪ متموجة بعد 24 أو 48H في الثقافة. (للخلايا PC12 كثافة البذر هي 4.0 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل، للخلايا rMC1، فمن 2.5 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل وللخلايا الشبكية المختلطة هو 8 × 10 5 خلايا قابلة للحياة / مل). بعد إضافة خلايا إما لوحات 96-جيدا واضحة أو السوداء (التي تستخدم لH 2 O 2 أو DCFH-DA فحص على التوالي)، في 100 ميكرولتر من وسائط النمو المناسب، والسماح لوحة للجلوس على سطح مستو عند 37 درجة مئوية، 5 ٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المناسبة لنوع خلية معينة) لا يقل عن 24 ساعة للسماح الالتزام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في وسائل الاعلام النمو في مناسبة 96 صواني جيدا حتى تكون 70-80٪ متموجة (24H لPC12 والخلايا rMC1، 48H لخلايا الشبكية مختلطة). </li></ol> 3. إضافة الغلوتامات الضغوطات إلى خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أحادية الصوديوم حمض تركيزات هيدرات الملح الضغوطات-L الجلوتاميك من 0-10mM في تنمو الكامل المناسبعشر وسائل الإعلام الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وغسل بلطف الخلايا 3 مرات مع PBS (PC12) أو HBSS (rMC1 وخلايا الشبكية مختلطة). يغسل بعد، إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد. </li></ol> 4. الأولى جرعات من العلاج الخفيفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فور إضافة الغلوتامات أو الإجهاد في الاختيار، وفضح الخلايا لعلاج الضوء على موجات المطلوب وشدة عن طريق وضع تحت جهاز استعداد تسليم النور. تأكد من تغيير المخرجات كمي من شعاع ضوء باستخدام تركيبات الثابتة للمرشحات الكثافة محايدة اعتمادا على الطول الموجي تدار. ملاحظة: في التجارب الحالية، وتعريض الخلايا لعلاج الخفيفة لمدة 3 دقائق حفاظ على درجة الحرارة التي يستريح لوحات جيدا 96 على 37 درجة سادة C الحرارة. يجوز تغيير وقت العلاج على النحو المطلوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بطاقة سوداء ماتي تحت الخلايا لمنع الضوء المنعكس في الآبار المجاورة في-96 أهلا وسهلال علبة المخصصة لمعلمات العلاج الأخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب العلاج لفترات أطول من الوقت، إضافة عازلة 25MM HEPES للحفاظ على درجة الحموضة وسائل الإعلام ثقافة الخلية أو من الناحية المثالية، ووضع لوحات الأجهزة والعلاج داخل حاضنة مع CO 2 تركيز ينظم إلى 5٪ CO 2، أو الظروف التي هي الأمثل لنوع خلية معينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد الانتهاء من العلاج الخفيفة، ووضع الخلايا على سطح مستو واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (أو أيا كان الظروف المثالية للنوع من الخلايا) ل24H. ملاحظة: يمكن أن تدار جرعات إضافية من R / NIR-LT كما هو موضح أعلاه، كما تريد. </li></ol> 5. النهائي جرعة من العلاج الضوء والكشف عن ROS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تنفيذ الجولة الاخيرة من العلاج الخفيفة، وإعداد الكواشف لاستخدامها للكشف عن ROS. إعداد 50MM عازلة سيترات (pH6.0)، تريتون X100، وH 2 O 2 كشف كاشف العمل(نسبة 97 من 10MM H 2 O 2 الكشف عن حل الأسهم كاشف، و 10 U / مل البيروكسيديز الفجل، 50MM سترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0) 1: 2) حل. إعداد DCFH-DA بتركيز نهائي من 100μM في وسائل الإعلام المناسبة. ملاحظة: DCFH-DA كاشف للخلايا PC12 في وسائل الإعلام RPMI، DCFH-DA كاشف للخلايا rMC1 هو في وسائل الاعلام DMEM. لاحظ أن الكواشف كشف المتاحة تجاريا لها الحساسيات التفاضلية لROS محددة ويجب اختيارها بعناية الكواشف لتوفير المعلومات المطلوبة لتطبيق الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة العلاج الخفيفة إلى الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 4.1-4.1.2. يعالجون ضمان الخلايا مع المطلوب fluences / الأطوال الموجية للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورا بعد العلاج الخفيفة، وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الغلوتامات ويغسل مرتين مع حل العازلة المناسب (للخلايا PC12، ويستخدم برنامج تلفزيوني وللخلايا rMC1، ويستخدم HBSS). إجراء فحوصات ROS على الخلايا على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H 2 O 2 </suب&gt; الفحص: إضافة 45 ميكرولتر من 50MM عازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6.0) و 5 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار. بلطف يهز الخلايا على شاكر المداري لمدة 30 ثانية واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة. إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O 2 حل العاملة الكشف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 530nm الطول الموجي وانبعاث 480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DCF الفحص: إضافة 100 ميكرولتر من حل 100 ميكرومتر من DCFH-DA إلى كل من الآبار واحتضان لمدة 30min في في 37 ° C وCO 2 5٪. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 100 ميكرومتر DCFH-DA، ويغسل مع حل العازلة المناسب (كما هو موضح أعلاه) مرتين. إضافة 90 ميكرولتر من حل العازلة و 10 ميكرولتر تريتون X100 إلى كل من الآبار ويهز بلطف على شاكر المداري لمدة 30 ثانية قبل 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية. قياس DCF مضان المستمدة باستخدام قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 480nm ويفل الانبعاثاتength من 530nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صريحة ROS تقدر نسبة إلى تركيز البروتين من الخلايا المتبقية في الآبار، وذلك باستخدام مجموعة اللونية لقياس تركيز البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع الإشارة إلى منحنى القياسية لحساب ملغم بروتين. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species+an+evolution+in+function.">Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function.</a> Circulation research. 97, 302-304 (2005).</li><li>Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+Ca2++signaling.">Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).</li><li>Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondria and reactive oxygen species.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).</li><li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+glutamate,+and+neurodegenerative+disorders.">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262, 689-695 (1993).</li><li>Doble, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+excitotoxicity+in+neurodegenerative+disease:+implications+for+therapy.">The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 81, 163-221 (1999).</li><li>Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+therapies+for+acute+spinal+cord+injury.">Antioxidant therapies for acute spinal cord injury.</a> Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).</li><li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+spinal+cord+injury+and+antioxidant-based+intervention.">Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention.</a> Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red/near-infrared+irradiation+therapy+for+treatment+of+central+nervous+system+injuries+and+disorders.">Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders.</a> Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).</li><li>Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=670-nm+light+treatment+reduces+complement+propagation+following+retinal+degeneration.">670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration.</a> J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).</li><li>Eells, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+photobiomodulation+for+methanol-induced+retinal+toxicity.">Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).</li><li>Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+670+nm+light+up+regulates+cytochrome+C+oxidase+expression+and+reduces+inflammation+in+an+age-related+macular+degeneration+model.">Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model.</a> PloS one. 8, e57828 (2013).</li><li>Byrnes, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+promotes+regeneration+and+functional+recovery+and+alters+the+immune+response+after+spinal+cord+injury.">Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury.</a> Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).</li><li>Liang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiomodulation+partially+rescues+visual+cortical+neurons+from+cyanide-induced+apoptosis.">Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis.</a> Neuroscience. 139, 639-649 (2006).</li><li>Zivin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+and+safety+of+transcranial+laser+therapy+for+acute+ischemic+stroke.">Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke.</a> Stroke. 40, 1359-1364 (2009).</li><li>Lapchak, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+near-infrared+laser+therapy+applied+to+promote+clinical+recovery+in+acute+and+chronic+neurodegenerative+diseases.">Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases.</a> Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuts+and+bolts+of+low-level+laser+(light)+therapy.">The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy.</a> Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Level+Laser+Therapy+for+Closed-Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Mice:+Effect+of+Different+Wavelengths.">Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths.</a> Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).</li><li>Hashmi, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+low-level+laser+therapy+in+neurorehabilitation.">Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation.</a> PM&amp;R. 2, S292-S305 (2010).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein-IIA+promotes+neurite+growth+via+the+megalin+receptor.">Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor.</a> Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).</li><li>Fitzgerald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+infrared+light+reduces+oxidative+stress+and+preserves+function+in+CNS+tissue+vulnerable+to+secondary+degeneration+following+partial+transection+of+the+optic+nerve.">Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve.</a> Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).</li><li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+spinal+cord+injury+in+rats:+effects+of+polarization.">Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization.</a> Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).</li><li>Lanzafame, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocity+of+exposure+time+and+irradiance+on+energy+density+during+photoradiation+on+wound+healing+in+a+murine+pressure+ulcer+model.">Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).</li><li>Castano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+zymosan+induced+arthritis+in+rats:+Importance+of+illumination+time.">Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

لقد تكيفت بنجاح نظام تسليم ضوء دقيقة ومحسوبة لتوفير آلية لدراسة تعظيم الاستفادة من R / NIR-LT في المختبر. الطول الموجي وشدة معالم R / NIR-LT قادرين على معالجته بدقة وفاعلية استخدام هذا النظام. أنشأنا أن العلاج الخفيفة من الخلايا لم تؤدي إلى موت الخلايا، على الرغم من ROS لم...

يرجى ملء أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لطائفة من إشارة مسارات نقل وردود الفعل الطبيعية من الأيض الخلوي، بما في ذلك الحماية العصبية 1. ومع ذلك، عندما آلية مضادة للأكسدة الذاتية غير قادرة على السيطرة على إنتاج ROS، الخلايا قد فريسة لالاكسدة 2،3. وبعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي، ويعتقد أن الزيادات المرتبطة بحضور ROS والاكسدة للعب دور كبير في تطور الضرر 4،5. على الرغم من العدد واسعة من استراتيجيات لتخفيف الاجهاد التأكسدي التي تم تقييمها، وهناك حاليا أي والاستراتيجيات المضادة للأكسدة فعالة تماما ذات الصلة سريريا لتخفيف إنتاج ROS والاكسدة المرتبطة بها في الاستخدام السريري التالية رضح عصبي 6. وبالتالي تخفيف الإجهاد التأكسدي يبقى هدفا مهما للتدخل العلاجي 7. تحسينات تتبعتم الإبلاغ جي R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الإصابات والأمراض بما في ذلك تخفيض في فؤادي حجم احتشاء، والمضاعفات الكلوية والكبدية أثناء مرض السكري، وتنكس الشبكية أو الإصابة CNS والسكتة الدماغية 8، ربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. مع إيلاء اهتمام خاص إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي، وقد أظهرت الدراسات قبل السريرية من فعالية ضوء 670nm آثار جيدة في نماذج من تنكس الشبكية 9-11، واصابات الحبل الشوكي 12، موت الخلايا العصبية (13). وقد أجريت التجارب السريرية لسن الجافة بتحلل البقعة الصفراء والتي تجرى حاليا للسكتة الدماغية 14، إلا أن نتائج هذه التجارب لا تظهر واعدة، وربما يرجع ذلك إلى عدم توظيف علاج فعال المعلمات 15. على هذا النحو، لم يعتمد R / NIR-LT على نطاق واسع كجزء من الممارسة السريرية العادية في رضح عصبي، على الرغم من كونه وسيلة سهلة لإدارة، غير الغازية والعلاج غير مكلفة نسبيا. وتشمل الحواجز على الترجمة السريرية عدم وجود CLأدركت منذ البداية آلية العمل وعدم وجود موحد فعال 16،17 بروتوكول العلاج. الأدب الحالي بشأن العلاج بالضوء يكشف عن عدد كبير من التباين في المعايير في المعاملة بين مصادر الإشعاع (LED أو ليزر)، والطول الموجي (على سبيل المثال، 630، 670، 780، 810، 830، 880، 904nm)، الجرعة الإجمالية (جول من الإشعاع / وحدة المساحة)، ومدة (زمن التعرض) والتوقيت (إهانة ما قبل أو ما بعد)، وتواتر العلاج وطريقة التسليم (نبض أو مستمر) 8. التباين في المعاملة بين المعلمات دراسات يجعل المقارنة صعبة وساهم في الشكوك بشأن فعالية 16. لذلك، والتحسين من R / NIR-LT مطلوب بشكل واضح، مع أنظمة قادرة على توفير آلية فحص عالية الإنتاجية اللازمة لمقارنة متغيرات متعددة ثقافة الخلية. ولكن هناك عدد قليل من النظم الإضاءة المتاحة تجاريا التي يمكن أن توفر ما يكفي من المرونة والسيطرة على واvelength وشدة لأداء مثل هذه التجارب الأمثل. تجاريا المتاحة أجهزة LED هي عموما ليست قادرة على تقديم الأطوال الموجية أو شدة متعددة، مما أدى إلى المحققين توظيف عدة أجهزة LED من مختلف الصانعين، والتي قد تختلف ليس فقط في شدة، ولكن أيضا الطيف من الطول الموجي للضوء المنبعث. لقد تناولت هذه القضية من خلال توظيف مصدر ضوء زينون النطاق العريض التي تمت تصفيتها من خلال مرشحات تدخل الضيق، وبالتالي توليد مجموعة من الأطوال الموجية للضوء وfluences، مما يسمح ثيقة، مراقبة دقيقة من المعلمات من R / NIR-LT. من المهم أن نلاحظ أن الجرعة العلاجية من العلاج تم تعريفه من قبل عدد من الفوتونات التفاعل مع photoacceptor (حامل اللون)، والتي، وافترض في حالة R / NIR-LT أن تكون السيتوكروم ج أوكسيديز (COX) 18. طاقة الفوتون تسليمها يختلف مع الطول الموجي. وهذا يعني جرعات متساوية للطاقة في أطوال موجية مختلفة يكون كومنفيسة من أرقام مختلفة من الفوتونات. ولذلك، فإن الضوء المنبعث من الجهاز تم معايرة لتنبعث منها عدد متساو من الفوتونات لكل من الأطوال الموجية المختار لفحصها. قمنا بتطوير نظام التي يمكن استخدامها لتقديم R / NIR-LT في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة إلى خلايا في المختبر، وأثبت القدرة على قياس الآثار المترتبة على تسليمها R / NIR-LT على الإنتاج ROS في الخلايا تعرض ل الإجهاد الغلوتامات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>STA-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed Reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Watt Xenon Arc Lamp</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>6258</td>
			<td>Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB4000-FL Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#956;m diameter quartz fibre optic</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraSuite Spectroscopy Platform</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire Multimode Plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Acute toxicity, wear gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142-47-2 (anhydrous)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinal Muller (rMC1) cells</td>
			<td>University of California, San Diego</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>B4-BE-353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-134</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>165U Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well plates, clear bottom, black</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filter Paper (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>442nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FL441.6-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>550nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB550-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>670nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB670-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>810nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB810-10e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE02B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE03B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE05B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE06B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE10B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for the assessment of effects of a range of wavelengths and intensities of red/near-infrared light therapy on oxidative stress in vitro

أحمر / العلاج شبه ضوء الأشعة تحت الحمراء (R / NIR-LT)، وسلمت عن طريق الليزر أو ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED)، ويحسن النتائج الفنية والصرفية في مجموعة من إصابات الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي، وربما عن طريق الحد من الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، فقد ثبت آثار R / NIR-LT على الاكسدة تختلف اعتمادا على الطول الموجي أو شدة الإشعاع. الدراسات التي تقارن المعلمات العلاج غير موجودة، نظرا لعدم وجود الأجهزة المتوفرة تجاريا التي تقدم موجات متعددة أو شدة، ومناسبة لأعلى مستوى من خلال وضع في الدراسات الأمثل المختبر. يصف هذا البروتوكول تقنية للتسليم من الضوء على مجموعة واسعة من الأطوال الموجية وشدة لتحسين الجرعات العلاجية المطلوبة للنموذج إصابة معينة. لقد افترضنا أن وسيلة لإيصال الضوء، والتي يمكن بسهولة تغيير الطول الموجي وشدة المعلمات، يمكن أن يسهل تحديد جرعة المثلى لR / NIR-LT للحد من أنواع الاكسجين التفاعلية(ROS) في المختبر. تم تصفيتها غير متماسك زينون الضوء من خلال مرشحات تدخل ضيقة النطاق لتقديم موجات متفاوتة (موجات مركز 440، 550، 670 و 810nm) وfluences (8.5 × 10 -3 إلى 3.8 × 10 -1 J / سم 2) من الضوء إلى الخلايا المستزرعة. تم معايرة الضوء الناتج من الجهاز لتنبعث منها جرعات كمي ذات الصلة علاجيا، متساوية من الضوء في كل الطول الموجي. تم الكشف عن الأنواع المتفاعلة في وأكدت الغلوتامات الخلايا المعالجة مع الضوء، وذلك باستخدام DCFH-DA وH 2 O 2 الأصباغ الفلورية الحساسة. سلمنا بنجاح الضوء على مجموعة من الناحية الفسيولوجية وعلاجيا موجات وشدة ذات الصلة، إلى الخلايا المستزرعة تتعرض لالغلوتامات كنموذج للإصابة الجهاز العصبي المركزي. في حين أن fluences من R / NIR-LT المستخدمة في الدراسة الحالية لم ممارسة تأثير على ROS التي تولدها الخلايا المستزرعة، وطريقة التسليم الخفيف ينطبق على نظم ال آخريننظم الإدارة البيئية بما في ذلك الميتوكوندريا أو أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج ثقافة شريحة عضوي النمط ذات الصلة معزولة، ويمكن استخدامها لتقييم الآثار على مجموعة من التدابير نتائج الأيض التأكسدي.

تم معايرة إخراج ضوء ألقاها في طول موجة من 670nm باستخدام مرشحات الكثافة محايدة من أجل أشرق الخلايا مع مجموعة من fluences تشمل جرعة من الضوء 670nm هو موضح سابقا أن تكون مفيدة في الجسم الحي (0.3 J / سم 2) 20. حيث بلغ عدد مرشحات الكثافة محايدة أمام مصدر الضوء زيادة، وشدة (W / م <...

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro at JoVE.com

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

method-for-assessment-effects-range-wavelengths-intensities-rednear

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

8.6K Views.  The University of Western Australia. Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Video: Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

وهناك طريقة لتقييم بكتريوسين الآثار على الأمعاء الدقيقة من الفئران

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...