We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. إعداد coverslips الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم 12 ملم coverslips الزجاج قطر التي نقع عليها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة على الأقل مع الإثارة في بعض الأحيان لضمان التعرض الكلي لجميع coverslips إلى الإيثانول. صب coverslips الزجاج والايثانول في طبق خلية ثقافة عقيمة (إما 6 سم أو 10 سم القطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من معقمة غرامة 5B ملقط، والتقاط ووضع كل ساترة الزجاج الفردية في بئر من 24 لوحة العنقودية بشكل جيد. الحرص على ضمان لل coverslips لا تلامس جوانب البئر وما يقرب من في منتصف البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحة المغطاة الامم المتحدة 24 عنقودية بشكل جيد مع coverslips الزجاج لتجف في مجلس الوزراء التدفق. وهذا يستغرق حوالي 10 دقيقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الفترة، وإعداد مزيج الطلاء عن طريق تمييع 10 ملغ / مل فبرونيكتين الإنسان في المتوازن محلول الملح هانك (HBSS) إلى 0.1 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون لل coverslips الجافة، ماصة 100 ميكرولتر من محلول طلاء على كل الزجاج المشتركverslip ذلك الحل لا يغطي سوى الزجاج دون تجمع نحو الخارج من البئر. وضع لوحة غطت 24 عنقودية جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستعمال، وإزالة حل طلاء. يمكن نقل الحل طلاء نفسه إلى أنبوب معقم واستخدام ما يصل الى ثلاث مرات مع عدم فقدان مرئية من الفعالية. </li></ol> 2. إعداد البطانية أحادي الطبقة خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة الإنسانية الشريان البطانية (EC) في المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وشطف EC أحادي الطبقة مع 10 مل HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة HBSS وإضافة 2 مل 0.5٪ التربسين، 0.2٪ محلول EDTA. في احتضان RT لمدة 5 دقائق تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما EC يمكن إقصاؤه من خلال الصنبور إلى جانب القارورة، إضافة 5 مل من فول الصويا مثبط التربسين ومع ماصة بخ سطح القارورة لزيادة إزاحة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في أنبوبفي 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من طاف و resuspend بيليه EC في 5 مل من وسائل الإعلام. عد الخلايا مع haemocytometer وضبط تركيز الخلية إلى 50000 EC لكل مل من EC سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 مل من تعليق خلية في كل بئر من 24 لوحة جيدا تحتوي على coverslips الزجاج المطلي. احتضان خلايا O / N في ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا جاهزة للاستخدام في التجارب عندما يتم تشكيل أحادي الطبقة متموجة، في غضون 3 أيام. </li></ol> 3. إعداد وحيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل HL-60 الخلايا التي يتم تربيتها في RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، والثقافة التعليق في أنبوب 15ML. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل وسائل الإعلام وضبط تركيز الخلية مع وسائل الإعلام إلى 2 مليون خلية / مل. إذا كان المطلوب وضع العلامات مضان من HL-60، resuspend الخلايا في RPMI دون المصل والعلاقات العامةoceed كما هو موضح في قسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من HL-60 تعليق خلية في كل بئر من لوحة 24 عنقودية كذلك تحتوي EC أحادي الطبقة واحتضان لوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة محددة من الزمن اختار ما بين 1 و 3 ساعة. ويلاحظ فارق كبير بين 1 ساعة و 3 ساعة الوقت نقطة، حيث بلغ التشبع ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للخلية غسل / حصاد: ملء أنبوب 120 مل مع 100 مل من HBSS. الاستغناء 1 مل من الفورمالين في كل بئر من 24 لوحة جديدة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، واستخدام زوج من الملقط حادة والتقاط ساترة الزجاج من البئر وعقد ساترة رأسي والداب حافة ساترة على قطعة من النسيج على مقاعد البدلاء لمدة 3 ثانية، مع الحرص على عدم لمس السطح المغطاة خلية من ساترة مع الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ساترة بحزم مع زوج من ملقط، دونك ساترة ويخرجون من HBSS خمس مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد دونك الخامسفي HBSS، الداب حافة ساترة على الأنسجة لمدة 3 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الإجراءات التغميس واللمس هو موضح في 3.6 و 3.7، مما يجعل ما مجموعه ثلاث مجموعات من 5 يغمس تليها لمسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ساترة إلى تحتوي أيضا 10٪ من الفورمالين لإصلاح الخلايا في RT. ساترة جاهزة للتعداد، للتخزين طويل الأجل أو أن تخضع لإجراءات أخرى هو موضح أدناه. </li></ol> 4. وسمها HL-60 الخلايا مع المقتفي الخليوي (اختياري) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد ونقل كمية مناسبة من HL-60 الخلايا (على سبيل المثال، 10 مليون دولار) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الطرد المركزي HL-60 الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في تعقب خلية في RPMI وسائل الإعلام دون المصل في تركيز 1 مليون خلية / مل. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. بيليه الخلية resuspend في وسائل الإعلام إلى التركيز من 2000000 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من المسمى تعقب خلية HL-60 إلى تحتوي كل منها على جانب الخلايا البطانية التي تزرع على الزجاج ساترة. تواصل في 3.3. </li></ol> 5. تعداد الخلايا البطانية لاصق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips على شرائح المجهر مع دابي مكافحة وصمة عار لتحديد الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب مع الهدف 4X أو 10X، والحصول على صور العديد من المجالات (على سبيل المثال، 5 الحقول) والاعتماد على أعلى عدد من وحيدات التي تجمع على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع (يجب أن يكون هذا عادة 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مرتين هذا العدد كما عتبة حيدات على خلية البطانية أن أن يعرف بأنه كتلة. إذا لزم الأمر، معيارا مختلفا يمكن استخدامها لتحديد كتلة تبعا لطبيعة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الكتل وعدد من الخلايا البطانية في هذا المجال. تقسيم الأولى قبل الأخير للحصول على نسبة الخلايا البطانية لاصقة. أحرز هدفاالعديد من المجالات للحصول على انحراف متوسط ​​و المستوى من التهم الموجهة إليه. </li></ol> 6. Counterstaining مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في 10٪ من الفورمالين لمدة 15 دقيقة في RT، تخضع لل coverslips إلى المناعي باستخدام الإجراء العادي 10 و الأجسام المضادة في الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol> 7. Counterstaining للالمرتبط اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز آخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إصلاح مقايسة التصاق والخلايا على ساترة في الفورمالين لمدة 15 دقيقة، وصمة عار للنشاط بيتا غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة كما هو موضح في التعليمات التي تصاحب عدة تلطيخ. إضافة وإزالة الحلول المختلفة بلطف شديد لتجنب طرد حيدات التي تعلق على الخلايا البطانية. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تم استخدام فحص الوحيدات التصاق المذكورة أعلاه بنجاح في التجارب تهدف إلى دراسة التأثيرات البيولوجية للإشعاع المؤين على الطبقات الوحيدة البطانية 10. على الرغم من أن هذا ليس هو الأسلوب الوحيد المتاح لتقييم الإلتصاق من أحادي الطبقة البطانية، وهو الأسلوب الوحيد الذي يسمح الكمي لنسبة أو نسبة الخلايا البطانية في أحادي الطبقة التي هي لاصقة. هذا تمييز مهم كتغيير الكمي عالميا في التصاق حيدات، كما تم قياسها عن طريق وسائل أخرى يمكن أن تعزى إما إلى الارتفاع العام في الإلتصاق جميع خلايا أحادي الطبقة البطانية أو إلى زيادة الإلتصاق من السكان الفرعي من الخلايا البطانية ضمن أحادي الطبقة، كما هو موضح في المثال أعلاه. ويتمثل قيمة وجود هذه المعلومات من خلال حقيقة أن القدرة لقياس نسبة الخلايا البطانية التي عرضت تعزيز الإلتصاق بعد التشعيع أدى إلى إيناسوكانت النتيجة قادر أن هذا التأثير لا يعود إلى طفرة جينية من الجين على نحو خاص والنسبة المئوية للخلايا التي كانت لاصقة جدا فوق (أكثر من 1000 مرة) ما هو متوقع من طفرة عشوائية من الجينات التي كتبها X-الإشعاع عند هذه الجرعة . العامل الذي يسمح استنساخ جيدة من النتائج هو نظام الغسيل. كما ينطوي على إجراء الغسيل غمر ساترة الزجاج في غسل العازلة تليها اللمس على الأنسجة، ويتم تجنب التقلبات في الاضطرابات العازلة التي تنشأ حتما من الطريقة القديمة المتمثلة في pipetting لمن غسل العازلة في بئر. في الواقع كان مراقبة التقلبات المفرطة بين مكررات تم الحصول عليها باستخدام أسلوب pipetting لأن أجبرتنا على وضع إجراءات الغسل أن إزالة عنصر التباين من خطوة الغسيل. باعتراف الجميع، والقيود المفروضة على هذا الاختبار تكمن في الحاجة إلى إجراء العد اليدوي لمجموعات الوحيدات، والتي لا نبعد التمديد يسمح لها أن تتكيف لتحليل إنتاجية عالية. ثانيا، قرار بشأن كيفية تشكل العديد من وحيدات مجموعة أن تحدد شبه تعسفي ويمكن ضبط مستوى عال جدا ويؤدي إلى استبعاد بعض الكتل حقيقية. ويمكن أيضا لعدم وجود قوة القص في هذه الطريقة أن ينظر إليه باعتباره القيد في التجارب التي يسببها الإلتصاق معززة بشكل صارخ من الخلايا البطانية (على سبيل المثال، + TNFα). في حالات أخرى ومع ذلك، فإن عدم وجود قوة القص هي ميزة لأنها تتيح للكشف عن زيادة أقل مبالغ فيه من الإلتصاق. زيادة متواضعة في الوحيدات الإلتصاق يمكن أن تكون ذات أهمية خاصة وذات الصلة. في الجسم الحي، لن (في وقت تجريبي نموذجي) من المتوقع أن نعلق بأعداد كبيرة إلى الخلايا البطانية مع زيادة متواضعة في الإلتصاق، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى قوة القص وحيدات. في الوقت ومع ذلك، بعض وحيدات على الارجح، وهذا هو الأرجح لتمثيل البيئة من التهاب مزمن. كما،غياب قوة القص يمكن أن يكون ميزة، حيث أنه يوفر الفرصة لزيادة طفيفة في الإلتصاق الخلايا البطانية ان يعلن في الأطر الزمنية التجريبية التي عادة ما تكون قصيرة، وربما عابرة جدا للسماح زيادة متواضعة في الإلتصاق التي يتعين مراعاتها تحت إجهاد القص. القدرة على إخضاع الخلايا بعد هذا الاختبار إلى تحليلات أخرى مثل فحص الشيخوخة والمناعي تلطيخ يزيد من فائدة هذه الطريقة لأنها تتيح للجمعية الإلتصاق من الخلايا البطانية محددة لخاصة البروتينات الخلوية أو الدول الخلوية كما هو موضح أعلاه، وهي الميزة التي غير متوفر مع فحوصات التصاق القديمة. وقد استخدم هذا الأسلوب مع الخلايا التاجية الإنسان خلد est2 البطانية ونتائج مماثلة تم الحصول عليها أيضا مع الخلايا التاجية الإنسان الأساسية البطانية 10، مما يدل على أنه ليس خاصا فقط خط خلية معينة. أيضا، واللغطption هذه الطريقة من معايرة الإلتصاق من الخلايا البطانية لا يحول دون تعريض الخلايا نفسها لفحص التصاق القياسية التي تقيس مضان من immunocytes المسمى. معا، ويوضح هذا التقرير أن هذه الطريقة هي متعددة وشامل ويوفر المزيد من المعلومات من التصاق الفحص القياسية.

<html> تسلل الخلايا المناعية مثل وحيدات عبر طبقة الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية هو خطوة هامة في عملية الالتهاب 1. وهذا يسمح للصاروخ موجه من الخلايا المناعية (immunocytes) إلى موقع الإصابة. في حالات ومواقع أخرى مثل الشريان التاجي والشريان السباتي، يمكن التسلل من وحيدات من خلال طبقة بطانة يؤدي إلى إقامة غير مرغوبة على المدى الطويل من هذه الخلايا في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى تكوين لويحات 2. في جميع حالات تسلل خلية مناعية، فإن الخطوة الأولى تنطوي على تفعيل الخلايا البطانية في منطقة مترجم من الأوعية الدموية. يتم تنشيط الخلايا البطانية التي كتبها السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل TNF-α و IL-6 لزيادة التعبير عن بروتينات سطح الخلية مثل VCAM، ICAM وE-selectin التي تسهل التوظيف والحجز على immunocytes على سطح الخلايا البطانية 3- 6. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; في البداية، تم إجراء قياس التصاق الخلايا البطانية بها عد حيدات أن تلتزم البطانية أحادي الطبقة 7. وأدت القيود المفروضة على هذه الطريقة من حيث الدقة في استخدام الخلايا اللمفاوية المسمى الراديو أو الوحيدات، تليها الكمي للمواد المشعة والتي تتطابق مع الخلايا الليمفاوية أو وحيدات التصاق 4. هذه الطريقة حلت محلها في نهاية المطاف من خلال طريقة القائم على مضان، حيث وصفت immunocytes في المصالح مع مضان صبغ وتعرض لنفس الإجراء على النحو الوارد أعلاه مع والفرق بينهما أن مضان بدلا من النشاط الإشعاعي يتم قياس 8. في الوقت الحاضر هذا الأسلوب قد برز بوصفه الأكثر ملاءمة ويباع في شكل مجموعة من قبل العديد من الموردين التجارية. في حين أن هذا الفحص يمكن قياس المستويات النسبية للالإلتصاق بين الضوابط والعينات التجريبية، فإنه لا يكشف ما إذا كان هناك تغيير في مضان يرجع ذلك إلى تغيير موحد في الإلتصاق عبر البريد كاملالسكان الخلية ndothelial أو إذا كان التغيير هو بسبب وجود اختلاف في الإلتصاق بين السكان الفرعي من الخلايا. ومن الواضح أيضا أن التشدد في غسل تمارس تأثير عميق على النتيجة، والأهم من ذلك، فإن توحيد الشطف قبالة حيدات غير منضم بين مختلف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تؤثر بشكل كبير على التقارب في نتائج مكررات واستنساخ النتائج بين العينات . وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام عدة أنظمة التي تضخ حيدات في وسائل الإعلام عبر أحادي الطبقة البطانية خلية لمعالجة هذه المشكلة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه النظم تدفق أيضا ألخص تأثير قوة القص على الخلايا البطانية. في حين أن مزايا هذه الأنظمة واضحة وجذابة للغاية، ومن المهم أيضا أن ندرك أنه في حين أن الإلتصاق الخلايا البطانية يمكن زيادتها إلى حد كبير، كما هو الحال في التهاب حاد، بسبب عوامل مثل TNFα، وبعض المنشطات الأخرى، مثل الإشعاع المؤين 10 انتزاع يتغير رلم يتم الكشف عن قبعة بسهولة داخل الإطارات في المختبر الوقت التجريبية من قبل هذه الأنظمة الصارمة جدا. في حين تغييرات في اللحظة هذه من الإلتصاق الخلايا البطانية وغاب بسهولة أو رفضت في المختبر، فإنه ليس بالضرورة حميدة في الجسم الحي، حيث مثل هذه التغييرات الصغيرة في غضون فترة زمنية الحياة، الذي هو سمة من التهاب مزمن، يمكن أن تمارس نتائج كبيرة جدا. وبالتالي وسيلة قوية، ولكن حساسية، ومحددة لكشف وقياس هناك حاجة الإلتصاق الخلايا البطانية. هنا، ونحن التقرير وسيلة لقياس الإلتصاق من الخلايا البطانية مباشرة. هذه الطريقة لا تعتمد على قياس مضان كمؤشر مركب غير مباشر من الإلتصاق الخلايا البطانية. أنه يكشف ما إذا كانت التغييرات في الإلتصاق ومن المقرر أن التغيير موحد في جميع الخلايا أو تقتصر على سكان الفرعي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح شارك في تلطيخ الخلايا البطانية مع علامات مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز، بقاء الخلية مارسكير، Calcien AM والأجسام المضادة ضد سطح الخلية والبروتينات داخل الخلايا، مما يتيح للجمعية الخلايا البطانية لاصقة الفردية لبعض الدول خلية أو التعبير عن بروتينات معينة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

واحدة من العمليات الأساسية للالتهاب غير تسلل الخلايا المناعية من التجويف من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المحيطة بها. يحدث هذا عندما الخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدموية، تصبح لاصقة لتعميم الخلايا المناعية مثل وحيدات. وحتى تم ذلك في المختبر قياس هذا الإلتصاق الآن عن طريق قياس عدد من وحيدات التي تلتزم طبقة بطانة إما العد المباشر أو عن طريق قياس غير مباشر لمضان من حيدات ملتصقة. وفي حين أن هذه القياسات لا تشير إلى متوسط ​​الإلتصاق من السكان الخلايا البطانية، ومرتبك من قبل عدد من العوامل، مثل عدد الخلايا، وعدم الكشف عن نسبة الخلايا البطانية التي هي لاصقة في الواقع. نحن هنا وصف وشرح الطريقة التي تسمح للتعداد خلايا لاصقة داخل الكتلة السكانية اختبار أحادي الطبقة البطانية. تزرع الخلايا البطانية على coverslips الزجاج ويلي المرجوةوتحدى العلاج مع حيدات (التي قد يتم fluorescently المسمى). بعد الحضانة، وإجراء الشطف، التي تنطوي على جولات متعددة من الغمر والصرف الصحي، يتم إصلاح الخلايا. يتم تحديد بسهولة الخلايا البطانية لاصقة، والتي تحيط بها وحيدات وتعداد، وهو ما يعطي مؤشر التصاق أن يكشف عن النسبة الفعلية من الخلايا البطانية في أوساط السكان التي هي لاصقة.

هذا الأسلوب يسمح للكشف عن الخلايا البطانية لاصقة الفردية بين السكان. على سبيل المثال، في حين أحادي الطبقة من الخلايا البطانية-المشع الامم المتحدة احتفظت بضع متفرقة HL-60 حيدات التالية الحضانة والغسل، وأحادي الطبقة البطانية في 7 أيام بعد 10Gy التشعيع قبل الحضانة مع حيدات كان لا بد حيدات في مجموعات حول الخلايا البطانية الفردية ( الشكل 1). على الرغم من أن هذه الظاهرة يمكن ملاحظتها بسهولة في إطار المرحلة النقيض المجهر، المجهر مضان يكشف عن صورة أكثر وضوحا من مجموعات الوحيدات. بعد إجراء الفحص التصاق وصفها، فمن الممكن للشروع في تلطيخ الخلايا لغشاء، حشوية أو الطاقة النووية (الشكل 2) البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المناسبة مع أساليب المناعي القياسية. وعلاوة على ذلك، فحص القائم على انزيم مثل المرتبطة الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز (الشكل 3) يمكن أيضا أن تكون المؤسسة العامةrformed. لأن كل كتلة الوحيدات يتوافق مع خلية البطانية الفردية، وتعداد مجموعات تكشف عن العدد الفعلي للخلايا البطانية لاصقة داخل أحادي الطبقة (الشكل 4)، وبالتالي فإن النسبة المئوية للخلايا البطانية لاصقة داخل السكان (الجدول 1، الشكل 6) . هذه هي الطريقة الوحيدة حتى الآن التي تسمح بمثل هذه الكمي من الإلتصاق الخلايا البطانية. من الجدير بالذكر أن الخلايا البطانية التي استخدمت في التجارب هنا، تحول دون الاتصال ولا تزيد في عدد بعد تحقيق التقاء. هذا يلغي التعقيد المحتمل الذي تشكله زيادة عدد الخلايا البطانية في نقطة زمنية لاحقة. إذا رغبت في ذلك، وحيدات تعلق على الطبقات الوحيدة البطانية يمكن طردت بنسبة 0.5٪ محلول التربسين 0.2٪ EDTA (بدلا من التثبيت في 3.9) ومضان على قياس باستخدام قارئ لوحة، كما هو الحال في الطرق المعاصرة (الشكل 5). </P&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> الشكل 1. التصاق حيدات على أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. على الخلايا البطانية للأمم المتحدة المشع، وحيدات التقيد شكل خلايا مستقلة بطريقة متفرقة وعشوائية (لوحات اليسار) وفي مجموعات على الخلايا البطانية الفردية لل7 أيام بعد 10 غراي المشع أحادي الطبقة (لوحات اليمين). لوحات الدنيا هي صور مضان من لوحات العليا، مؤكدا أن خلايا صغيرة ومشرقة كروية مرئية تحت النقيض من المرحلة هي في الواقع حيدات التي وصفت قبل مع الخلية المقتفي الأخضر. وأشار بعض الكتل الوحيدات التي كتبها السهام البيضاء. واتخذت صورة باستخدام الهدف 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html><img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> الشكل 2. تلطيخ الخلايا البطانية للبروتينات بعد التصاق الفحص. بعد الانتهاء من فحص التصاق وصفها، وتعرض الخلايا على coverslips الزجاج لالمناعي للكشف عن (A) بروتين الغشاء (CD44)، ب) بروتين حشوية (تويولين) أو ج) البروتين النووي (γ-H2AX). لوحات اليسار من (A) و (B) (شهدت مع الهدف 20X) عرض حيدات وصفت مسبقا مع تعقب خلية الأخضر وصورة مماثلة على لوحات اليمين تكشف CD44 والأنابيب الدقيقة (أحمر) ونوى دابي الملون (الأزرق). السهام البيضاء في (C) نقطة لالمشع نوى الخلايا البطانية التي كانت ملطخة أجسام مضادة ضد γ-H2AX. وتتميز نواة الوحيدات التي هي ملطخة أكثر إشراقا الأزرق التي كتبها دابي بسهولة من بيضاوية الشكل نوى الخلايا البطانية. وقد أخذت صور مع الهدف 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> الرقم 3. المرتبطة اليخوخة بيتا غالاكتوزيداز تلطيخ الخلايا البطانية بعد التصاق الفحص، وتعرض خلايا coverslips على لتلطيخ للالمرتبط الشيخوخة بيتا غالاكتوزيداز الذي يسبب الجسيمات الحالة خلايا هرمة لتحويل الأزرق، كما هو واضح في الخلية البطانية التي بشكل انتقائي ملزمة من قبل العديد من وحيدات، والتي يتم تحديدها بسهولة نظرا لصغر حجمها وشكلها كروي. الصورة المرئية من خلال الهدف 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; الرقم 4. تعداد مجموعات الوحيدات على الخلايا البطانية الفردية. بعد التصاق الفحص، واتخذت صورة من الخلايا من العديد من المواقف المختلفة ومجموعات الوحيدات التي تم تحديدها ودائري (باللون الأخضر). تم تعريف الكتلة باعتبارها التكتل من 10 أو أكثر من وحيدات الخلية على البطانية. احصي عدد الكتل الوحيدات وعدد 12 أيام الخلايا البطانية بعد المشع (منقط باللون الأحمر) في الصورة ونسبة الخلايا البطانية ملتصقة تحسب كما هو مبين في الجدول 1. الصورة مأخوذة من خلال الهدف 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> الرقم 5. الكمي لمضان من حيدات ملتصقة. بعد adhe<html> سيون الفحص، تم trypsinised الخلايا على coverslips الزجاج ومضان من حيدات صفت مسبقا مع CellTracker الخضراء وقد تم قياس، وذلك باستخدام قارئ لوحة مضان، كمؤشر غير مباشر من لزوجة أحادي الطبقة البطانية. وقد تم الحصول على نتائج هذه القياسات في الأيام جاء بعد التشعيع وضفروا على الرسم البياني أعلاه. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> الرقم 6. تمثيل عشرات التصاق مقايسة من الجدول 1. وسجل لاصق الخلايا البطانية في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في الشكل (4) والنتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، 8-10 في المئة من المشع أصبحت الخلايا البطانية لاصقة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; نسبة من مادة لاصقة الخلايا البطانية </td></tr><tr><td></td><td> القرص 1 </td><td> القرص 2 </td><td> القرص 3 </td></tr><tr><td> المجال 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> الميدان (2) </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> الحقل 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> الحقل 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> المجال 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> متوسط </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. التصاق عشرات الفحص. وسجل الخلايا البطانية لاصقة في خمسة مواقع مختلفة في ثلاث coverslips الزجاج كما هو موضح في Figure 4 ونتائج جدولة أعلاه يدل على أنه بعد 12 يوما 10 غراي التشعيع، أصبحت 8 الى 10 في المئة من الخلايا البطانية المشع لاصقة.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...