نحن ممتنون إلى الدكتور تييري Pourcher على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام مطياف مضان ومساعدته. ويتم تمويل المختبر من قبل الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (فريق الرياضي labellisée)، وجمعية بحوث صب لا مناهضة جنيه السرطان، والمعهد الوطني للسرطان (إنكا)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث، METOXIA (برنامج الاتحاد الأوروبي FP7)، والمركز A. Lacassagne، والمركز الوطني للبحوث العلميه، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث ميديكال وجامعة نيس ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). نشكر الدكتور كريستيان M الإبراهيمي في القرن لقراءة نقدية وتصحيح التحرير.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين 1. تحلل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور بتركيز 0.5-2 × 10 6 لكل 100 ملم طبق القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج: احتضان خلايا 24، 48، أو 72 ساعة في تركيز الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في علة بوكس محطة العمل اللاهوائية (Ruskinn تكنولوجيا Biotrace الدولية بي، كارديف، المملكة المتحدة) وضعت في 1٪ أو 0.1٪ O 2، 94٪ أو 94.9٪ N 2، و 5٪ CO 2. في موازاة ذلك، احتضان الخلايا في normoxia (21٪ O 2، 5٪ CO 2). تغيير المتوسطة (25 ملي المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز) كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز خلال فترة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج، وخلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الجلوكوز من مستنبت. تتخلص من الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الحل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بيليه يمكن تجميد في -20 درجة مئوية قبل المضي قدما.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة 100 ميكرولتر من الجليكوجين المخزن المائي المتوفرة مع الفحص كيت الجليكوجين (Abcam). غلي المحللة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأجهزة الطرد المركزي في دوامة المحللة في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لإزالة منتجات غير قابلة للذوبان. إبقاء طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتطبيع مستويات الجليكوجين لمحتوى البروتين بين العينات، التقدير الكمي للبروتينات يمكن القيام به مع 25-35 ميكرولتر من طاف باستخدام مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA-Interchim). </li></ol> بعض المحللة يمكن استخدامها لقياس تركيز الجلوكوز داخل الخلايا الحرة. 2. التحلل من الجليكوجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 50 ميكرولتر من طاف (الخطوة 1) مع 1 ميكرولتر من التحلل أنزيم ميكس. يحتوي هذا الخليط غلوكوأميلاز. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنى المعايرة عن طريق تمييع الجليكوجين القياسية (2 ملغ / مل) قupplied مع عدة لإيجاد حل من 10 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت التحلل. المقبل، وإعداد ستة أنابيب منفصلة مع 0، 4، 8، 12، 16، و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل القياسية وضبط كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع العازلة المائي لإعطاء تركيز الجليكوجين 0، 0.04 ، 0.08، 0.12، 0.16، و 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة 1 ميكرولتر من أنزيم ميكس التحلل في المعايير واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> يجب أن تطرح تركيز الجلوكوز خلفية خط الخلية، التي قدمها قيمة للتركيز الجلوكوز الحرة، من قيمة للتركيز الجلوكوز الإجمالي (الجلوكوز من الجليكوجين التحلل + خالية من الجلوكوز) لتحديد مستوى الجليكوجين في الخلية. 3. التنمية والقراءة من الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حالة، وإعداد أنبوب واحد (أنبوب 1) لقياس تركيز السكر الحر واثنين من أنابيب (أنابيب 2 و 3) لقياس مجموع تركيز الجلوكوز (كل الطرافة أنبوبها حجم مختلفة من الجليكوجين تحلل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من طاف المستخرجة في نهاية الخطوة 1 في أنبوب 1. إضافة 35 ميكرولتر من العازلة المائي لإتمام إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. سوف مضان الحصول إعطاء تركيز الجلوكوز الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2) في أنبوب 2. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. حجم العينة (X ميكرولتر) لابد من تعديلها وفقا لكثافة الخلية و / أو نوع من الخلايا من أجل الحصول على القيم مضان التي لا تتجاوز تركيزات من منحنى المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل في أنبوب 3. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول التنمية للعينات والمعايير عن طريق خلط لكل أنبوب 48.7 ميكرولتر من العازلة التنمية، 1 ميكرولتر من التنمية أنزيم ميكس و 0.3 ميكرولتر من OxiRed دقق (مرفق في الجليكوجين الفحص كيت). على سبيل المثال، لمدة 2 الظروف، وإعداد المزيج لمدة 12 أنبوبق (6 لمعايير، 2 للجلوكوز حرة و 4 لمجموع مضان الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان في الطول الموجي من 535 نانومتر الإثارة، والطول الموجي من 587 نانومتر الانبعاثات على النحو الموصى به، وفتحة من 3 نانومتر لالإثارة وانبعاث. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر يسمح الكمي الدقيق للخلايا محتوى الجليكوجين. مقارنة مع بعض التقنيات الأخرى (PAS، المناعي مع الأجسام المضادة الجليكوجين، الخ)، وهذه المعايرة هي محددة جدا وحساسة وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطر...

الجليكوجين هو بوليمر multibranched من بقايا الجلوكوز، والتي هي موجودة في السيتوبلازم العديد من أنواع الخلايا. وهي واحدة من أهم أشكال تخزين الطاقة في الخلايا ويلعب دورا هاما في أيض الجلوكوز. معظم خلايا الثدييات هي قادرة على انتاج وتخزين الجليكوجين، والتي يمكن أن يتحلل سريعا إلى جلوكوز لتعزيز إنتاج وتحلل ATP أثناء الإجهاد الأيضي. خلايا الكبد تنتج كميات هائلة من الجليكوجين لتنظيم مستوى السكر في الدم وبالتالي توفير امدادات مستمرة من الجلوكوز في الجسم. في المقابل، فإن تركيز الجليكوجين في خلايا أخرى (العضلات، وخلايا الدم الحمراء، الخ) منخفضة نسبيا. ومع ذلك، محليا، وهذه الكميات كافية لتوفير الطاقة على المدى القصير عند فجأة تتعرض الخلايا لبيئة المحرومين من المواد المغذية. توليف الجليكوجين والجليكوجين انهيار يتبع نفس الخطوات في جميع الأنسجة (الشكل 1). أولا، الجلوكوزيدخل الخلايا عن طريق ناقلات الجلوكوز (افراط)، ويتم تحويلها بسرعة من الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) إلى جلوكوز-1-الفوسفات (G1P) من خلال فسفوغلوكوموتاز. ثم يتم تعديل G1P الى UDP الجلوكوز، ويتم إرفاق C1 الكربون من UDP الجلوكوز إلى بقايا التيروزين من glycogenin، البروتين رسو الجليكوجين. هذا الجزيء، يعتبر التمهيدي الجليكوجين، تم تمديده عن طريق الحجز من UDP الجلوكوز إلى جلوكوز عن طريق محطة α (1 → 4) السندات عن طريق سينسيز الجليكوجين. أخيرا، عندما يتم تشكيل سلسلة خطية من أكثر من 11 بقايا الجلوكوز، انزيم المتفرعة نقل وقليل السكاريد محطة مكونة من ما لا يقل عن 6 إلى بقايا الجلوكوز الجلوكوز آخر من سلسلة المجاورة من خلال α (1 → 6) الربط. تكرار هذه العملية يعطي هيكل كسورية ضخمة تحتوي على الفروع التي تشكل الحلزون مع 6.5 الجلوكوز في المقابل. الجليكوجين يمكن أن يكون باتجاهين معاكسين تحلل إلى جلوكوز عن طريق العمل المتضافرمن المشذب الانزيمات التي يتحلل لα (1 → 6) ملزمة والجليكوجين فسفوريلاز أن hydrolyzes وα (1 → 4) غليكوزيدية المربوطة بين بقايا الماضي من الجلوكوز من فرع وجزيء الجليكوجين. يتم تنشيط هذا التفاعل يسمى تحلل الغليكوجين من خلال زيادة مستويات AMP (التي تعكس استهلاك ATP)، وتحول دون الجلوكوز وATP 2،3. بواسطة المجهر الإلكتروني، وقد وصفت جزيئات الجليكوجين في العديد من أنواع الخلايا جزيئات β كما حرة (أو monoparticles الجليكوجين) من 15-30 نانومتر في القطر. في أنواع معينة من الخلايا مثل خلايا الكبد، والجسيمات β يمكن تجميعها في مجمع لتشكيل ريدات، والمعروف أيضا باسم جسيمات α التي تختلف في القطر من 80 نانومتر إلى حد أقصى قدره 200 نانومتر 4 </سوب&gt;. الطريق مستعبدين هذه الجسيمات β لتشكيل مجموعات أكبر من الجسيمات α لا يزال غير توضيح بالكامل. يميل بعض الأدلة لإثبات أن الجزيئات β يمكن المستعبدين من قبل الرابطة التساهمية 5، الرابطة الهيدروجينية، أو حتى من خلال تفاعلات البروتين البروتين 6. كمية الجليكوجين المخزن في الخلايا يعتمد على الكثير من العوامل: (I) كمية glycogenin في الخلية التي يبدأ تخليق الجليكوجين، (الثاني) نشاط سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ينظمها البروتين الفسفرة / نزع الفسفات، (الثالث) تركيز الجلوكوز في الخلايا، والتي تعتمد على عدة معايير مثل توريد الجلوكوز من الأوعية الدموية وامتصاص الجلوكوز من قبل الخلايا. وينظم مخازن الجليكوجين بإحكام من قبل تنظيم تفارغي الهرمونات السكروز من خلال نواتج وسيطة، من خلال الهرمونات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي والطاقة، والمواد الغذائية الاستشعار عن مسارات إشارات 7. من المهم أن تكونقادرة على تحديد الجليكوجين في العينات البيولوجية إلى فهم أفضل لأهمية التمثيل الغذائي الجليكوجين في الجسم كله والمستوى الخلوي. نحن هنا وصف دقيق البيوكيميائية، واستنساخه ومريحة في فحص المختبر لالجليكوجين. ويستند هذا الأسلوب على مضان الجلوكوز الكمي قبل وبعد التحلل محددة من الجليكوجين. توجد طرق أخرى لتقدير مستوى الجليكوجين في الخلايا، ولكن معظمهم ليسوا الكمي. واستند واحدة من التقنيات أول وصف لتقدير حجم الجليكوجين في الخلايا على قياس التأسيس [14 C] الجلوكوز في الجليكوجين 8،9. استخدام النشاط الإشعاعي يجعل هذه العملية أكثر صعوبة في التعامل معها ولكن له ميزة توفير نسبة الجلوكوز إلى الجليكوجين التأسيس والتمييز بين توزيع بقايا الجلوكوز على الفروع والخارجي في قلب جزيء (فإنه يتطلب أيضا β-amyloly إضافيةجهاز الأمن والمخابرات وخطوة الكروماتوغرافي). وقد تم تطوير تقنية أخرى في الآونة الأخيرة ويقوم على دمج 2-NBDG (2 - {N-[7 nitrobenz-2-oxa-1 ،3-diazol-4-YL]} الأمينية-2-deoxyglucose)، و 2-deoxyglucose مشتقة الفلورسنت، في الجليكوجين 10. قياس كثافة مضان يعكس كمية الجليكوجين إنتاجها ويمكن قياس مع قارئ مضان. ويمكن أيضا توزيع مضان في الخلية يتم تقييمها بواسطة المجهر متحد البؤر. من بين التقنيات الأخرى nonquantitative، الدوري حمض شيف تلطيخ (PAS) وربما كان الأكثر شيوعا. ويمكن استخدامه للكشف عن الجليكوجين في خلايا ثابتة، أقسام الأنسجة في البارافين أو المجمدة. هذه الألوان تقنية النسيجية تحديدا غير السكريات، السكرية، البروتينات السكرية، والسليلوز mucins محايد باللون الأرجواني. ويمكن زيادة خصوصية هذا الاختبار عن طريق العلاج من خلايا ثابتة أو أقسام الأنسجة مع دياستاز، الذي يساعد على هضم تحديدا الجليكوجين. بعد ذلك،مستوى الجليكوجين يمكن تقدير نوعيا من خلال مقارنة عينات unhydrolyzed (جميع الجزيئات الكربوهيدرات تعديل) لعينات تحلل (الكربوهيدرات تعديل الجزيئات باستثناء الجليكوجين). يوفر تلطيخ PAS والتحليل المجهري، على عكس فحوصات البيوكيميائية من الجليكوجين، معلومات بشأن توزيع الجليكوجين في الخلية، والتي يمكن أن تنتشر أو تتركز في جزء معين من الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات في التقديرات PAS تلطيخ تراكم الجليكوجين بين ظروف مختلفة، فإنه ليس الكمي 11. والأضداد وحيدة النسيلة الماوس في الأصل باستخدام الفك السفلي اللقمة الغضروف كما ثبت مستضد لتتفاعل مع الجليكوجين في الخلايا وتنقيته مع الجليكوجين في المختبر 12. كما تعترف هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد سلاسل السكر المرتبطة الجليكوجين، بل هو أداة مفيدة للكشف عن الجليكوجين عن طريق المناعية بطريقة أكثر تحديدا من تلطيخ PAS. </p&gt; المجهر الإلكتروني هو أسلوب آخر أن يسمح التصور من الحبوب من الجليكوجين في الخلايا وتقييم درجة تخزين الجليكوجين. في الواقع، الجليكوجين جسيمات β يمكن التعرف عليها بسهولة مع المجهر الإلكتروني والإلكترون حبيبات كثيفة 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

الجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في الحيوانات الفقارية، ويلعب دورا حاسما في التمثيل الغذائي في الجسم كله، وكذلك في عملية الأيض الخلوية. العديد من الطرق للكشف عن الجليكوجين موجودة بالفعل ولكن فقط عدد قليل من الكمية. نحن هنا وصف طريقة استخدام عدة فحص Abcam الجليكوجين، والتي تقوم على تدهور محددة من الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق غلوكوأميلاز. ثم يتأكسد الجلوكوز خصيصا لمنتج أن يتفاعل مع التحقيق OxiRed لإنتاج مضان. المعايرة دقيقة وحساسة ويمكن أن يتحقق على مقتطفات الخلية أو أقسام الأنسجة. ومع ذلك، وعلى النقيض من تقنيات أخرى، فإنه لا يعطي معلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. كمثال على هذه التقنية، وصفنا هنا المعايرة من الجليكوجين في اثنين من خطوط الخلايا والصينية CCL39 الليفية الهامستر الرئة والقولون وسرطان الإنسان LS174، المحتضنة في normoxia (21٪ O 2) مقابل نقص الأكسجة (1٪ O 2). افترضنا أن نقص الأكسجين هو سيجنال التي تعد خلايا لتجميع وتخزين الجليكوجين من أجل البقاء على قيد الحياة 1.

وهناك مستوى منخفض من الأكسجين (نقص الأكسجين) في إشارات إلى الخلايا السرطانية الأورام الحاجة إلى تخزين الطاقة للتعامل مع نضوب المغذيات لاحقة، وذلك من أجل البقاء. والجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في خلايا الثدييات، درسنا تنظيم تخزين الجليكوجين في نقص ا...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.2K Views.  University of Nice - Sophia Antipolis.  نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان. 

Video: Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

معايرة Coronaviruses الإنسان باستخدام الفحص Immunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

الزرد حقن الدماغ البطين

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae حركية النمو الهائل في الثقافة دفعة تحليل الأيض معفن والجهاز التنفسي

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...