Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. إعداد أدوات وحلول العامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل أسماك المياه. جعل حل الأسهم عن طريق إذابة 2 غرام من أملاح البحر &quot;المحيط الفوري&quot; في 50 مل من الماء المقطر. إضافة 1.5 مل من الماء الأسماك الأسهم إلى 1 L الماء المقطر لإعداد جاهزة للاستخدام أسماك المياه (60 ميكروغرام / مل تركيز أملاح البحر النهائي). الأوتوكلاف جاهزة للاستخدام أسماك المياه قبل الاستخدام. يستخدم هذا الحل كما الزرد المتوسطة الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لميثيل الجنين في تصاعد مستمر. حل 1.5 غرام من ميثيل في 50 مل من الماء الأسماك العقيمة. تسهيل حل باستخدام المغناطيس على طبق من ضجة. قد تتطلب حل كاملة من مسحوق عدة ساعات. تحقق من الحل بالنسبة الوضوح وقسامة في أنابيب صغيرة. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر وذوبان الجليد من aliquots في الاستخدام. أجهزة الطرد المركزي في 950 x ج ميثيل في لمدة 5 دقائق قبل استخدام. تجنب تجميد أذاب دورات من مأخوذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50 مل من تريكين / إيثيل 3 أمينوبنزوات مالملح ethanesulphonate (محلول المخزون) عن طريق إذابة 200 ملغ من تريكين في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام تريس، حمض الهيدروكلوريك 1 M (الرقم الهيدروجيني 9). تخزين هذا السهم عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 يوما. تنبيه: تريكين سامة. استخدام فقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الاكسدة في الأجنة الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل أكسدة لعام الحث الاكسدة: جعل 50 مل من محلول أكسدة بإضافة H 2 O 2 حل الأسهم (بيروكسيد الهيدروجين؛ 100 ملم) لأسماك المياه. استخدام H 2 O 2 من تركيز النهائي بين 2 مم و 100 ميكرومتر. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة. الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. لا تقم بتخزين هذا الحل. تنبيه: H 2 O 2 أمر خطير، وضار عن طريق الإستنشاق وإن بلع. اتصال مع المواد القابلة للاحتراق قد يسبب الحريق. التعامل تحت غطاء الدخان وارتداء بيرس المناسبةمعدات الوقاية اونال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل للأكسدة المستمدة من الميتوكوندريا الاكسدة الاستقراء: جعل حل الأسهم أكسدة (5 ملم) عن طريق إذابة 3.9 ملغ من روتينون في 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). إبقاء هذا الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل روتينون محلول المخزون إلى 10 مل من الماء الأسماك لجعل جاهزة للاستخدام الحل. استخدام روتينون بتركيز بين 5-50 ميكرومتر. لا تستخدم روتينون بتركيزات أعلى من 100 ميكرومتر. بتركيزات مناسبة، وهذا الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. تنبيه: روتنون سامة وخطرة. التعامل مع البيانات التحذيرية وفقا المناسبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الاكسدة عن طريق الجينات تدق إلى أسفل: تدق إلى أسفل nrf2a التعبير الجيني في الأجنة الزرد بواسطة morpholino حقن مكروي كما ذكرت سابقا من قبل Timme-Laragy A. وآخرون، 2012 38. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل OXIDاطر النسبية الإجهاد بعد تلف الأنسجة: توليد هامش الجرح في زعنفة الذيل من الأجنة الزرد في 72 HPF كما هو موضح سابقا من قبل Niethammer وآخرون، 2009 39. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 مل من محلول ROS-الكشف عن خلية واحدة طريقة ROS-الكشف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل لعام كشف ROS: ذوب التحقيق الجزيئية ROS-الحساسة عامة في HBSS (محلول الملح المتوازن هانكس و) من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر). يجب أن يكون مستعدا هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل للكشف محددة ROS الناجمة عن الميتوكوندريا: قبل الاستخدام بفترة وجيزة، حل مسبار ROS-الحساسة الميتوكوندريا مع DMSO صنع محلول المخزون 5 ملم. حل حل الأسهم في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (مجموعة تركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر). ملاحظة: تجنب الضوء والأكسجين تعرض حلول العمل ROS-كشف والحلول الأوراق المالية الخاصة بكل منها. حماية أنبوب من الضوء باستخدامورقائق الألومنيوم. لا تخزن أو تحقيقات إعادة استخدام الذائبة في HBSS. تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة شهر. تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية وDMSO تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 مل من محلول ROS-كشف لكامل طريقة جبل ROS-الكشف: ذوبي عام ROS-الحساسة محلول المخزون التحقيق (استقرت في DMSO) في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2.5-5 ميكرومتر). تجنب الضوء والتعرض للاكسجين. حماية أنبوب من الضوء. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام. لا تخزن أو إعادة استخدام هذا الحل. تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 25 مل من وقف الحل بإضافة 10 مل من مصل بقري جنيني إلى 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحفاظ على محلول معقم. تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية. مطلوب هذا الحل الوحيد لخلية واحدة - ROS طريقة الكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حاضنة الهواء الزرد في 28 و# 176؛ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لخلية واحدة طريقة ROS-الكشف. </li></ol> 2. التزاوج من أسماك الكبار واختيار الأجنة الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعبر انشاء الكبار الزوج الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية 40. حدد الخط المعدلة وراثيا المناسبة وفقا للاحتياجات المحددة التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض ووضعها في طبق 90 ملم مع أسماك المياه / الجنين المتوسط. الحفاظ على البيض عند 28 درجة مئوية حتى الأجنة وسوف تتطور وتنمو إلى مرحلة المرجوة التنموية (على سبيل المثال، 48 HPF، 72 HPF؛ HPF: التسميد آخر ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة لتطوير الأجنة. استبعاد كل بويضة غير مخصبة أو الأجنة المتخلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة عن طريق إضافة 1 مل من تريكين (محلول المخزون) في 50 مل من الماء الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد تيراغرام الأجنة الفلورسنت تحت stereomicroscope. </li></ol> 3. معالجة الأجنة مع مؤكسد عامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لا يقل عن 30 الأجنة بين 48 ساعةالجبهة الوطنية و72 HPF في حالة مختلفة. غسل الأجنة مرتين مع المياه العذبة الأسماك من أجل إزالة تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الأجنة الفلورسنت إلى ثلاثة أطباق. وضع ما لا يزيد عن 30 الأجنة / الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الغسيل وإضافة 10 مل من محلول أكسدة أو 10 مل من الماء الأسماك كحل السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة لمدة 10 دقيقة إلى 1 ساعة عند 28 درجة مئوية. فترة الحضانة يعتمد من مستوى الإجهاد التأكسدي للأن يتسبب في أنسجة معينة. فترات قصيرة هي أفضل ما تتأثر الخلايا الاكسدة الخضوع تدريجيا موت الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في طبق جديدة تحتوي على HBSS والأجنة يغسل يحوم. HBSS قبل دافئ عند 28 درجة مئوية. </li></ol> 4. الجامع جبل ROS طريقة الكشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة بعد العلاج أكسدة ووضع ما لا يزيد عن 10 الأجنة في أنبوب صغير. شطف مع HBSS قدر الإمكان. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من محلول ROS-الكشف عنكل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية لتجنب التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة حضانة إعداد شريحة زجاجية لتحليل الجنين كله. وضع 300 ميكرولتر من ميثيل على &quot;الاكتئاب&quot; شريحة زجاجية وانتشاره على سطح الزجاج مع تلميح ماصة. تجنب فقاعات في حين الافراج عن ميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية فترة حضانة، وإزالة فورا الحل ROS-كشف ويغسل مرتين مع 2 مل من HBSS. غسل الأجنة عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. لا ماصة أو الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة نضح يصل الى ماصة باستير الزجاج. الأجنة موقف قرب افتتاح ماصة بلطف وإخراج لهم في ميثيل. توجيه الأجنة بشكل مناسب مع خط النايلون غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة مضان الأجنة التحكم مع الأجنة المعالجة. بدلا من ذلك، وتحديد معالم stereomicroscope مضان أو متحد البؤر المجهر بحيث يتم تصوير جميع الأجنة باستخدام نفسإعدادات التصوير. </li></ol> 5. وحيد الخلية الطريقة ROS-الكشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ من الخطوة: 3.5. تأكد من أن يكون لا يقل عن 35 الأجنة لكل حالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في طبق جديد. إزالة أسماك المياه قدر الإمكان. إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS 1X و 400 ميكرولتر من مثبطات البروتياز كوكتيل. dechorionate يدويا الأجنة مع ملقط وإزالة كيس الصفار مع إبرة رفيعة. ملاحظة: إزالة صفار كيس يضمن عينات نظيفة لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية التالية. ويمكن تجنب هذه الخطوة وفقا لنظام مراقبة الأصول الميدانية الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل-yolked دي الأجنة في 24 لوحة جيدا multiwell (15 / الأجنة أيضا)، وإزالة جميع المياه الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من HBSS، 30 ميكرولتر كولاجيناز P، 50 ميكرولتر التربسين EDTA-في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأجنة بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا مع طرف ماصة ضيق (1،000 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والتجانس العينات بواسطة pipetting كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق disr الأنسجةuption من خلال مراقبة قسامة من جناسة في المجهر المركب. تسهيل تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting. لا احتضان الأجنة لأكثر من 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد الفعل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من وقف الحل. مزيج من قبل pipetting بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق الخلية في أنبوب قبل المبردة مع أسفل ضيقة. الحفاظ على أنبوب على الجليد وتجنب التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المرحلة العليا واعادة تعليق الخلايا مع الجليد الباردة HBSS بواسطة pipetting بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا وتأكد أن لديك نفس العدد من الخلايا في كل من العينات الخاصة بك. لا تستخدم أقل من 2 × 10 6 خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ووقف بيليه مع 1 مل من الجليد برود HBSS تحتوي التحقيق ROS-حساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق في الظلام. تختلف فترة حضانة وفقا لمستوى الاكسدة ولرانه حساسية من التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب FACS. إبقاء الأنابيب على الجليد وتجنب التعرض للضوء قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز الخلايا مع خلية فارز مضان تنشيط (نظام مراقبة الأصول الميدانية). مجموعة موجات وفقا تيراغرام مضان الأنسجة (على سبيل المثال، GFP) وأطياف الإثارة / الانبعاثات من التحقيق الجزيئية المستخدمة للكشف عن ROS (على سبيل المثال، تحقيقات محددة ROS-الحساسة الميتوكوندريا، تحقيقات عامة ROS-الحساسة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حالة، وقياس جميع العينات ضمن نفس الدورة التجريبية خلال تطبيق إعدادات نظام مراقبة الأصول الميدانية نفسها. حساب النسبة المئوية للخلايا الفلورسنت مثل متوسط ​​مكررات البيولوجية المختلفة. تحليل اثنين على الأقل مكررات لكل حالة. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

خطوات حاسمة ويتألف الإجراء للكشف الاكسدة في الأجنة الزرد الموصوفة هنا طريقتين مختلفتين. كلها طريقة التحميل ROS-الكشف هو أساسا فحص النوعية لROS-كشف، في حين يسمح للخلية واحدة طريقة ROS-كشف القياسات الكمية أكثر تحديدا (الشكل 1). ?...

يتم تعريف الاكسدة تحديدا كشرط التي تنتج من الأكسدة الخلوية دولة غير متوازن. في تفاعلات الأكسدة والاختزال التي تحدث بشكل روتيني معقدة داخل الخلايا تحديد للدولة الأكسدة الخلوية. تتكون تفاعلات الأكسدة والاختزال لجميع التفاعلات الكيميائية التي تتكون في نقل الإلكترونات بين الذرات من الجزيئات البيولوجية المنتجة والحد من أكسدة الجزيئات (أي تفاعلات الأكسدة والاختزال). وحفزت هذه التفاعلات حسب الأنواع تفعيلها إلكترونيا (أي الأنواع الموالية للأكسدة)، والتي تتميز عدم الاستقرار الهيكلي المدقع وتفعيل عفوية من الإلكترونات غير متوازن التي تتبادل مع الجزيئات الحيوية المجاورة. ردود الفعل هذه غير منتظمة يؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتين كرسلة، وأكسدة الدهون، ويؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا 1. وقد ارتبطت زيادة مستويات الاكسدة مع الشيخوخة والتقدم من مختلف الحالات المرضية 2. الاكسدة لهاتم الإبلاغ عن أن تكون مسؤولة عن التعديلات الأوعية الدموية في مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية 3،4. إنها تلعب أيضا دورا حاسما في تنكس الخلايا العصبية في مرض الزهايمر ومرض باركنسون 5. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت الاكسدة باعتبارها عاملا حاسما في تطور سرطان تنظم والأحداث النقيلي 6،7. بالإضافة إلى ذلك، قد الالتهاب والاستجابات المناعية انتزاع والإجهاد التأكسدي 8 مزيد من الدعم. في الخلايا الحية، وتستمد الأنواع الموالية للأكسدة من الأكسجين (ROS؛ أنواع الاكسجين التفاعلية) أو النيتروجين (RNS؛ الأنواع النيتروجين التفاعلي). ROS تشمل شق الهيدروكسيل، وأنيون الفائق (OH) (O 2 -)، وبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). وRNS الأساسي هو أكسيد النيتروز (NO). يمكن إنشاء سلسلة من الأنواع رد الفعل الثانوي بحلول التفاعلات عفوية بين:ن ROS وRNS أو المعادن الحرة أيونات 9. على سبيل المثال، وأنيون الفائق يتفاعل مع أكسيد النيتروز لتشكيل peroxynitrate (ONOO -)، في حين H 2 O 2 التفاعل مع الحديد 2 + يولد جذور الهيدروكسيل. ، وذلك بسبب قدرتها على التفاعل مع العديد من الجزيئات الحيوية، تعتبر ROS وRNS تهديدا خطيرا للحفاظ على الدولة الأكسدة الفسيولوجية 10. للحفاظ مجهزة الخلايا الدولة الأكسدة مع سلسلة من الجزيئات إزالة السموم المضادة للأكسدة والانزيمات. وديسموتاز الفائق (الاحمق)، كتالاز، الجلوتاثيون البيروكسيداز وPeroxiredoxins تشكل أساسا مضادة للأكسدة الأنزيمية-الترسانة الخلوية التي توفر الحماية من الأنواع الموالية للأكسدة بما في ذلك H 2 O 2، OH وOONO - 11. أيضا الجزيئات المضادة للأكسدة مثل فيتامين C و E، البوليفينول وCoenzymeQ10 (CoQ10) هي ذات أهمية حاسمة لإرواء ROS وخطيرة رفع أسمائهمrivatives 12،13. ومع ذلك، والإنتاج المفرط للROS وRNS، أو اختلال وظيفي في النظام المضاد للأكسدة، وينقل للدولة الأكسدة الخلوية نحو 14 الاكسدة. إلى جانب دلالة سلبية، ويمكن ROS تلعب مختلف الأدوار الفسيولوجية في خلايا المنشأ مختلفة. الخلايا تنتج عادة ROS كما يشير الجزيئات البيولوجية للتوسط الأحداث العادية مثل دفاع المضيف وإصلاح الجرح 15-17. ويتم إنتاج أنواع رد الفعل عادة في الخلايا عن طريق الانزيمات داخل الخلايا مثل أكاسيد النيتروجين (NADPH أوكسيديز) وXO (Xantine أوكسيديز) استجابة لعوامل إشارة، عوامل النمو، وتقلبات داخل الخلايا لمستويات الكالسيوم 18،19. وقد أفيد أن ROS قد تعدل تفاضلي النشاط من العوامل النووية الهامة مثل البروتين p53 أو المكونات الخلوية مثل ATM-كيناز، وهو المنظم الرئيسي للاستجابة لأضرار الحمض النووي 20. بالقياس ROS تؤثر بشدة الإشارات الخلوية عن طريق التوسط عشره الأكسدة وتثبيط البروتين phosphatases التيروزين (PTPs)، التي أنشئت كما المنظمين الحرجة من نقل الإشارة 21. وعلاوة على ذلك، ومنهجيات البروتين على أساس إثبات أن RNS مسؤولة أيضا عن التعديلات والتغييرات بروتين معين من الإشارات الجزيئية. RNS تتفاعل مع مجموعات ثيول السيستين تعديلها إلى S-nitrothiols (SNO) واثار المسارات الجزيئية يصاحب ذلك مع الحالات المرضية مثل أمراض المناعة الذاتية والتهابات 22،23. منذ تجارب زراعة الخلايا تتكاثر إلا جزئيا في العديد من العوامل التي تعمل في الجسم الحي، هو ذات أهمية كبيرة لإجراء دراسات الأكسدة في النماذج الحيوانية 24،25. لتحقيق هذا، وقد اعتبر الزرد نموذج حيواني الفقاريات مناسبة لدراسة ديناميات الاكسدة 26. الزرد هو نظام النموذج الجديد الذي يمنح العديد من المزايا لدراسة الأحداث الخلوية والجينية خلال الفقاريات ديفelopment والمرض. يمكن أن تتولد مجموعات كبيرة من الأجنة والمتاحة لتلبية الاحتياجات الأسبوعية التجريبية. وعلاوة على ذلك وضوح بصرية غير عادية من الأجنة الزرد، وكذلك صغر حجمها، وتمكن التصوير خلية واحدة وتتبع دينامية في الكائنات كلها 27. في العقد الماضي، تم إنشاء عدد كبير من المسوخ الزرد لنموذج الإنسان الحالات المرضية مثل السرطان والأمراض الوراثية 28-31. الأهم من ذلك، وقد تم إنتاج العديد من خطوط المعدلة وراثيا للسماح فرص واسعة من التلاعب الجيني والبيولوجي 32. على سبيل المثال، تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا الأنسجة محددة بانتظام لفي الدراسات المجراة. هذه السطور التعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة المروج المحدد، توفر القدرة على تحديد الخلايا واحد في الجسم الحي، فضلا عن التركيب التشريحي أنهم يشكلون. وقد استخدمت العديد من الدراسات السمية بالفعل رانه الزرد لتقييم تأثير المواد الكيميائية في الجسم الحي من على التوازن الأكسدة، مما يشير إلى مدى ملاءمة هذا الفقاريات بمثابة نموذج حيواني لمجال اكتشاف الأدوية والاكسدة 33-35. على الرغم من أن قد تم اختبارها بعض تحقيقات الفلورسنت لرصد الاكسدة في اليرقات الزرد 36،37، لا توجد فحوصات أنشئت لكشف وقياس مستويات الاجهاد التأكسدي في الأنسجة والخلايا الحية الزرد. نحن هنا وصف الإجراء لفي الجسم الحي الكمي الاكسدة في الخلايا من الأجنة الزرد الحية. أدوات التصوير، FACS الفرز، تحقيقات الفلورسنت والظروف المؤيدة للأكسدة يتم الجمع بين جميع لتوليد مقايسة بسيطة للكشف وتقدير من الأنواع المؤكسدة في الأجنة والأنسجة الزرد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) قد يسبب تغييرا في دولة الأكسدة الخلوية نحو حالة الاكسدة. يسبب هذا الوضع أكسدة الجزيئات (الدهون والحمض النووي، والبروتين)، ويؤدي إلى موت الخلية. الاكسدة كما يؤثر على تطور العديد من الحالات المرضية مثل مرض السكري، retinopathies، تنكس عصبي، والسرطان. وبالتالي، فمن المهم تحديد الأدوات اللازمة لتحقيق ظروف الإجهاد التأكسدي ليس فقط على مستوى الخلايا واحد ولكن أيضا في سياق الكائنات كلها. هنا، ونحن نعتبر الجنين الزرد باعتبارها مفيدة في نظام الجسم الحي لأداء مثل هذه الدراسات وتقديم بروتوكول لقياس الإجهاد التأكسدي في الجسم الحي. الاستفادة من الفلورسنت تحقيقات ROS وخطوط الفلورسنت المعدلة وراثيا الزرد، ونحن نطور طريقتين مختلفتين لقياس الاكسدة في الجسم الحي: ط) و&quot;الجنين كله طريقة ROS-كشف&quot; لقياس النوعية من الاكسدة والثاني) ل&quot;وحيدة الخلية ROS طريقة الكشف &quot;عن القياسات الكمية من الاكسدة. هنا، علينا أن نظهر مدى فعالية هذه الإجراءات عن طريق زيادة الاكسدة في الأنسجة من قبل وكلاء أكسدة والأساليب الفسيولوجية أو وراثية. هذا البروتوكول هو قابلة للشاشات الوراثية إلى الأمام، وسوف تساعدك العلاقات عنوان السبب والنتيجة من ROS في النماذج الحيوانية من الأمراض المرتبطة الاكسدة مثل الاضطرابات العصبية والسرطان.

من خلال تطبيق الأسلوب هنا وصفها، ويمكن قياس بسهولة وكشف الاكسدة (ومستويات ROS) في الأنسجة الجنينية الزرد. بعد عبور الزرد الكبار، يتم جمع البيض ويسمح لتطوير عند 28 درجة مئوية إلى 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). من أجل حمل الاكسدة، نقترح نهجين مختلفين: 1) معالجة الأجنة مع الكواشف قو...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Views.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Video: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...