We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyRs:+Their+Disposition,+Frequency,+and+Relationships+with+Other+Proteins+of+Calcium+Release+Units.">RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units.</a> Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).</li><li>Radermacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+three-dimensional+reconstruction+of+the+calcium+release+channel/ryanodine+receptor+from+skeletal+muscle.">Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).</li><li>Stewart, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+bias+in+the+refinement+of+structures+derived+from+single+particles.">Noise bias in the refinement of structures derived from single particles.</a> Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).</li><li>Serysheva, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+and+angular+reconstitution+used+to+visualize+the+skeletal+muscle+calcium+release+channel.">Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel.</a> Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+reconstructions+of+the+transferrin-transferrin+receptor+complex+obtained+with+different+specimen+preparation+techniques.">Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques.</a> J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).</li><li>Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+apolipoprotein+serum+amyloid+A+in+solution+forms+a+hexamer+containing+a+central+channel.">Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).</li><li>Amunts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+the+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, e00461 (2013).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).</li><li>Lerch, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+AAV-DJ,+a+retargeted+gene+therapy+vector:+cryo-electron+microscopy+at+4.5+A+resolution.">Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution.</a> Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).</li><li>Govindasamy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+adeno-associated+virus+serotype+5.">Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.</a> J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).</li><li>Ge, P., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-bonding+networks+and+RNA+bases+revealed+by+cryo+electron+microscopy+suggest+a+triggering+mechanism+for+calcium+switches.">Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).</li><li>Clare, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-triggered+conformational+changes+delineate+substrate-binding+and+-folding+mechanics+of+the+GroEL+chaperonin.">ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin.</a> Cell. 149 (1), 113-123 (2012).</li><li>Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+model+of+the+human+26S+proteasome.">Molecular model of the human 26S proteasome.</a> Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Markl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin:+9-A+CryoEM+structure+and+molecular+model+of+the+KLH1+didecamer+reveal+the+interfaces+and+intricate+topology+of+the+160+functional+units.">Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.</a> J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).</li><li>Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+the+'Wild+West'+of+structural+biology.">Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).</li><li>Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).</li><li>DiMattia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+structural+studies+of+adeno-associated+virus+serotype+5.">purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).</li><li>Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+RyR1-FKBP12+interaction.">Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction.</a> J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+electron+crystallography.">Introduction to electron crystallography.</a> Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).</li><li>Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+gaining+insight+into+cellular+processes+by+structural+approaches.">Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+supramolecular+assemblies+by+cryo-electron+tomography.">Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography.</a> Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).</li><li>Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+structure+and+visualization+of+transmembrane+domains+of+the+RyR1+calcium+release+channel+by+cryo-EM.">Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM.</a> Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).</li><li>Sharma, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoelectron+microscopy+and+image+analysis+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor.</a> J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+with+contrast+transfer+function+correction+from+energy-filtered+cryoelectron+micrographs:+procedure+and+application+to+the+70S+Escherichia+coli+ribosome.">Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome.</a> J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).</li><li>Thon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phase contrast electron microscopy. , (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد ساهم TEM تليها SPA العديد من هياكل 3D الجزيئات، تقترب من 2،000 الإدخالات في بنك المعلومات بحلول منتصف عام 2014. وبصفة عامة، لجزيء معين، يتم تحديد هيكل 3D منخفضة الدقة أولا من البيانات NS، الأمر الذي قد يعقبه المرتفع هيكل قرار cryoEM 3D. على النقيض عال من حدود الجزيئية التي تقدمها NS، مما يسهل إعادة الإعمار 3D الأولى، ويتم تكرير في وقت لاحق من قبل cryoEM مع قدرته على رسم خريطة للهيكل الداخلي للجزيء في حالته المائية بالكامل، وإمكانية لتحقيق دقة أعلى من ذلك بكثير. ميزة أخرى لcryoEM هي القضاء على الإجهاد والجفاف التي قد تؤدي إلى انهيار جزيء. وبالإضافة إلى ذلك، هناك إمكانية لحذف الدعم الكربون، الذي يلغي آثار امتصاص السطح ممكن، ويدل على التشكل التي يعتمد جزيء في الحل. تلطيخ البرد سلبي، وهو مزيج من cryoEM وNS، يتيح التباين العالي في HYD بالكاملتصنيف العينة، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى إعادة الإعمار 3D باستخدام SPA، ومع ذلك فقد كان أقل استخداما، مع أقل من 10 إدخالات بنك المعلومات، وذلك جزئيا بسبب وصمة عار في حد ذاته قد تتداخل مع سلامة جزيء 31. اثنين من التقنيات TEM أخرى تفضي إلى إعادة الإعمار 3D هي البلورات الإلكترون 2D والتصوير المقطعي الإلكترون. 2D البلورات الإلكترون يتطلب مستو أو أنبوبي وضوح الشمس. يستخدم حيود الإلكترون الكريستال لإعادة الإعمار 3D مما قد يؤدي إلى قرار الذري 32. في التصوير المقطعي الإلكترون العينات الثابتة المزجج أو تقليديا، يتم تدوير عنصر جزيء أو دون الخلوي داخل TEM لاحق إعادة بناء التصوير المقطعي 33، مع ميزة أن الأجسام المفرد يمكن إعادة بنائها. ولكن في الوقت الحاضر هذه التقنية لديها الحد قرار تتراوح 40-20 Å 34،35. بين كل هذه التقنيات الجزيئية TEM، كان SPA من NS وcryoEM البيانات الأكثر على نطاق واسعالمستخدمة. وتكرس بروتوكول يتضح هنا للحصول على صور cryoEM مناسبة لتحليل SPA. مع ذلك معظم بروتوكول ينطبق على cryoEM من 2D البلورات وعينات تصوير الشعاعي الطبقي أيضا. جلسة cryoEM الناجحة تعتمد على نجاح الجمع بين العديد من الخطوات الحاسمة. جوانب مهمة أن نأخذ في الاعتبار، شرح التحف cryoEM المشترك وكيفية تجنب وصفها لهم في الفقرات التالية. يصف هذا القسم أيضا مبادئ توجيهية جمع البيانات للحصول على جودة عالية 3D اعادة البناء باستخدام طريقة SPA. تجنب التحول إلى البلورية الجليد. وهناك جانب المركزي هو أن عينة تحتاج إلى البقاء في ولاية زجاجي من لحظة في جميع أنحاء الملاحظة TEM-تغرق البرد. وهكذا بعد تغرق العينة في الإيثان السائل يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) أو الهليوم السائل (-269 درجة مئوية) درجات الحرارة. ارتفاع درجات الحرارة إلى أعلى -135 ° C يحول الماء الزجاجي فيعلى المياه البلورية. ثم إعادة ترتيب الجزيئات قد يستغرق مكان وبلورات الماء تهيمن على صورة (الشكل 3A)؛ يجب التخلص من العينة. عرضي عينة الاحماء يمكن أن يحدث إذا البرد تغرق، ونقل الشبكة المجمدة بين حاويات (حتى لو كان يحميها gridbox)، و / أو البرد حامل الإدراج في TEM بطيئة جدا، أو إذا كانت ملاقط معالجة ما قبل كاف تبريد. هام تدهور فراغ في TEM على البرد نقل (العينة الفخاخ الباردة أكثر دفئا الهواء الداخل) قد يصبح دافئا أيضا العينة. وأخيرا، والإفراط في التشعيع من العينة يمكن أن يؤدي أيضا إلى الانتقال إلى البلورية الجليد. تقليل التلوث الجليد. ونظرا لحجم العينة صغير (3-5 ميكرولتر) تطبق على الشبكة TEM، قد تبخر التركيز مكونات عازلة (الملح والمنظفات الصناعية)، وبالتالي يؤثر على سلامة الجزيئات بما في ذلك فقدان الدولة multimeric. ارتفاع نسبة الرطوبة النسبية (RH) المكروية أو غرفة تحايلالصورة هذه المشكلة. بدلا من ذلك البرد تغرق يمكن القيام به في غرفة باردة البيئية التهوية بما فيه الكفاية. بعد تغرق البرد RH يجب أن تكون في أدنى مستوى ممكن لمنع التلوث الجليد، أو التكثيف من الرطوبة المحيطة على البرد الشبكة، مثل البرد الشبكة نفسها بمثابة فخ بارد. يتكون الجليد تلوث الجسيمات مع التباين العالي وليس طيدة مع أحجام تتراوح ما بين 5 ~ نانومتر، وعدة ميكرون التي تتداخل مع أو حتى منع تماما الصورة. تجنب مسودات الهواء، والحديث / التنفس نحو الشبكة البرد أثناء نقل الهواء، والحد المحيطة RH. وينبغي أيضا تجاهل مفتوحة حاويات النيتروجين السائل مع الماء المكثف (مرئية كما الجسيمات العالقة البيضاء). تعظيم التوجهات الجزيئات / وجهات النظر. للحصول على الدعم العينة، وهو خيار أن يكون جعلت هو بين شبكات هولي الحقيقية والكربون رقيقة على شبكات هولي. هذا يعتمد على (ط) كيف تنتشر العينة على فيلم الكربون مقابل الثقوب الكربون، (ب) عينة المتاحة بغية دراسته واقرارهntration، والثقوب العارية قد تتطلب تركيز 100X أعلى من الدعم الكربون لكثافة الجسيمات مماثلة على الصورة (من ~ ،02-2 ميكرومتر)، و (ج) كيف عشوائي هو توزيع التوجهات جزيء. لاحظ أن التفريغ توهج، مما يجعل محبة للماء الكربون، سيكون لها أثر هام في جميع الجوانب الثلاثة وأن هذا سيكون عينة التي تعتمد على. وفيما يتعلق التوجه للجزيء، في حين أن عرض المتكرر أمر مرغوب فيه لتحديد الهيكلي الأولي من إعادة الإعمار المخروطية عشوائي، عشوائية في وجهات النظر الجزيئات أمر مرغوب فيه عند تنقيح إعادة الإعمار 3D إلى دقة أعلى. في مثالنا، يتفاعل RyR1 مع الكربون بهدف المفضل &quot;أربعة أضعاف&quot; (الشكل 2D) ويتطلب شبكات هولي لالعشوائية من التوجهات ودقة أعلى 36. تعظيم SNR. إن أفضل استراتيجية لزيادة SNR هو الحد من مصادر خلفية من الضوضاء. الجليد المفرطسمك و(إذا كان موجودا) سمك الفيلم الكربون يتجاوز ما هو مطلوب لدعم وترسيخ والبروتين إضافة الضوضاء إضافية. وهكذا ينبغي خفض سماكة الجليد لأدنى حد الضرورة عن طريق التحكم النشاف الوقت، الضغط، RH، ونوعية ورق الترشيح. للحصول على الدعم الكربون، والطبقات رقيقة (~ 5 نانومتر) فيلم الكربون على الفيلم سمكا الكربون هولي: يوفر الكربون هولي سميكة مقاومة ميكانيكية بينما يتم تصوير العينة على حفرة مغطاة الكربون رقيقة. من ناحية أخرى، لاحظ أن الجليد رقيقة للغاية و / أو قد ينتج الكربون في دعم كسر بسهولة يمكن أن تتحول إلى شبكة الإنترنت (الشكل 3D). لتعظيم SNR، وينبغي تجنب أي مكون من مكونات عازلة غير الضرورية. للبروتينات الغشاء، المنظفات يأخذ عدد كبير على النقيض من ذلك (انظر الشكل 2D، اللوحة اليمنى). وبالإضافة إلى ذلك عن طريق تقليل التوتر السطحي المنظفات يغير الطريقة التي تنتشر العينة على الدعم. بعض البروتينات الغشاء تتطلب وجود الدهون بالإضافة إلى ديتergent، مما يقلل كذلك التباين. للتغلب على هذه العينة يمكن أن تضعف في منطقة عازلة مع انخفاض تركيز المنظفات وبدون دهن قبل البرد تغرق 37. تظهر المنظفات البديلة الجديدة 16 واستخدام nanodisks 38 لتحقيق الاستقرار في مكون مجال الغشاء أن يكون النهج الناجحة للبروتينات غشاء التصوير من قبل cryoEM. السعي لصور ذات جودة عالية والاستعداد لتصحيح CTF. عينات المزجج تتطلب القيم يزيل التباؤر عالية لتوليد صورة كافية (المرحلة) على النقيض حيث CTF، وظيفة التي تتعلق كثافة لتردد، لديها العديد من الصفر التحولات، وعند هذه النقطة لا يوجد المعلومات. في حين تصحيح CTF ليس من الضروري لإعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة، عندما تهدف لدقة أعلى، لاسترداد تمثيل دقيق للكائن 3D، الصور مع defoci مختلفة تحتاج إلى جمعها بحيث يمكن أن يتم تصحيح تمويل الإرهاب الحسابية.يتم تضمين تقرير CTF والتصحيح في حزم البرمجيات SPA الرئيسية 4-7. تفاصيل يمكن العثور في أماكن أخرى 39. لتصحيح CTF الأمثل، واستخدام مجموعة من defoci. استراتيجية جيدة لبالتناوب بين 3-4 القيم يزيل التباؤر. قيم تعتمد على حجم جزيء (أحجام أكبر تتطلب كميات أقل من يزيل التباؤر)، وسمك الجليد / الكربون (يتطلب عينة أرق أقل يزيل التباؤر)، والجهد (انخفاض الجهد يتطلب أقل يزيل التباؤر). 200 كيلو فولت، مجموعة بداية جيدة من القيم هو 2.5 و 3 و 3.5 و 4 ميكرون يزيل التباؤر. وCTF يظهر كما بالتناوب حلقات من كثافة عالية ومنخفضة (ثون يرن 40) في تمثيل الفضاء المتبادل، طيف الطاقة. عرض طيف الطاقة سوف تكشف عن إمكانية حلها؛ تردد أوسع حلقة ثون مرئية هو الأقرب تقدير مسبق للقرار يمكن بلوغه. يجب فحص طيف الطاقة بشكل دوري، واللابؤرية (غير التعميم) حلقات ثون (الشكل 3C) ينبغي تصحيحه مع stigmator الهدف. وينبغي أن تكون حلقات ثون مرئية على الأقل حتى القرار المطلوب. وهناك مجموعة البيانات cryoEM تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول يمكن معالجتها مباشرة من قبل SPA من أجل توليد إعادة الإعمار 3D. حتى مع وجود عينة مثالية، فإن نوعية إعادة الإعمار 3D تعتمد على الأداء ومواصفات المعدات TEM، وعلى معالجة الصور. مع استمرار التحسن في كل من هذه الجبهات، ومع إشارة خاصة إلى كشف الإلكترون مباشرة وضعت مؤخرا، وإمكانية الحصول على اعادة البناء 3D في قرار الذري أكثر اتساقا هو أقرب مما كانت عليه في أي وقت مضى.

هدف cryoEM هو الحصول على الإلكترون صور مجهرية من الجزيئات في ولاية المائية الأصلية الخاصة بهم. بحكم تضمين جزيء في الماء المزجج، عينة المجمدة-المائية يمكن إدخالها مباشرة وتصور في الصك TEM. التزجيج، من خلال تجميد فلاش (10،000 س C / ثانية) التي تحققت، يتجمد العينة دون تبلور الماء ويضمن إعادة ترتيب الجزيئية خلال تجميد ضئيلة. فائض نثر الإلكترون من العينة فيما يتعلق عازلة المحيطة يضفي تباين صغيرة ولكنها كافية لرؤية جزيء في غياب أي وصمة عار 1. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور محوسب استخدامها لإعادة جزيء في هيكل 3D. الجزيئات الكبيرة في نطاق ~ 500 kDa- متعددة نجمة داود الحمراء هي عينات مثالية لcryoEM (تمثل أكثر من 80٪ من الضفة المجهر الإلكتروني البيانات (بنك المعلومات) إدخالات)؛ وتشمل هذه البروتينات والمجمعات البروتين، البروتين النووي حمض جomplexes، وبروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية. وهذه الجزيئات أقل عرضة للتبلور (مع إدخالات أقل من 2٪ في قاعدة البيانات PDB) ومع ذلك هو الحال في كثير من الأحيان أن أجزاء أصغر حلها عن طريق البلورات بالأشعة السينية أو NMR يمكن رست في المغلف 3D التي أنشأتها cryoEM. من ناحية أخرى، فإن بعض من أكبر الهياكل حلها عن طريق cryoEM هي التعرف داخل الخلية الكاملة رقيقة المقطع TEM 2. وهكذا، cryoEM الجسور فعال الفجوة حجم والقرار بين الهياكل التحت خلوية وذرية. CryoEM يعكس أفضل هيكل الأصلي للجزيء لمن طريقة أكثر كلاسيكية من تلطيخ السلبية (NS)، حيث جزيء هو المجففة وتحيط به طبقة من وصمة عار المعادن الثقيلة حيث المنطقة من وصمة عار الإقصاء يخلق يتناقض بشدة &quot;سلبية&quot; صورة 3. في كلتا الحالتين ينتج شعاع الالكترون 2D صور الإسقاط من الجزيئات تسمى الجزيئات، حيث قHAPE يعتمد على التوجه للجزيء فيما يتعلق شعاع الالكترون. العديد من الجسيمات، على الأقل ~ 1،000 وبدون حد أقصى، يمكن تحليلها على الكمبيوتر مع &quot;تحليل واحد الجسيمات&quot; (SPA) برنامج لزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) على الرغم من المتوسط، وإيجاد المعلمات الجسيمات التوجه المكاني هناك حاجة لإعادة هيكل 3D على جزيء من قبل الظهر 4-7 الإسقاط. NS، مع ارتفاع SNR، ويستخدم لعينة التوصيف الأولي وتوليد دي نوفو إعادة الإعمار 3D. قرارها نادرا ما يتجاوز 20 Å، التي تفرضها الجفاف وحجم الحبوب والمعادن الثقيلة. بشكل عام، من أجل تقرير الهيكلي cryoEM 3D، ويتم الحصول على إعادة الإعمار 3D منخفضة الدقة أول من NS ثم يستخدم cryoEM لصقل هذه منخفضة الدقة خريطة أولية لمواصلة دراسة جزيء في حالته المائية الأم، لنرى هيكلها الداخلي، وزيادة قرارها. لاالشركة المصرية للاتصالات أنه إذا تم تشويه نموذج NS (على سبيل المثال الأكثر شيوعا هو تسطيح الناجمة عن الجفاف 8)، وكان للجسيمات cryoEM SNR منخفضة، ثم تشويه يمكن أن تحمل في نموذج cryoEM (القطع الأثرية نموذج التحيز، وهو أمر شائع في البلدان المنخفضة SNR مجموعات البيانات 9). أن التشوه الهيكلي تؤدي إلى عدم تطابق بين NS وcryoEM الجسيمات الأولية وبين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المقابلة من نموذج 3D متعامد على اتجاه التسوية. قد نموذج التحيز حل في حد ذاته كما يخضع نموذج 3D دورات الصقل المتعاقبة. يجب أن لا تحدث، والتي سيتم الكشف عن عدم وجود مراسلات بين الجسيمات cryoEM الخام والتوقعات المناظرة من نموذج 3D، ثم يجب أن تبنى نموذج دي نوفو من البيانات cryoEM. وثمة نهج جيد يمكن أن يكون لاستخدام خوارزمية إعادة الزاوي 10، والتي قد تسفر عن عدة مجلدات 3D ممكن، ومن ثم استخدام نموذج NS 3D لتحديد أفضل نموذج ممكن cryoEMالتي ستكون مزيد من الصقل 11. استراتيجية أفضل هو زيادة SNR من مجموعة البيانات cryoEM (انظر قسم مخصص في مناقشة). جودة البيوكيميائية للجزيء النقى لها تأثير أقصى في النتيجة النهائية. وجزيء، تنقيته من الأنسجة أو المعبر عنها في أنظمة مغاير، تحتاج إلى وجود درجة عالية من النقاء وأن تكون سليمة من الناحية الهيكلية. لا ينبغي أن تشكيل المجاميع ولا ينبغي أن تفصيل. لتحديد التشكل معين، ينبغي للظروف التحضير تعزيز دولة بتكوين موحدة. لدراسة المجمعات، فمن الأمثل أن لهم ك D هو في حدود نانومتر، وقد استخدمت على خلاف ذلك مثبتات بنجاح لتحقيق الاستقرار في أقل التفاعلات تقارب 12،13. الصور cryoEM غير المجهزة تعطي معلومات قيمة عن أبعاد، المخطط العام، وحالة التجميع / multimerization، والتجانس، والبنية الداخلية للmacromolecuجنيه. ومع ذلك ومما يعزز من إمكانات تقنية إلى حد كبير مع معالجة الصور. هيكل يكشف 3D الهندسة المعمارية الشاملة للجزيء، وموقع 3D من بروابط ومفارز، والتغيرات متعلق بتكوين، وتمكن لرسو السفن هياكل ذرية تحددها البلورات بالأشعة السينية أو NMR. كمية المعلومات لإعادة الإعمار 3D يزيد تدريجي كما القرار هو زيادة: في العام 15-20 قرار Å يسمح لرسو السفن لا لبس فيه هياكل ذرية، في 9-10 اللوالب Å ألفا هي مرئية كما قضبان، في 5 Å فمن الممكن أن نستشف أوراق بيتا، وعلى قرارات 3.5 Å وأفضل أنه من الممكن بناء النموذج الذري 14. إمكانية الحصول على صور بالمعلومات وإعادة الإعمار 3D باستخدام SPA من كميات صغيرة نسبيا من عينة جعل cryoEM تقنية جذابة، كما 3-5 ميكرولتر من 0.05 على الأقل ملغ / مل تكفي لإعداد شبكة واحدة TEM. متطلبات الحد الأدنى مفيدةلcryoEM هي البرد الغطاس محلية الصنع أو التجارية، ومجهر الكتروني مع فراغ عالية جدا، ووسائل الإعلام تسجيل صورة وعدة جرعة منخفضة، والبرد حامل مع محطة الضخ لديها، وهو جهاز التفريغ توهج، والمبخر. الميزات غير الضرورية ولكن أبعد من المرغوب فيه على TEM هي كاميرا CCD (موجودة في جميع الحقوق الحديثة) أو كاشف الإلكترون المباشر، بندقية الانبعاثات الميدان (FEG)، والترشيح الطاقة، والإنتاجية العالية البرمجيات جمع البيانات. هذا البرنامج من حيث المبدأ تمكن جمع عشرات الآلاف من الجزيئات في جلسة واحدة cryoEM 15، ولكن زيادة احتياجات تخزين البيانات واللاحقة تحت إشراف تحتاج إلى وقت ما بعد المعالجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار. FEG جنبا إلى جنب مع وظيفة نقل النقيض (CTF) تصحيح يكمن وراء معظم عمليات إعادة البناء 3D التي وصلت إلى قرار كاف لتصور اللوالب ألفا. في تلك المرحلة، ومستوى القرار هو أيضا عينة التي تعتمد على: بلغت 10 قرار Å هو أقل شيوعا للبروتينات الغشاء في حين إذاترتيب عال من التماثل موجود ثم قرار الذري هو أكثر تحقيقه. وقد مكنت التطورات الأخيرة في كشف الإلكترون مباشرة قرار الذري حتى بالنسبة الجزيئات مع انخفاض (4X) أو أي التماثل، حيث جودة cryoEM خرائط كثافة الإلكترونات مباريات هذه مستمدة من بيانات حيود الأشعة السينية 16،17. وتقدم أمثلة عملية توضح قدرات تقنية هنا لمدة أربع أنواع من الجزيئات الهامة حيث يوجد cryoEM كبير دورا مستمرا في تقرير الهيكلي. (ط) مع التماثل icosahedral في أن يزيد من مجموعة البيانات بنسبة 60 أضعاف وحجم كبير في أن يسمح المؤمنين والمواءمة استنساخه، قد تم حلها هياكل عدة فيروسات icosahedral بقرار شبه الذرية التي كتبها cryoEM تليها SPA 18. وتبين لنا مثالا على فئة من الفيروسات icosahedral، والفيروسات الغدة المرتبطة (AAVs)، والتي هياكل شبه الذرية التي كتبها cryoEM وcryoEM HY / الأشعة السينيةطرق brid توجد 19،20. (ب) تشمل الجزيئات مع بنية حلزونية الأنابيب الدقيقة، خيوط والفيروسات. الوحدات المتكررة على طول محور حلزونية يمكن تحليلها بواسطة إصدار أكثر تعقيدا من SPA تكييفها وفقا لهندسة حلزونية 21. في المثال نظهر فيروس تبرقش التبغ (TMV)، وفيروس RNA التي تم حلها بقرار النووي بحلول cryoEM 22. (ج) وقد درس البروتينات القابلة للذوبان كبيرة بما فيه الكفاية. ومن بين هذه الجزيئات تشكيل اسطوانات multimeric متناظرة تشكل بنية المتكررة في كثير من الأحيان حلها في قرار subnanometer 23،24. هنا نعرض صور KLH، حاملة الأكسجين رخو، حيث تم إنشاء نموذج الجزيئي الهجين من cryoEM / الأشعة السينية طرق البلورات الهجين 25. (د) بروتينات الغشاء هي فئة هامة من البروتينات. أنها تشكل حوالي 1/3 من البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري، ولكنها من الصعب تميز هيكليا بسبب التعقيدات المرتبطة TRاستقرار نطاق ansmembrane 26، التي تشكل أقل من 1.5٪ من الهياكل حلها عن طريق أي تقنية الهيكلية مجتمعة. ويتمثل دور cryoEM و 3D إعادة الإعمار في تقرير الهيكلي مع مستقبلات ryanodine (RYR)، وهي كبيرة حقيقية النواة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ قناة مهمة في تقلص العضلات وإشارات الدماغ. أعلى الهياكل قرار cryoEM حتى الآن، مع 10 قرار Å، تكشف عن هيكل الثانوي 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

تنفيذ دقيق لجميع الخطوات بروتوكول المبينة في الشكل 1 يمكن تصور المجمدة رطب، الجزيئات غير الملطخة. وأظهرت نتائج أربع عينات تمثيلية ذات الخصائص الهيكلية المختلفة. تتم مقارنة الصور المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق أساليب NS وcryoEM (الشكل 2). الصور (ط) NS من AAV5 تكشف جزيئات الفيروسات مثل من نحو 130 Å القطر. التعايش بين الهياكل الكاملة وفارغة يتوافق مع كسر (أي السماح بدخول صمة عار) وcapsids سليمة من الناحية الهيكلية، على التوالي. CryoEM معارض هياكل فارغة بشكل موحد. في الواقع هذه الجسيمات الفيروسية لا تحتوي على مادة وراثية 28. NS معارض الجسيمات جولة السائدة في حين cryoEM معارض جزيئات معظمها سداسية، مما يعكس شكل icosahedral بهم. (ب) صور من المعرض TMV قضبان حلزونية من قطر 180 ألف وطول متغير، وغالبا ما يعد من 0.1 ميكرون، مع تكرار حلزونية من 23 Å مرئية على حد سواءفي NS وcryoEM. يتم تعبئة القناة المركزية 40 Å مع وصمة عار في الصور NS وفارغة في الصور cryoEM. (ج) الأصلية KLH، وهو didecamer من 8 نجمة داود الحمراء، يجمع في براميل المميزة لقطر Å 350 و 400 طول Å. NS وcryoEM تكشف في وجهات النظر KLH الجانب مستطيلة ودائرية نهاية في وجهات النظر. كلا تقنيات تكشف ستة التصدعات عمودي على محور التناظر والوحدات الصرفية متباعدة بالتساوي داخل كل الطبقة. CryoEM يكشف عن البنية الداخلية فارغة. (د) مستقبلات Ryanodine، قناة داخل الخلايا رباعي القسيمات كبيرة من 2.26 نجمة داود الحمراء، وينظر إليه على أنه مربع من 275 X 275 Å 2. السمات السطحية المعقدة مثل الصليب مركزي والاكتئاب المركزي واضح كما تراكم وصمة عار كتبها NS، وكما أقل المناطق كثافة من قبل cryoEM. في حين يظهر NS النقيض مماثلة في جميع العينات الأربع اختبارها، والمقارنة بين فريقي cryoEM تعرض السفلي SNR (النقيض) من RyR1 بسبب وجود المنظفات لذوبان هذا البروتين الغشاء. وتظهر أمثلة نموذجية من التحف cryoEM لRyR1: الجليد البلورية، وتلوث الجليد، الاستجماتيزم، وهياكل تشبه شبكة الإنترنت (الشكل 3). ويرد تبيان أسبابها والوقاية في قسم المناقشة. SPA و 3D إعادة إعمار المجمدة-رطب RyR1 يكشف هيكل متماثل أربعة أضعاف، والذي يعكس تنظيم homotetrameric البروتين (الشكل 4A). يشكل المجال حشوية المنشور مربع من 275 X 275 × 120 Å 3 ويحتوي على العديد من المجالات كروي استنساخه تشكيل بنية تشبه سقالة. يشكل المجال عبر الغشاء المنشور مربع مدبب أصغر مع أقصى قدر من الأبعاد 115 × 115 × 60 Å 3. وفي 10 قرار Å أنه من الممكن تصور اللوالب ألفا (الشكل 4B). رسم الخرائط الفرق 3D يمكن أن تكشف عن موقف بروابط مهمة، في هذه الحالة خريطة 3D اختلاف FKBP12، وهو conside 12 بروتين دينار كويتيالحمراء حدة فرعية من RyR1، وفرضه على RyR1 (الشكل 4C) 29. وأخيرا، توفر التغييرات متعلق بتكوين وجهة نظر الديناميكي للجزيء. في هذه الحالة RyR1 استقرت سابقا في ظروف إما مغلقة أو مفتوحة يكشف عن النبات الشامل من مغلقة إلى حالة فتح (الشكل 4D) 27. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط تدفق تقنية المجهر البرد الإلكترون. ويبرز الرسم البياني الخطوات الرئيسية للبروتوكول. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> الشكل 2. مقارنة بين NS وcryoEM لمجموعة متنوعة من العينات. (A) AAV5، وهو فيروس icosahedral. (B) TMV، فيروس حلزونية. وتبين إدراجات تكرار حلزونية، من 23 Å. (C) الأصلية KLH(D) RyR1. ويسلط الضوء على وجهات نظر التمثيلية (و، عرض والصورة على اربعة اضعاف عرض الجانب). يتم تصوير جميع العينات في ظل ظروف جرعة منخفضة وفي نفس التكبير من 50،000X وتحت الجهد تسريع 200 كيلو فولت. على نطاق والحانات، و 10 نانومتر. جميع العينات NS هي على دعم الكربون، وعينات cryoEM A، C، D هي على الكربون رقيقة على quantifoil، وعينة cryoEM B هو مباشرة عبر الثقوب quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> الشكل 3. معرض الصور تظهر التحف cryoEM المشتركة على عينة RyR1 cryoEM. (A) بلوري الجليد. التلوث (B) الثلج (السهام). (C) الاستجماتيزم. RyR1s في الصورة اللابؤرية هي بالكاد مرئية. وأقحم على اليمين يظهر SPECT السلطةالروم من الصورة مع حلقات ثون غير المتماثلة. وأقحم على اليسار يظهر طيف الطاقة من صورة غير اللابؤرية كمرجع. (D) هياكل شبيهة الويب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> الرقم 4. CryoEM و 3D إعادة بناء مستقبلات ryanodine. . (A) تمثيل Isosurface (B) الإرساء هيكل الكريستال من RyR1 في N-30 محطة يظهر اتفاق جيد بين إحداثيات الذرية والمغلف cryoEM. وتشير الأسهم لاثنين من اللوالب ألفا التي تبرز من هيكل. رأس السهم يشير إلى واحدة من اللوالب الأربعة التي تحيط المسام للقناة أيون. الخطوط المنقطة تشير إلى حدود الغشاء. (C) RyR1 و 3D لوالموجبة ليجند FKBP12 (اللون البرتقالي). (D) التغييرات متعلق بتكوين لRyR1 في الانتقال من مغلق (البرتقالي) لالمفتوحة (أسود شبكة) التشكل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction at JoVE.com

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

do-s-don-ts-cryo-electron-microscopy-primer-on-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.8K Views.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

التشخيص والتشريح والأنسجة عينة مختارة كوكتيل في الجرذان والفئران

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.