We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-tutucu Hazırlama ve Bakım NOT: Kuru pompa istasyonu, turbo pompa istasyonu ve bir veya daha fazla soğuk sahne kontrolörleri oluşan, öncelikle üç amaçlar için kullanılır: a) kullanılmadıkları zaman cryo sahipleri saklamak için güvenli bir yerdir. sahipleri saklamak için doğru yolu vakum altında istasyonunda onları terk etmektir. b) Sıvı azot Dewar ve maruz kriyo tutucunun ucundan kaldırıldığında oluşan don ve nem oluşumunu buharlaştırılması için; Bu ısınma döngüsü ile elde edilir. c) zeolit ​​kurutucu yeniden oluşturmak için ve cryoholder Dewars yüksek vakum elde etmek. Bu kriyo elektron mikroskopisi yaparken bir sabit sıcaklık tutulması için gereklidir. <ol><li> Isınma Döngüsü. <ol><li> Pompalama istasyonu pompa limanlarından birine cryo tutucu yerleştirin. Sahibinin vakum valfi altında metal çıkışına tahliye tüplerden birini bağla. Yapmakistasyon (V1, V2, V3 ve) ve cryo tutucu tüm vanalar kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi açın ve kontrol kablosu aracılığıyla sahibine bağlayın. Turbo pompa istasyonu güç anahtarını açın. </li><li> Soğuk sahne denetleyicisi Isınma döngü seçeneği başlatın. Turbo pompa istasyonu vakum 10 -3 Torr&#39;a veya daha okuduğunda, kelebek vana V2 açmak vakum stabilize kadar bekleyin ve ardından kelebek vana V1 açın. </li><li> Tutucu sıcaklık 20 ° C&#39;nin üzerinde stabil olana kadar yaklaşık 30 dakika ısınma döngüsü çalıştırın. Yakın V1 ve ardından döngüsünü durdurun. </li></ol></li><li> Zeolit ​​döngüsü. 4 saat ve O Arasında Zeolit ​​Döngüsü çalıştırın / N cryoEM Oturum öncesinde ve Hafta kez eğer Değil Kullanımı. <ol><li> Zeolit ​​döngüsü seçeneği başlatın ve 1-2 x 10 -4 Torr aralığında, iyi bir vakum ulaşmak için gerekli zamanı seçin, ve böylece uzun bekleme süresi. Ne zaman vakum 10 ulaşır -3Torr, V3 Dewar tahliye vanasını açın. pompa istasyonu daha sonra sahibine hattı tahliye edecek; Vakum stabilize kadar bekleyin. </li><li> Cryo tutucu vanayı açın. Döngüsü tamamlandığında, onlar açıldı edildiği ters sırayla vanalarını kapatın: vana tutucu, daha sonra V3, V2 ve nihayet V1. Turbo pompa istasyonu ve soğuk sahne denetleyicisi kapatın ve soğuk sahne denetleyicisi ve turbo pompa istasyonundan cryo tutucu ayırın. </li></ol></li></ol> 2. Izgara Hazırlık <ol><li> Temizleme. Not: Ticari Delikli tablosunu kullanarak, bu üretim işleminde kullanılacak olan herhangi bir artık polimerin çıkarılması için, kullanımdan önce bunları temizlemek için tavsiye edilir. Alt yayılmış filtre kağıdı 5 kat, cam bir Petri tabağına yapın. <ol><li> Delikli karbon tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdı üzerinde ızgaraları yerleştirin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, o birkaç damla ile kağıt ıslakızgaraları etrafında f kloroform sadece yüzen başlayana kadar. </li><li> Bir davlumbaz Ç / N biraz açık kapak ile Petri örtün. </li></ol></li><li> NOT: Buz tabakası doğrudan holey karbon ızgara küçük delikler arasında oluşturulabilir ince karbon desteği (2,2-2,3 adımları) ihmal edilebilir. <ol><li> Bir çift cımbız kullanarak, iki yeni yüzeyler ortaya çıkarmak için mika bir parça bölmektedir. Bir Petri kabındaki beyaz bir kâğıt parçası üzerinde mika yüzü yukarı yeni maruz yüzeyleri yerleştirin. </li><li> Bir karbon evaporatör çan kavanoza Petri kabı yerleştirin. Vakum altında 2 x 10 -6 Torr kadar pompa aşağı dizisini başlatın. C çubuk yüzeyi üzerinde herhangi bir istenmeyen maddeyi buharlaştırmak için, kapalı bir Petri kabı ile bir ön-buharlaştırma gerçekleştirin. Sonra çan kavanoz hava ve Petri kabı kapağı çıkarın. </li><li> Vakum karbon ince bir tabaka (~ 5 nm) ile mika 10 -6 Torr ve ceket altına kadar pompa aşağı dizisi gerçekleştirin. Karbon sırasında göz koruması kullanınbuharlaşma. Mika yaprak altına olmuştu kağıt üzerinde ortaya çıkan karanlık karbon film kalınlığını izleyin. </li></ol></li><li> TEM Grid İnce Carbon aktarın. <ol><li> Kaplanmış mika, 0.5 x 1 cm parça kesin ve süzüldü, iyonu giderilmiş su, düz yüzey üzerine karbonun yüzer. Düz bir su yüzeyi elde etmek için optik lens kağıdı kullanın. Cımbız kullanarak, yüzen karbon tabakasının üst yüzeyi ile temas halinde ızgara holey karbon yan koymak ve onu almak. </li><li> Izgaraları yeterli sayıda hazırlanır kadar tekrarlayın 2.3.1 ve 2.3.2 adımları. </li></ol></li><li> Deşarj Glow. NOT: ışıltılı tahliye hidrofil içine ızgaraları doğal hidrofobik karbon kaplama tabakası dönüştürür. Bu adım isteğe bağlıdır. <ol><li> Karbon yan Parafilm ile kaplı 7.5 x 2.5 cm cam slayt yukarı bakacak şekilde yerleştirin ızgaraları. Kızaran deşarj ekipman odasına yerleştirin ve odasına kapatın. </li><li> Pompa25 mA 20 saniye ve 7 x 10 -2 mbar için çan kavanoz ve parlaklık deşarj. NOT: Bir açık mor parlaklık görünür hale bu süre zarfında. Aksi takdirde, onlar kızdırma tekrar taburcu olması gerekir, ızgaraları ile cam slayt çıkarın ve 1 saat içinde bunları kullanmak. </li></ol></li></ol> 3. Numune Dalma-dondurma NOT: Sıvı azot ve etan sıçramalarına karşı korumak için bu aleti kullanırken koruyucu gözlük ve uygun ayakkabı kullanın. <ol><li> Dalma-dondurma aparatı açın. Damıtılmış suyla nemlendirici doldurun. Istenen sıcaklık, bağıl nem ve leke kez dalma koşulları, leke kuvvet ve tutma süresi (22 ° C,% 95, 2 saniye, burada sunulan örnek 2 ve 40 sn). Yeni lekeleme filtre kağıdı yerleştirin. </li><li> Stabilite (yaklaşık 10 dakika) elde edilene kadar sıvı nitrojen ile dış hazne doldurarak etan kap soğutun. Sıvı azot Boilin durduğundag, iç odasında etan tankından gelen tüp ucu yerleştirin ve çok yavaş vanayı açın. Iç hazne içinde etan sıvılaştırılması ve üstten 1 mm kadar doldurun. Etan dondurma kaçının. DİKKAT: etan, son derece yanıcı ve patlayıcıdır. </li><li> Emin cımbız dalma dondurma aygıtı içinde hizalanır olun. </li><li> Nem açın. Cımbız üzerine bir ızgara yerleştirin ve holey ızgara karbon yüzeyine (donuk tarafı) üzerine numunenin 3-5 ul yükleyin. Örnek ızgarasına adsorbe ve ince bir sıvı tabakası elde etmek blot gerçekleştirmek için bekleyin. </li><li> Sıvı etan içine dalan tarafından ızgara Flash dondurma. Sürekli cımbız tutan sıvı etan gelen cımbız-ızgara aksamını çıkarın, ve sıvı azot ile dış odasına transfer. Sıvı azot içinde dalmış küçük ızgara kutusuna ızgara aktarın. Ya depolama tankına transferi sırasında sıvı azot içinde her zaman vitrifiye örnek tutmak emin olunya cryo sahibine. NOT: Izgara kutuları en az 1 yıl süreyle büyük bir kapasite (35-50 L) sıvı azot Dewar saklanabilir. Uygun şekilde saklanması için iki delinmiş üstünde delikler ve termosun ağzından çekilebilir olan kapağa bağlı bir olta bir 50 ml Falcon tüpü içine yerleştirilmiş olabilir. </li></ol> 4. TEM Cryo-grid transfer <ol><li> Cryo transfer istasyonu içine cryo tutucu yerleştirin. Yerleştirilmesi sırasında sahibinin ucu zarar vermemeye özen gösterin. Herhangi bir optik lens kağıdı ile kaldırmak varsa, çubuk ve bir büyüteç kullanarak cryo sahibinin O-ring küçük liflerin varlığı ve toz kontrol edin. </li><li> Cryo sahibinin Dewar ve sıvı azot ile iş istasyonu gemi doldurun. Iş istasyonu ile birlikte geliyor tuzağa huni kullanılarak sıvı azot dökmekten kaçının. </li><li> Sıcaklığını izlemek, ve sıvı azot &amp; # eklemeye devam soğuk sahne denetleyicisi cryo tutucu bağlayın160; sıcaklık yaklaşık -194 ° C&#39;de stabilize kadar. Sıvı azot düzeyi iş istasyonu gemi ve cryo tutucu Dewar hem vakum mühür seviyesinin altında olduğundan emin olun. Izgara cımbız, klip halka ve iş istasyonunda klip halka aracının künt ucunu ön-serin. Ayrıca, büyük cımbız bir dizi ve sıvı azot ile doldurulan bir termosun bir tornavida ön soğutulur. </li><li> Hızla büyük cımbız kullanarak iş istasyonu sıvı azot dondurulmuş hidratlı ızgaraları içeren cryo ızgara kutusunu aktarın. , Tornavida ile cryo grid kutusunu açın dondurulmuş hidratlı ızgara almak ve numune tutucu yuvasına yerleştirin. </li><li> Izgara üstüne klip halka yerleştirin ve sıkıca yerine oturana kadar klip halka aracı künt uçlu basın yavaşça. Cryo-deklanşör kapatın. Iş istasyonundan araçları ve cryo ızgara kutusunu çıkarın. </li><li> Mini amacıyla mikroskop konsoluna tutucu ve ızgara ile tüm iş istasyonu taşıyınoda havasında ızgara transfer süresi rımızı azamiye. </li><li> Önceden doldurulmuş ve en az 20 dakika boyunca soğutulur olan sıvı azot ile TEM anti contaminator kapalı üst. -60 ° mikroskop sahne Ön eğin. Not: tutucu havalandırma süzgeci içine yerleştirildiğinde, bu sıvı azot kaybını en aza indirir. </li><li> Mikroskop öncesi pompa hava kilidi döngüsü başlar. (Bir FEG TEM özellikle varsa) elektron tabancası valf kapalı olduğundan emin olun. Ön-pompa hava kilidi dizisi cryo tutucu takmadan önce (yaklaşık 2 dakika) bitirmek için bekleyin. NOT: Bu aşama sönmüş olan kırmızı ışıkla belirtilir. </li><li> Hava kilidi içine yerleştirilir ve bu 90 ° saat yönünde döndürmek; sıcaklığını izlemek için cryo sahibine soğuk sahne denetleyici kablosunu bağlayın. Kırmızı ışık sönene kadar tekrar bekleyin ve TEM en hi içine tutucu eklemek için sahne ve arka 0 ° pozisyonuna tutucu hem döndürmekgh vakum sütun. </li><li> Sıcaklık asla kristal buz oluşumunu önlemek için -160 ° C&#39;nin üzerine çıkması emin olun. </li><li> Cryo sahibinin Dewar doldurun. Tutucu termal dengeye ve TEM vakum görüntüleri kaydederken önce iyileşene kadar 45 dakika - 15 bekleyin. </li><li> Sıvı azot kabarcıkları tespit edilirse, sıvı azot dolum yüksekliğini değiştirmek, ya da hafifçe bir pamuklu çubukla köpürme kökenli dokunun. </li></ol> 5. Düşük doz Veri Toplama NOT: Düşük doz veri toplama tekniği / Å 2 20 elektronlara miktarının sınırlandırılması ile örnek elektron radyasyon hasarı en aza indirmek için kullanılır. Bu üç yapılandırmaları arasında değişen elde edilir: yüksek büyütme (~ 150,000X) ve bakış küçük alan ve &quot;maruz kalma&quot; ile, düşük büyütme (~ 5,000X) ve görüntüsü, &quot;odak&quot; geniş alanıyla, &quot;arama&quot;, istenen son Magni ileSınıflamasına ve ilgi alanı içeren kaydedilecek. Modları arasında ışın Boş. <ol><li> TEM ve düşük doz Programı Kurma <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. </li><li> Sahne ortala ve 15 ° ± sahne rock alfa wobbler kullanarak eucentric yüksekliği (Z) ayarlayın. Sahne sallanan iken hiçbir kayda değer bir hareket kalmayıncaya kadar Z konumunu ayarlayın. Düşük doz programı etkinleştirin ve her mod için dedektör seçin. </li><li> Pozlama modunda, herhangi bir karbon olan ızgara bir alan bulmak kaydedilecek alanı tamamen aydınlatılmış böylece optimum kondansatör diyafram ve spot boyutu seçerek aydınlatma ayarlayın. Sürkondensasyon yönünde ışını yaymak için emin olun. </li><li> Arama modunda, yüksek büyütmede kolay tanımlanabilir olacak küçük bir özelliği bulmak. Pozlama modunda, joystick (xy sahne denetleyicisi) ile bu özelliği merkezi. Feat eğer düşük büyütme başlayınure görüş alanında değil. </li><li> Arama modunda, düşük doz xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak alanının merkezine bu özelliği getirmek. Pozlama moduna gidin ve kaydedilecek alanı dışında olduğu kadar joystick&#39;i kullanarak eksen eğim boyunca özelliğini taşımak (0,5-3 mikron). Modunu odak gidin ve xy görüntü kaydırma kontrolleri kullanarak özelliğini merkezi. Özellik görüş alanında değilse düşük büyütme başlayın. </li><li> Her zaman merkezli ışın tutun. </li></ol></li><li> Bilgi toplama <ol><li> Cryo-deklanşör çekin ve sütun vanalarını açın. Düşük doz programı etkinleştirin. </li><li> Arama modunda, ince, homojen buz içeren bir ızgara kare tespit. </li><li> Uygun delik seçin ve alanın ortasına yerleştirin. Modunu odak ve görüntü odak geçin. 4.5 mikron - O 0.5 görüntü underfocus. </li><li> Pozlama moduna geçer ve görüntüyü kaydedebilirsiniz. </li><li> 5.2.3-5.2.4 modu arama ve adımları tekrar geçin.Kaçınarak ızgara Meydanın karşısında hareket öncesi açığa iyi delikleri kaydedilecek. </li><li> Izgara kare bitirin ve başka iyi bir hareket. </li><li> Yüksekliği (Z) yeniden ayarlayın ve veri toplama devam ediyor. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RyRs:+Their+Disposition,+Frequency,+and+Relationships+with+Other+Proteins+of+Calcium+Release+Units.">RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units.</a> Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).</li><li>Radermacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+and+three-dimensional+reconstruction+of+the+calcium+release+channel/ryanodine+receptor+from+skeletal+muscle.">Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).</li><li>Stewart, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+bias+in+the+refinement+of+structures+derived+from+single+particles.">Noise bias in the refinement of structures derived from single particles.</a> Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).</li><li>Serysheva, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+and+angular+reconstitution+used+to+visualize+the+skeletal+muscle+calcium+release+channel.">Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel.</a> Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+reconstructions+of+the+transferrin-transferrin+receptor+complex+obtained+with+different+specimen+preparation+techniques.">Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques.</a> J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).</li><li>Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+apolipoprotein+serum+amyloid+A+in+solution+forms+a+hexamer+containing+a+central+channel.">Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).</li><li>Amunts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+yeast+mitochondrial+large+ribosomal+subunit.">Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.</a> Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+the+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: the new Leginon system.</a> J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, e00461 (2013).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).</li><li>Lerch, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+AAV-DJ,+a+retargeted+gene+therapy+vector:+cryo-electron+microscopy+at+4.5+A+resolution.">Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution.</a> Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).</li><li>Govindasamy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+adeno-associated+virus+serotype+5.">Structural insights into adeno-associated virus serotype 5.</a> J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods.">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).</li><li>Ge, P., Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-bonding+networks+and+RNA+bases+revealed+by+cryo+electron+microscopy+suggest+a+triggering+mechanism+for+calcium+switches.">Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).</li><li>Clare, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-triggered+conformational+changes+delineate+substrate-binding+and+-folding+mechanics+of+the+GroEL+chaperonin.">ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin.</a> Cell. 149 (1), 113-123 (2012).</li><li>Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+model+of+the+human+26S+proteasome.">Molecular model of the human 26S proteasome.</a> Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Markl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin:+9-A+CryoEM+structure+and+molecular+model+of+the+KLH1+didecamer+reveal+the+interfaces+and+intricate+topology+of+the+160+functional+units.">Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.</a> J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).</li><li>Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+the+'Wild+West'+of+structural+biology.">Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).</li><li>Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).</li><li>DiMattia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+structural+studies+of+adeno-associated+virus+serotype+5.">purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).</li><li>Samso, M., Shen, X., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+the+RyR1-FKBP12+interaction.">Structural characterization of the RyR1-FKBP12 interaction.</a> J Mol Biol. 356 (4), 917-927 (2006).</li><li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors:+insights+into+disease+mutations.">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+electron+crystallography.">Introduction to electron crystallography.</a> Methods Mol Biol. 955, 1-16 (2013).</li><li>Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+gaining+insight+into+cellular+processes+by+structural+approaches.">Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches.</a> Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+supramolecular+assemblies+by+cryo-electron+tomography.">Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography.</a> Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).</li><li>Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+structure+and+visualization+of+transmembrane+domains+of+the+RyR1+calcium+release+channel+by+cryo-EM.">Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM.</a> Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).</li><li>Sharma, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoelectron+microscopy+and+image+analysis+of+the+cardiac+ryanodine+receptor.">Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor.</a> J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).</li><li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li><li>Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+with+contrast+transfer+function+correction+from+energy-filtered+cryoelectron+micrographs:+procedure+and+application+to+the+70S+Escherichia+coli+ribosome.">Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome.</a> J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).</li><li>Thon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phase contrast electron microscopy. , (1971).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SPA ardından TEM verilen makromolekülü için, düşük çözünürlüklü 3D yapısı ilk daha-yüksek takip edebilir NS verilerden belirlenir, genel olarak orta 2014 yılına EMDB 2.000 girdileri yaklaşıyor, birçok makromoleküler 3D yapılar katkıda bulunmuştur çözünürlüklü cryoEM 3D yapısı. İlk 3 boyutlu rekonstrüksiyon kolaylaştırır NS tarafından sağlanan moleküler sınırları yüksek kontrast, daha sonra onun, tam hidrate durumda makromolekül iç yapısını harita yeteneği, ve çok daha yüksek çözünürlük elde etmek imkanı ile cryoEM rafine edilir. CryoEM diğer bir avantajı, makromolekül çökmesine neden olabilir dehidrasyon stres ortadan kaldırılmasıdır. Buna ek olarak, olası yüzey absorpsiyon etkilerini ortadan kaldırır ve makromolekül çözeltisi içinde benimser yapıyı gösteren karbon desteği, ihmal etmek imkanı vardır. Cryo-negatif boyama, cryoEM ve NS bir arada, tam HYD yüksek kontrast verirörnek puan ve leke kendisi makromolekül 31 bütünlüğüne müdahale edebilir, çünkü aynı zamanda kısmen, 10&#39;dan az EMDB girişleri ile, ancak daha az sıklıkla kullanılır olmuştur, SPA kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon yol açabilir. 3D rekonstrüksiyon elverişli diğer iki TEM teknikleri 2D elektron kristalografisi ve elektron tomografi vardır. 2D elektron kristalografisi, düzlemsel ya da boru şekilli kristal gerektirir; kristalin en elektron kırınımı potansiyel atomik çözünürlükte 32 öncü 3D rekonstrüksiyon için kullanılır. Vitrifiye ya da geleneksel sabit örneklerde elektron tomografisinde, bir makromolekül ya da alt-hücresel bileşeni tek nesnelerin yeniden edilebilir avantajı ile, daha sonra tomografik yeniden 33 için TEM içinde döndürülür; Ancak bugüne kadar bu teknik, 34,35 40-20 arasında değişen bir çözünürlük sınırı vardır. Tüm bu moleküler TEM teknikleri arasında, NS ve cryoEM verileri SPA en yaygın olmuşturkullanılır. Burada gösterilen protokol SPA analizi için uygun cryoEM görüntüleri elde adamıştır; Bununla birlikte protokolünün çok da cryoEM 2D kristaller ve tomografik örnekleri için de geçerlidir. Başarılı bir cryoEM oturumu birçok kritik adımlar kombine başarısına bağlıdır; önemli yönleri, akılda tutmak ortak cryoEM eserler açıklama ve onları aşağıdaki paragraflarda açıklanmıştır önlemek için nasıl. Bu bölümde ayrıca SPA yöntemi kullanarak yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon elde etmek veri toplama kurallarına anlatılmaktadır. Buz kristal geçiş kaçının. Merkezi bir yönü örnek cryo-dalan TEM gözlem boyunca andan itibaren camsı halde kalmak gerekiyor. Bu yüzden, sıvı etan bakımından örnek dalan sonra takip eden tüm adımlar sıvı azot (-196 ° C) ya da sıvı helyum (-269 ° C) sıcaklıklarda gerçekleştirilir. -135 ° C&#39;nin üzerinde ısıtıldıktan vitreus su dönüşümleriKristal su; Daha sonra makromoleküler düzenlenmeleri yer alabilir ve su kristalleri görüntü (Şekil 3A) hakim; Numune atılmalıdır. Taşıma cımbız yeterince öncesi olsaydı Kaza örnek ısınma cryo-dalma, TEM içine (bir gridbox tarafından korunan bile) kaplarda ve / veya cryo tutucu ekleme arasındaki dondurulmuş ızgara transferi çok yavaş ise ne, ya da olabilir soğutulmuştur. Cryo-transferi üzerine TEM belirgin vakum bozulma (soğuk örnek tuzakları sıcak gelen hava) da örnek ısınabilir. Son olarak, aşırı ışınlama numunenin ayrıca buz kristal geçiş neden olabilir. Buz kontaminasyonu en aza indirin. Küçük bir örnek hacmi (3-5 ul) TEM ızgara uygulanan göz önüne alındığında, buharlaşma tampon bileşenleri (tuz, deterjanlar) konsantre ve dolayısıyla multimerik devletin kaybı da dahil olmak üzere makromoleküler bütünlüğünü etkileyebilir. Yüksek bağıl nem (RH) mikro-ortam veya oda circumvents Bu sorun. Alternatif Cryo-dalma yeterince havalandırılmış çevre soğuk odada yapılabilir. Cryo-dalan RH sonra kendisini soğuk bir tuzak olarak görür cryo-grid gibi, buz kontaminasyonu veya krio-ızgara üzerinde ortamdaki nem yoğunlaşmasını önlemek için mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Buz kirlenme yüksek kontrast ve 5 ° arasında nm arasında değişen boyutlarda ve müdahale etmesi ya da hatta tamamen görüntü blok birkaç mikron ile bir alt sahip parçacıklardan oluşmaktadır. Hava transferi sırasında cryo-grid doğru nefes / konuşurken, hava taslaklar kaçının ve ortam RH azaltır. (Beyaz asılı parçacıklar gibi görünür) yoğunlaşmış su ile açın sıvı azot kapları da atılmalıdır. Makromoleküler yönelimler / görüşlerini maksimuma çıkarın. Örnek desteği için, yapılacak bir seçim, gerçek holey ızgaraları ve holey ızgaraları üzerinde ince karbon arasındadır. Bu örnek karbon delikleri karşı karbon filmi yayılır nasıl (i), (ii) kullanılabilir örnek conce bağlıdırntration, çıplak delikleri görüntünün üzerinde benzer bir parçacık yoğunluğu, karbon desteği daha yüksek bir konsantrasyon 100X gerektirebilir (~ 0.02 uM 2), ve (iii) makromolekül yönelimleri dağılımı ne kadar rastgeledir. Karbon hidrofil yapar kızdırma akıntı, Not, her üç açıdan önemli bir etkiye sahip olacaktır ve bu örnek bağımlı olacak. Yüksek çözünürlüklerde 3D rekonstrüksiyon hassaslaştırırken tekrarlayan görünümü rastgele konik yeniden başlangıç ​​yapısal belirlenmesi için arzu edilir ise, makromolekül yönünü ilgili olarak, makromoleküler görüş rastlantısallığı arzu edilir. Bizim örneğimizde, RyR1 bir favori &#39;dört kat&#39; görünümü (Şekil 2B) ile karbon ile etkileşime ve yönelimlerin rastgelelik ve daha yüksek çözünürlükte 36 Delikli ızgaraları gerektirir. SNR. SNR artırmak için en iyi strateji gürültü arka kaynaklarını azaltmak için üst düzeye çıkarın. Aşırı buzkalınlık ve gerekli ötesinde karbon film kalınlığı desteklemek ve protein ekstra gürültü katacak gömmek için (varsa). Böylece buz kalınlığı blot zaman, basınç, RH, ve filtre kağıdı kalitesini kontrol ederek gerekli minimum azaltılmalıdır. Karbon desteği için, ince (~ 5 nm) karbon film kalın holey karbon film üzerinde katmanlı: numune ince karbon kaplı delik üzerinden görüntülü ise kalın holey karbon mekanik direnç sağlar. Öte yandan, son derece ince bir buz not edin ve / veya C-bir ağ (Şekil 3D) dönüşebilir bir kolay kırılan destek neden olabilir. SNR en üst düzeye çıkarmak için, herhangi bir gereksiz tampon bileşenleri kaçınılmalıdır. Membran proteinleri için, deterjan aksine önemli bir otoyol (Şekil 2D, sağ paneli bakınız) alır. Yüzey gerilimini azaltarak ek deterjan örnek desteği yayılır biçimini değiştirir. Bazı membran proteinleri det ek olarak lipid varlığını gerektirirayrıca kontrast azaltır ergent. Bu örnek üstesinden gelmek için, sadece 37 cryo dalan önce düşük deterjan konsantrasyonuna ve lipid olmayan bir tampon içinde seyreltilebilir. Yeni bir alternatif deterjanlar 16 ve transmembran alanı komponentinin stabilizasyonu için nanodisks 38 kullanılması cryoEM da görüntüleme zar proteinleri başarılı yaklaşımlar gibi görünmektedir. Yüksek kaliteli görüntüler için çabala ve CTF düzeltme için hazırlık. Vitrifiye örnekleri hangi orada hiçbir işaret, CTF, frekansa yoğunluğunu ilgilidir fonksiyonu, çeşitli sıfır geçişler vardır kontrast yeterli görüntü (faz) oluşturmak için yüksek bulanıklaştırma değerleri gerektirir bilgi. CTF düzeltme düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon için gerekli olmasa da daha yüksek çözünürlük hedefleyen zaman, 3D nesnenin doğru sunumunu kurtarmak için, farklı defoci ile görüntüleri hesaplama CTF düzeltme yapılabilir ve böylece toplanan gerekir.CTF belirlenmesi ve düzeltilmesi önemli SPA yazılım paketleri 4-7 dahildir; detaylar başka bir yerde 39 bulunabilir. Optimum CTF düzeltme için, defoci bir dizi kullanın. İyi bir strateji 3-4 bulanıklaştırma değerleri arasında dönüşümlü etmektir. değerleri, buz / karbon kalınlığı (ince numune az bulanıklaştırma gerektirir) ve gerilim (voltaj düşük az bulanıklaştırma gerektirir) makromolekül (büyük boyutlarda daha az bulanıklaştırma gerektiren) büyüklüğüne bağlıdır. 200 kV için, değerlerin iyi bir başlangıç ​​aralığı 2.5, 3, 3.5 ve 4 mikron bulanıklaştırma olduğunu. CTF karşılıklı uzay gösterimi, güç spektrumunda (Thon 40 halkaları) yüksek ve düşük yoğunluktaki halkaları alternatif olarak tezahür eder. Çözünürlük potansiyelini ortaya çıkaracaktır güç spektrumunu gösteriliyor; geniş görünür Thon halka sıklığı ulaşılabilir çözünürlük önsel tahmini en yakın. güç spektrumu periyodik olarak kontrol, ve astigmat (dairesel olmayan) Thon halkaları olmalıdır (Şekil 3C) objektif stigmator ile düzeltilmelidir. Thon halkalar en azından istenen çözünürlüğe kadar görünür olmalıdır. Bu protokolü kullanılarak elde edilen bir cryoEM kümesi doğrudan 3D rekonstrüksiyon oluşturmak amacıyla SPA tarafından işlenebilir. Hatta ideal örneği ile, 3D rekonstrüksiyon kalite performansı ve TEM ekipman özelliklerine bağlıdır, ve görüntü işleme olacaktır. Bu iki cephede de, ve son zamanlarda geliştirilen doğrudan elektron dedektörleri ile anılmayı devam iyileştirmeler sayesinde, olasılık daha tutarlı atomik çözünürlükte 3D rekonstrüksiyon elde hiç olmadığı daha yakın için.

cryoEM hedefi kendi ana hidre edilmiş halde makromoleküllerin elektron mikroskopik görüntü elde etmektir. Vitrifiye suda makromolekül gömme sayesinde, bir dondurulmuş sulu örnek doğrudan sokulabilir ve TEM cihazda görselleştirilmiştir. Vitrifikasyon dondurma, flaş (10.000 o C / sn) tarafından elde, su kristalleşme olmadan örnek donuyor ve donma sırasında moleküler düzenlenmeleri önemsiz olmasını sağlar. Çevredeki tampon göre numunenin elektron saçılması aşırı herhangi bir leke 1 yokluğunda makromolekül görmek için küçük ama yeterli kontrast sağlar. Bilgisayarlı görüntü işleme sonra makromoleküle 3D yapısını yeniden oluşturmak için kullanılabilir. ~ 500 kDa- çok MDa aralığında Büyük makromoleküller (Elektron Mikroskobu Bilgi Bankası (EMDB) girişleri over% 80 temsil eden) cryoEM için ideal örnekler vardır; Bu proteinler, protein kompleksleri, protein-nükleik asit, C içeriromplexes ve zar proteinlerinin, bir iki-tabaka içinde gömülü. Bu makromoleküller (PDB veritabanı az% 2 girişleri ile) kristalize olması daha az olasıdır henüz x-ışını kristalografisi veya NMR tarafından çözüldü küçük parçalar cryoEM tarafından oluşturulan 3D zarfın içine yerleştirilmiş olabilir sık ​​sık bir durumdur. Öte yandan, cryoEM çözülmüştür büyük yapıların bazı ince kesitli TEM 2 tam hücre içinde tanımlanabilir. Böylece, cryoEM etkili bir hücre içi ve atomik yapıları arasındaki boyut ve çözünürlük boşluğu kapatıyor. CryoEM leke dışlama bölgesi güçlü bir tezat &quot;negatif&quot; imajını 3 yaratır sayede makromolekül susuz ve ağır metal leke tabakası ile çevrili olan negatif boyanma daha klasik yöntemle (NS), daha iyi makromoleküle doğal yapısını yansıtmaktadır. Her iki durumda da elektron ışını makromoleküllerin 2D projeksiyon görüntüleri denilen parçacıklar, s üretirhape elektron ışını ile ilgili olarak bir makro molekülün yönüne bağlıdır. Birçok parçacıklar, en azından ~ 1.000 ve hiçbir üst sınırı ile, gürültü oranı (SNR) ortalamaya rağmen sinyal artırmak için, ve parçacığın mekansal oryantasyon parametrelerini bulmak için &#39;tek parçacık analizi&#39; (SPA) yazılımı ile bilgisayarda analiz edilebilir arka projeksiyon 4-7 makromoleküle 3D yapısını yeniden gerekiyordu. Yüksek SNR NS, ön örnek karakterizasyonu için kullanılır ve de novo 3D yeniden üretmek üzere programlanabilen; çözünürlüğü nadiren ağır metal tahıl dehidrasyon ve boyutuna göre dayatılan 20 Å aşıyor. Genel olarak, cryoEM 3D yapısal belirlenmesi için, düşük çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyon, ilk NS elde edilir ve daha sonra cryoEM daha da iç yapısını görmek için, onun yerli hidrate durumda makromolekül incelemek için bu düşük çözünürlüklü ilk haritayı rafine için kullanılan ve çözünürlüğü artırmak için. Hayırte ki NS modeli bozuk edildi (en yaygın örneği dehidratasyon 8 kaynaklanan düzleşme) ve cryoEM parçacıklar düşük SNR, daha sonra bozulma, düşük SNR yaygındır cryoEM modeli (model önyargı dışlayıcı, içine taşımak olabilir olsaydı gerçekleştirmede 9). Yapısal bozukluk NS ve cryoEM ham tanecikler arasında ve ham cryoEM parçacıkları ve düzleştirme yönüne dik 3D modeli, karşılık gelen projeksiyonlar arasındaki uyumsuzluk ile sonuçlanacaktır. 3D modeli ardışık arıtma döngülerine maruz gibi model önyargı başına çözebilir. Bu 3D modeli ham cryoEM parçacıklar ve ilgili projeksiyonlar arasındaki yazışma eksikliği olarak tespit edileceği, meydana olmamalı, daha sonra bir de novo modeli cryoEM verilerinden inşa edilmelidir. İyi bir yaklaşım mümkün olan en iyi cryoEM modelini seçmek için birkaç olası 3D hacimleri verebilir açısal sulandırma algoritması 10, kullanımı, ve sonra NS 3D modeli kullanmak için olabilirBu 11 daha rafine olacak. Daha iyi bir strateji (Tartışma adanmış bölümüne bakınız) cryoEM dataset SNR artırmaktır. saflaştırılmış makromolekül biyokimyasal kalitesi nihai sonucu bir derece etkiye sahiptir. Makromolekül, heterolog sistemlerde dokudan arıtılır veya eksprese, yüksek saflık derecesine sahip ve yapısal olarak sağlam olmalıdır. Bu ne agrega oluşturmalıdır ne de parçalamak gerekir. Belirli bir yapıyı tanımlamak için, hazırlama koşulları muntazam bir oluşum durumunu teşvik etmelidir. Kompleksleri incelemek için, başka türlü fiksatif başarılı düşük afiniteli etkileşimler 12,13 stabilize etmek için kullanılmaktadır, bunların Kd nM aralığında olması en iyisidir. İşlenmemiş cryoEM görüntüleri boyutları hakkında değerli bilgiler, genel hatlarıyla, toplama / multimerizasyon, homojenlik durumunu ve macromolecu iç yapısını verimle. Yine tekniğin potansiyel ölçüde görüntü işleme ile geliştirilmiştir. Bir 3D yapı, makromolekül genel mimarisini, ligand ve alt-birimleri, bu şekilsel değişikliklere ve 3D konum ortaya çıkarır ve X-ışını kristalografisi veya NMR yolu ile belirlenen atomik yapılarının yerleştirme sağlar. çözünürlük arttıkça 3D rekonstrüksiyon bilgi miktarı adım adım artar: Genel 15-20 Å çözünürlükte 9-10 Å alfa heliksler de, atom yapıların kesin yerleştirme izin 5 Å azından ayırt etmek mümkün, çubuklar gibi görünür Beta levhalar ve 3.5 Å ve daha iyi çözünürlükte bir atom modeli 14 inşa etmek mümkündür. olasılığı en az 0.05 mg 3-5 ul / mL olarak bir TEM ızgara hazırlamak için yeterli olan, bilgi görüntü ve cryoEM çekici bir teknik bu örnek, nispeten küçük miktarlardaki SPA kullanılarak bir 3D yeniden elde edildi. Minimum gereksinimler enstrümantalcryoEM bir ev yapımı veya ticari kriyo-piston, ultra yüksek vakum, görüntü kayıt ortamı ve düşük doz kiti olarak, pompa istasyonu, bir ışıma boşaltma aygıtı ile bir kriyo-tutucu ve bir buharlaştırıcı ile bir elektron mikroskobu bulunmaktadır. TEM&#39;de zorunlu olmayan ancak daha arzu edilen özellikler (tüm modern dardı mevcut) CCD kamera veya doğrudan elektron dedektörü, alan emisyon tabanca (FEG), enerji filtreleme ve yüksek verimlilik veri toplama yazılımı vardır. Prensip olarak bu yazılım, ancak artan veri depolama ihtiyaçlarını ve sonraki denetimli sonrası işlem süresi ihtiyacı dikkate alınacak, bir tek cryoEM oturumda 15 onlarca parçacıkların binlerce toplama sağlar. Kontrast transfer fonksiyonu (CTF) düzeltme ile birlikte FEG alfa helis görselleştirmek için yeterli çözünürlük ulaştı çoğu 3D rekonstrüksiyon yatmaktadır. Bu noktada, çözünürlük düzeyi de örnek-bağımlı: 10 Å çözüme ulaşma zar proteinleri için daha az yaygın olup olmadığını isesimetri yüksek mertebeden atomik çözünürlük daha ulaşılabilir sonra mevcut. doğrudan elektron dedektörü son gelişmeler cryoEM elektron yoğunluğu haritaları kalitesi, bu X-ışını kırınım verileri 16,17 türetilen uygundur (4x) düşük ya da hiç simetrisi bile moleküller için atomik çözünürlük sağladı. Tekniğin yeteneklerini gösteren Pratik örnekler cryoEM yapısal kararlılık devam eden bir baş rolü vardır makromoleküllerin dört önemli türleri için burada verilmektedir. 60-kat ve sadık ve tekrarlanabilir uyum izin onların büyük boyutuna göre veri kümesi artar kendi ikosahedral simetri ile (i), birkaç ikosahedral virüslerin yapıları SPA 18, ardından cryoEM tarafından yakın atom çözünürlüğe çözüme kavuşturuldu. Bu ikosahedral virüslerinden, adeno-bağlantılı virüsler (AAVler) içindeki bir sınıfın bir örneği göstermektedir olan cryoEM tarafından ve cryoEM / X-ışını hy yakınında atom yapılarıbrid yöntemler 19,20 vardır. (Ii) sarmal yapıya sahip makromoleküller mikrotübüller, filamentler ve virüsleri içermektedir. Sarmal eksen boyunca Onların tekrarlayan birimler sarmal geometri 21 adapte SPA daha karmaşık bir sürümü ile analiz edilebilir. Örneğimizde, tütün mozaik virüsü (TMV), cryoEM 22 vasıtasıyla atomik ayırım çözüldüğü bir RNA virüsü göstermektedir. (Iii) geniş çözünür proteinler fazlasıyla incelenmiştir. Bunlar arasında, simetrik multimerik silindir oluşturan makromoleküller genellikle subnanometer çözünürlükte 23,24 çözülmüş bir yinelenen mimari oluşturmaktadır. Burada bir melez moleküler modeli cryoEM / x-ışını kristalografisi hibrid yöntemleri 25 oluşturulduğu KLH, bir omurgasız oksijen taşıyıcı görüntüleri gösterir. (Iv) Membran proteinleri proteinlerin önemli bir sınıfıdır; insan genomu tarafından kodlanan proteinlerin yaklaşık 1/3 oluşturan, henüz vadesi tr ile ilgili karmaşıklıklar yapısal karakterize etmek zordurBirleştirilen herhangi bir yapısal olan teknikle çözülen yapılar az% 1.5 oluşturan ansmembrane alan sabitleme 26. yapısal tespiti cryoEM ve 3B yeniden rolü riyanodin alıcısı (RyR), kas kasılması ve beyin sinyal verme açısından önemli büyük bir ökariyotik hücre içi Ca + 2 kanal ile örneklenmiştir. Bugüne kadar en yüksek çözünürlükte cryoEM yapıları, 10 Å çözünürlük ile, ikincil yapıyı 27 göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Şekil 1&#39;de özetlenen tüm protokol adımları dikkatli yürütme dondurulmuş sulu olmayan lekeli makromoleküllerin görselleştirme sağlar. Farklı yapısal özelliklere sahip dört temsilci örnekler için sonuçlar gösterilmiştir. NS ve cryoEM yöntemleriyle elde edilen mikroskopik görüntü (Şekil 2) karşılaştırılır. AAV5 (i) AD görüntüleri 130 Â çaplı virüs benzeri partiküller ortaya koymaktadır. Dolu ve boş yapıların birlikteliği sırasıyla, ve yapısal olarak sağlam capsids (leke girişine izin olduğunu) kırık karşılık gelir. CryoEM eşit boş yapıları göstermektedir; Gerçekten de, bu viral partiküller genetik malzeme 28 ihtiva etmez. CryoEM kendi ikozahedral formunu yansıtan, çoğunlukla altıgen parçacıklar gösterir ise NS baskın yuvarlak parçacıkları gösterir. (Ii) her iki 23, görünür bir sarmal tekrar ile sık sık uzun süre 0.1 um 180 bir çapa ve değişken uzunlukta sarmal TMV göstermektedir çubuklar görüntüleri,NS ve cryoEM içinde. 40, merkezi bir kanal cryoEM görüntü NS görüntülerde leke ve boş ile doldurulur. (Iii) Yerli KLH, 8 MDA bir didecamer, 350 Å çapı ve 400 Å uzunluğu karakteristik varil toplanır. NS ve cryoEM KLH en dikdörtgen yan görünümleri ve dairesel görünümler sonu üzerinde ortaya. Her iki teknik altı simetri eksenine dik yarıkları ve her katman içinde eşit aralıklı morfolojik birimleri ortaya koymaktadır. CryoEM boş iç yapısını ortaya koymaktadır. (Iv) Riyanodin reseptörü, 2.26 MDA büyük bir tetramerik hücre içi kanal, 275 x 275 Å 2 kare olarak görülüyor. Böyle bir merkezi haç ve NS tarafından leke birikimi olarak tezahür merkezi depresyon gibi cryoEM tarafından düşük yoğunluklu bölgeler gibi Girift yüzey özellikleri. NS dört test edilen numunelerde içindeki kontrast gösterirken, cryoEM panellerin Bu karşılaştırma, bu membran proteini çözünür hale getirmek için deterjan bulunması RyR1 alt SNR (kontrast) ortaya koyar. Kristal buz, buz kirlenme, astigmatizma ve web-benzeri yapılar (Şekil 3): cryoEM eserler tipik örnekleri RyR1 için gösterilmiştir. Onların nedenleri ve önleme daha tartışma bölümünde açıklanmıştır. Dondurulmuş sulu RyR1 SPA ve 3D rekonstrüksiyon proteinin homotetramerik organizasyonu (Şekil 4A) yansıtan dört kat simetrik yapısını ortaya koymaktadır. sitoplazmik alan Å 3 275 x 275 x 120 bir kare prizma oluşturur ve bir iskele-benzeri bir yapı oluşturan birçok tekrarlanabilir küresel etki içerir. transmembran 115 x 115 x 60 Å 3 maksimum boyutları ile daha küçük konik kare prizma oluşturur. 10 Å çözünürlükte alfa helis (Şekil 4B) görselleştirmek mümkündür. 3D fark haritalama, bu durumda, bir 12 kD proteini düşünüldüğü bir FKBP12 3D farkı ilk önemli ligandların konumunu ortaya çıkarabilirRyR1 kırmızı bir alt-birimi, RyR1 (Şekil 4C) 29 üzerine bindirilir. Son olarak, yapısal değişiklikler makromolekül dinamik bir görünüm sağlar. Bu durumda RyR1 önce açık durumda (Şekil 4D) 27 kapalı bir kitle translokasyon kapalı ya da açık koşullarda ortaya stabilize. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Cryo elektron mikroskopisi tekniği Şekil 1. Akış şeması. Diyagram protokolü temel adımları vurgulamaktadır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Numunelerin çeşitli NS ve cryoEM 2. Karşılaştırma Şekil. (A), AAV5, bir ikosahedral virüsü. Helezoni virüsü (B), TMV. Insets 23 Å sarmal tekrarı, gösterir. (C) Yerli KLH. (D) RyR1; temsili görünümleri (f dört kat görünümü ve s, yan görünümü) vurgulanır. Bütün numuneler, düşük doz ve koşullar altında 200 kV bir hızlandırma gerilimi altında 50,000X bir aynı büyütmede görüntülü. Ölçek çubukları, 10 nm. Tüm NS örnekleri karbon desteği üzerinde, cryoEM örnekleri A, C, D quantifoil üzerinde ince karbon üzerinde, ve cryoEM örnek B quantifoil delikleri üzerinde doğrudan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Şekil, bir RyR1 cryoEM örnek ortak cryoEM eserler gösteren görüntü 3. Fotoğraflar. (A) kristal buz. (B) Buz kirlenme (oklar). (C) Astigmat. Astigmat görüntüde RyR1s zorlukla görülebilir. Sağdaki ilave güç SPECT gösterirAsimetrik Thon halkaları görüntünün rom. Soldaki ilave referans olmayan bir astigmat görüntünün güç spektrumunu gösterir. (D) Web-benzeri yapılar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Riyanodin reseptörünün 4. cryoEM ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon Şekil. (A). Isosurface temsili (B), atomik koordinatlar ve cryoEM zarf arasında iyi bir uyum gösteren RyR1 en N-terminali 30 arasında bir kristal yapısının Yerleştirme; oklar yapıdan çıkan iki alfa heliksler işaret. Ok başı iyon kanalının gözenek çevreleyen dört sarmallarının birini gösterir. noktalı çizgiler, membran sınırlarını göstermektedir. (C), RyR1 ve 3B loFKBP12 ligandı (turuncu renk) katyon. (D) açık (siyah örgü) Uyum kapalı (turuncu) den gidiş RyR1 konformasyonel değişiklikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction at JoVE.com

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

do-s-don-ts-cryo-electron-microscopy-primer-on-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.7K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction