نحن نتقدم بخالص الشكر الدكتور سيندي N. تشيو للمساعدة في هلام الكهربائي، واندي تشو ومايكل Grodick للتبرع السخي من الحمض النووي وانزيم قيود. ونحن نعترف بامتنان أستاذ J. هيث وأستاذ D. بروبير للوصول السخي على المعدات والمواد. نشكر الدكتور كارن Sorasaenee للحصول على اقتراحات مفيدة. نشكر ماري H. تانغ لخلق التوضيح المستخدمة في العرض التخطيطي في شريط الفيديو. تم توفير التمويل من قبل جونسون آند جونسون وUSC Y86786.

ملاحظة: عند العمل مع RNA الحفاظ على بيئة عمل نظيفة لتجنب التلوث الدناز وريبونوكلياز الإنزيمات التي تحط من DNA و RNA. ضمان نصائح ماصة والأنابيب هي الدناز وريبونوكلياز الحرة. ومن المفيد أيضا لمسح أسفل الأسطح المختبر والمعدات مثل الماصات، وأصحاب أنبوب، وما إلى ذلك مع حل إزالة التلوث. 1. RNA النسخ مع العلاج Corrole <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد corrole والمانع المركبات في 0.01: 1 نسبة ضرس [مجمع]: [DNA]. ملاحظة: في حالتنا، بلغت هذه النسبة 4.3 مجمع fmol: 0.43 DNA بمول، حيث كان القالب DNA تستخدم ناقلات APET-28C مع الاسباني الجينات من E. القولونية تحت سيطرة المروج T7. DNA الآخر مع المروج T7 أيضا المرشحين صالحة للتشغيل فحص النسخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، وجورجيا (tpfc) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في نظيفة، حاويات منفصلة. الحصول على التركيز النهائي من 0.01: 1 نسبة ضرس [جomplex]: [DNA] باستخدام التخفيفات المسلسل مع nuclease خالية من المياه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ أكتينوميسين D في 1.8 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1/100 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف. ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من أكتينوميسين D هي 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ تريبتوليد triptolide في 0.64 مل DMSO. قسامة 1 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق الثاني 1 / 1،000 التخفيف. ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من تريبتوليد triptolide هي 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ tpfc في 2.9 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع nuclease خالية من المياه لإنشاء 1/100 دilution. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف. ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من tpfc هي 4.3 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ جورجيا (tpfc) في 2.6 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1/100 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف. ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من جورجيا (tpfc) هي 4.3 fmol. ملاحظة: هذه corroles ومثبطات ليست قابلة للذوبان في الماء، ويجب أن يكون قبل حله في DMSO. كميات صغيرة من DMSO (أقل من 1٪) لا يستحث السمية الخلوية في الخلايا (بيانات غير منشورة). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في رد فعل النسخ، وإعداد الكواشف اللازمة بشكل فردي أو شرائها من بائع التجاري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد على الجليد كل جمدتن الكواشف (الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على قائمة الكواشف المجمدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتفاعل العازلة 10X وريبونوكليوتيد 4 (ATP، CTP، GTP، وUTP) حلول الوقت لخلط حتى يتم حلها تماما أنهم في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عن الكواشف لمنع فقدان المواد على حافة الأنبوب. إذابة مرة واحدة، وتخزين ribonucleotides على الجليد مع الحفاظ على رد الفعل 10X العازلة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكواشف لرد فعل النسخ في RT (راجع الجدول 2 للحصول على قائمة الكواشف). ملاحظة: سبيرمدين في 10X رد فعل العازلة يمكن coprecipitate الحمض النووي القالب إذا تم تجميعها رد فعل على الجليد وليس في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج دقيق من قبل عبها الأنبوب أو pipetting لالخليط بلطف صعودا وهبوطا. بعد الاختلاط، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع خليط التفاعل في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ما مجموعه 2-4 ساعة. ملاحظة: تختلف أوقات رد الفعل الضروريةمع حجم القالب الحمض النووي والتسلسل. قد تتطلب هذه الخطوة الأمثل لمتواليات محددة. قد تتطلب قوالب أقصر أوقات رد الفعل أطول لارتفاع العائد من إجمالي RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 4 مكل من كل رد فعل بعد كل ساعة وتخزينها في -20 ° C. تعديل حسب الحاجة لtimepoints المطلوب. </li></ol></li></ol> 2. RNA سبين العمود <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد رد فعل النسخ، وتنقية RNA باستخدام الأعمدة اللوني ميكروسنتريفوج متوافق. ملاحظة: استخدام الأعمدة RNA تدور لتنقية RNA مع أكبر من 20 قواعد النتائج في انتعاش أكبر من 80٪ 44 ملاحظة: اللوني العمود هو طريقة شائعة ومريحة لتنقية RNA. توجد أساليب تنقية أخرى أيضا مثل كلوريد الليثيوم هطول الأمطار، والفينول: استخراج الكلوروفورم، الأيزوبروبانول هطول الأمطار، فضلا عن غيرها من مجموعات المتاحة تجاريا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتساوي resuspend ومصفوفة Sephadex في المخزن المؤقت عمود بواسطة قلب بقوةالعمود ثلاث مرات أو أكثر. القيام بذلك عن طريق عبها العمود بشكل حاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء العلوي من العمود. سيكون هناك بعض مصفوفة Sephadex المتبقية في الحد الأقصى. إذا يتم تعبئة الغطاء مع المصفوفة، واستبدال الغطاء على العمود، وتكرار الخطوة السابقة حتى غالبية المصفوفة في العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة قبالة الطرف السفلي من العمود. ملاحظة: بعض السائل قد يفلت من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حزمة العمود. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عمود في العقيمة (ريبونوكلياز والدناز الحرة) أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في جهاز للطرد المركزي الطاولة في 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة مزال من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الفور العمود في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge جديد وماصة العينة إلى مركز السرير العمود. استخدام 20-50 ميكرولتر من عينة لتجنب الحمولة الزائدة العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في جهاز للطرد المركزي الطاولة في 1،000 x جلمدة 1 دقيقة. ملاحظة: إن شاطف هو عينة الحمض النووي الريبي المنقى. </li></ol></li></ol> 3. الاغاروز جل الكهربائي (1٪ الاغاروز جل) 42 ملاحظة: بروميد إيثيديوم تتفلور على ملزم لDNA و RNA، لذلك هذه الجزيئات الحيوية يمكن تصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تفرخ لهم مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 1،000x الأسهم بروميد إيثيديوم (0.5 ملغ / مل) عن طريق إذابة 5 ملغ إيثيديوم بروميد في 10 مل من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تريس خلات EDTA (تاي) عازلة لتشغيل الكهربائي للهلام. لجعل منطقة عازلة 50X TAE الجمع بين 2.0 M تريس، خلات مع 0.05 حمض M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) وضبط درجة الحموضة إلى 8.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1٪ (وزن / حجم) agarose هلام عن طريق إذابة 10 جم عالى النقاء الاغاروز في 1 L 1X TAE العازلة وذوبان الاغاروز مع فرن الميكروويف التقليدي. وبمجرد أن يبرد إلى 50 درجة مئوية، إضافة 1 مل من 1،000x إيثيديوم بروميد إلى 1٪ هلام الاغاروز المحاليلنشوئها، مزيج من قبل يحوم بلطف أو بواسطة قلب في حاوية مغلقة، ثم صب الحل الاغاروز إلى منصة الصب جل والسماح للهلام ليصلب في RT. ملاحظة: بروميد إيثيديوم هو المغير ومسرطنة محتملة. ارتداء قفازات والتعامل مع الحلول بعناية. للحصول على إجراءات السليمة للتعامل معها من بروميد إيثيديوم، يرجى الاطلاع على: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php؟msdsId=9927667</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن عزز الجل، ووضع هلام مجموعة في الخزان الكهربائي. إضافة المخزن ما يكفي من TAE لتغطية هلام حتى يتم المغمورة الآبار. تحقق من أن مستوى المخزن المؤقت تاي هو حوالي 1 مم فوق مستوى هلام. إزالة مشط هلام. ملاحظة: إزالة المشط بعد المغمورة الآبار يمنع جيوب الهواء من الوقوع في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات الحمض النووي الريبي. الجمع بين 1 ميكرولتر من كل عينة قسامة المنقى مع جل 1 ميكرولتر تحميل العازلة (أو مع 1 ميكرولتر 10X العازلة تحميل ومخففإد إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه) ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ممص مكروى. يحتوي 10X العازلة تحميل 20٪ Ficoll 400، 0.1 M نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 1.0٪ SDS، 0.25٪ برموفينول الأزرق: ملاحظة. ويمكن أيضا أن يضاف 0.25٪ سيانول زايلين إلى المخزن المؤقت التحميل، كما أنها تدير ~ 50٪ بأسرع برموفينول الأزرق ويمكن أن تكون مفيدة لرصد المسافات الطويلة جدا (42). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الجل مع كل عينة من قبل pipetting بعناية الحل في الجزء السفلي من كل بئر. والحرص على عدم ترك أي فقاعات هواء أو مزيج بين عينات الآبار. ملاحظة: يمكن أن تستخدم أيضا سلم RNA لتحديد حجم النص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق يؤدي بحيث DNA سوف يهاجر إلى هلام نحو قيادة إيجابية. تعيين الجهد إلى المستوى المطلوب، وعادة 1 إلى 10 V / سم من هلام. تشغيل هلام لفترة طويلة ولكن غير كاف للانفصال كبير بين شظايا الحمض النووي الريبي، وذلك باستخدام الهجرة من الأصباغ لرصد التقدم المحرز في الانفصال. NOTE: وهناك 23 سم × 25 سم هلام في 250 V تأخذ حوالي 1 ساعة، في حين أن 8 سم × 8 سم هلام في 150 V سيستغرق حوالي 20 دقيقة. شظايا الحمض النووي الريبي الصغيرة لديها أفضل قرار عند تشغيله في الفولتية أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف التيار الكهربائي عند الصبغة من العازلة تحميل وهاجر مسافة كافية ليحكم الفصل بين شظايا الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة فإن RNA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مثل بروميد إيثيديوم يتألق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من الصورة ومقارنة شدة مضان من الحمض النووي الريبي تنقيته من كل شرط. </li></ol> 4. RNA الكمي عن طريق الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2 ميكرولتر H 2 O على معمل NanoDrop عام 2000، أو آلة مماثلة، وقياس فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالي، ضع 2 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي الريبي، وبعد التنقية، على معمل وقياس الأشعة فوق البنفسجية فيس من نطاق الطول الموجي من 200 نانومتر إلى 800 نانومتر. ملاحظة: لقراءة 260 من 1.0 ما يعادل حوالي 40 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي،وRNA النقي لديه A 260 / A نسبة 280 2.1 (45). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة أن الامتصاصية هو أعلى من 1 OD، يخفف من العينات في nuclease خالية من المياه للحصول على OD أقل من 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم العينات المختلفة ومقارنة OD في 260 نانومتر. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يوضح هذا الاختبار أن إضافة جورجيا (tpfc) يمنع النسخ RNA نسبيا إلى الحمض النووي ملزم المجمعات المضادة للسرطان المعروف أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. سلوك السامة للخلايا من جورجيا (tpfc) (GI 50 = 58،1 حتي 154،7 ميكرومتر) قد ونظرا لخواصها مثبطة. منذ لم يلاحظ أي تثبيط النسخ في tpf...

غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع آثار جانبية غير مرغوب فيها واستهداف محدود، ولكن مع مزيد من الفهم بيولوجيا السرطان، هناك الطلب المتزايد على وكلاء المضادة للسرطان مع ارتفاع فعالية استهداف السرطان وآثار جانبية أقل. 1 الخلايا السرطانية البشرية أصبحت في كثير من الأحيان تعتمد على الجين الورمي واحد المنشط أو overexpressed من أجل البقاء 2 وهكذا.، يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. العلاجات التي تمنع التعبير عن هذه الجينات تحويل فعالة في القضاء على الخلايا السرطانية وتؤدي إلى موت الخلايا. 3 خلايا تحولت هي أكثر حساسية للاضطرابات في RNA النسخ من والمقابلة الخلايا الطبيعية. 4 الأدوية المضادة للسرطان التي تمنع النسخ من المتوقع أن تمنع بشكل انتقائي التعبير عن الجينات المسرطنة والتي هي ضرورية للخلية السرطانية إلى البقاء على قيد الحياة. 5 وبالتالي، RNA النسخ طnhibition هو وسيلة مفيدة لتحديد المرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات ومعرفة المزيد عن آلية عملها. يوضح هذا البروتوكول الذي الجا (tpfc) يمنع النسخ RNA على نفس الترتيب كما أدوية العلاج الكيميائي أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. مقارنات مماثلة يمكن إجراؤها باستخدام هذا البروتوكول مع غيرها من المرشحين المضادة للسرطان المخدرات. أكتينوميسين D هو النسخ مثبط RNA التي تستخدم عادة لعلاج السرطان الحمل الأرومة الغاذية، وسرطان الخصية، ورم WILM، وrhabdomyosacoma، وساركوما 6 في يوينغ. تم أكتينوميسين D المستخدمة في علاج السرطان منذ ما يقرب من خمسين عاما منذ أن تم الموافقة عليها من أول مرة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في 1964.Triptolide هو المانع النسخ الانتقائي التي تم التحقيق فيها في التجارب المختبرية ومختلف النماذج الحيوانية الحاملة للورم لمدة 30 عاما. 7 طبيعة macrocyclic محبة للجهتين من corroles يضفي مزايا هامة على أصناف الأدوية الأخرى مثل جزيئات صغيرة أو البيولوجيةالصورة. يسمح 8-14 الحرف macrocyclic لنفاذية الخلوية أكبر من المتوقع لمثل هذه الجزيئات الكبيرة، وكانت كبيرة بما يكفي للتفاعل مع أسطح الجزيئات، مثل تلك البروتينات. ومن المعروف 8 Corroles على شكل مجمعات noncovalent ضيقة مع الجزيئات الحيوية والمخدرات. 10 وبالإضافة إلى سمية الخلايا الكامنة في إطار corrole، لقد أثبتنا أن أعمال corrole المسلفنة كما جزيء الناقل عن وكلاء العلاج الكيميائي، وتحديدا أنثراسيكلين دوكسوروبيسين المخدرات الإقحام DNA. عندما تعطى معه في corrole المسلفنة مع دوكسوروبيسين، لوحظ وجود زيادة 3 أضعاف في IC 50 من دوكسوروبيسين لDU-145 الخلايا. 9 الإطار corrole مستقر ولديه الكامنة الامتصاصية ومضان الخصائص التي، عندما بين functionalized، الخضوع لتحولات الامتصاصية فريدة والتي يمكن استخدامها لتوصيف 10 Functionalization من السقالة لا affec بطبيعتهار خصائص photophysical من corrole، 9-15 ولكن، كما رأينا مع corrole المسلفنة، وتعديل انتقائي إطار corrole يمكن أن تتغير بشكل كبير خصائصه البيولوجية (16). ونحن تقييمها من قبل ستة metallocorroles ضد سبعة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. وتشير النتائج إلى أن سمية تجاه الخلايا السرطانية البشرية تعتمد على أيون الفلز محددة، فضلا عن استبدال مجموعة وظيفية. على سبيل المثال، corroles الغاليوم المسلفنة شهدت امتصاص الخلوية عالية وتوغلت بشكل انتقائي في نواة الدماغ خلايا سرطان البروستاتا النقيلي (DU-145)؛ الخلايا نفسها corrole، على الرغم من أنها لا تخترق نواة من خطوط الخلايا الأخرى، يسلك أكبر سمية الخلايا لسرطان الثدي (MDA-MB-231)، سرطان الجلد (SK-MEL-28)، والمبيض (OVCAR-3) السرطان من ل سرطان البروستاتا. 9 المقايسات خلية القاعدة الأولية تشير إلى أن هذه المركبات تظهر الوعد كما المضادة للسرطان العوامل العلاجية، والتي تستحق فورثالتحقيق إيه في آلية العمل. ويلاحظ النسخ تثبيط مع بعض المجمعات الفلزية العضوية 17-27 وسعينا لدراسة هذه العملية كآلية محتملة لسلوك السامة للخلايا من عائلة corrole. يوفر هذا الاختبار النسخ طريقة واضحة وغير مكلفة، وسطحي لتقييم تثبيط النسخ، الأمر الذي سيؤدي إلى مزيد من المعلومات التفصيلية حول آثار هذه الجزيئات في الخلايا الحية. هنا، وتثبيط النسخ من الغاليوم (III) 5،10،15- يتم اختبار (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس لها 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (الشكل 1). وخلافا لبعض المجمعات المعدن الانتقالية، الغاليوم (III) غير نشط الأكسدة ويست متورطة مباشرة في عملية الأكسدة من المسارات الأيضية القائم على الأكسدة وبالتالي 28 بغض النظر، الغاليوم (III) لا يحمل خصائص السامة للخلايا، وقد تم التحقيق لأغراض علاجية. الغاليوم هو ثاني أكثر المعادن واعد للعلاجات المضادة للسرطان بعد البلاتين وشهدت العديد من الدراسات والتحقيقات؛ وقد تم تقييم النترات والأملاح كلوريد الغاليوم في التجارب السريرية ضد الكبدي، سرطان الغدد الليمفاوية، سرطان المثانة، وأمراض أخرى. 29-34 الغاليوم (III) هو بالتالي مثالية للالمضادة للسرطان دراسات corrole. وتشير البيانات الأولية جورجيا (tpfc) وtpfc لديهم انخفاض GI 50، وتركيز الدواء الضروري لمنع 50٪ من تكاثر الخلايا القصوى، مع مختلف خطوط الخلايا السرطانية (انظر الشكل 2)؛ هذا يؤكد صحة مزيد من التجارب على هذين المركبين لتحديد خصائصها مثبطة. قارنا هذه المركبات مع الأدوية المضادة للسرطان شيوعا أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. أكتينوميسين D intercalates DNA، RNA يمنع استطالة، ويدفع الخلايا في خلية خط معين في تركيزات بيكو مولي أظهرت 6،35-37 تريبتوليد triptolide لمنع نمو الورم؛ فإنه يلزم لXPB البشرية / ERCC3، وس فرعيةعامل و النسخ TFIIH، مما يؤدي إلى تثبيط RNA البلمرة II النشاط. 6-7،38-40 بينما هو معلوم أن corroles يحمل خصائص السامة للخلايا، هناك القليل من المعلومات عن مختلف آليات الناشئة عن functionalization. أن تثبيط Corrole من الحمض النووي الريبي النسخ تقديم مزيد من التبصر في تفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. المجمعات الأخرى المعروفة لربط الحمض النووي، مثل dirhodium (II، II) المجمعات والكروم (III) المجمعات، الروثينيوم (II) المجمعات polypyridyl، الروديوم (III) المجمعات، وغيرها مختلف، تعرضوا لفحوصات الحمض النووي الريبي النسخ، 18- 27 مما أدى إلى فهم أكبر لتفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. هذه التجربة السهلة والمتاحة على نطاق واسع هي أيضا اختبار أولي جيد لتقييم خصائص سمية الخلايا من جزيء معين، وتحديد ما إذا كانت مزايا الاختبار مزيد البيولوجي. الفحص RNA النسخ يسمح أيضا للعديد من التعديلات، مثل varyinز كمية من مركب أو الإنزيمات المستخدمة؛ متفاوتة فترة الحضانة وفترة رد الفعل ونقاط الوقت عينة. ومتفاوتة DNA طول قالب وتسلسل، وبين المتغيرات الأخرى ذات الاهتمام، وبالتالي يحتمل توفير كمية كبيرة من البيانات. هذا الاختبار النسخ هو أيضا متاحة بسهولة إلى مجموعات بأسعار معقولة مع جميع المكونات رد فعل الضرورية المقدمة، على الرغم من أن مكونات يمكن شراء وأعد بشكل فردي. في هذه التجارب، ونحن نستخدم مجموعة المتاحة تجاريا المعروف أن ارتفاع العائد. 41 لتقييم النسخ تثبيط، ونحن نستخدم طريقتين: الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة بسيطة وفعالة لفصل وتحديد، وتنقية 0.5- إلى DNA و RNA شظايا 25 كيلو بايت. يمكن استخدام 42 UV-فيس التحليل الطيفي لتحديد التركيز والنقاء من الحمض النووي الريبي. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع العديد من الآثار الجانبية واستهداف محدود. Corroles هي فئة من macrocycles tetrapyrrolic التي تظهر خصائص التفاضلية تثبيط الخلايا والسامة للخلايا في خطوط خلية معينة، اعتمادا على هويات المعادن بالكلاب والمجموعات الوظيفية. سلوك فريد من corroles بين functionalized نحو خطوط معينة من الخلايا يقدم إمكانية العلاج الكيميائي المستهدفة. يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لRNA النسخ في وجود مثبطات المعروفة والمحتملة. تقييم المنتجات RNA من رد فعل النسخ التي كتبها الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي يوفر معلومات عن خصائص مثبطة للمرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات و، مع تعديلات على الفحص، أكثر حول آلية عملها. القليلومن المعروف عن الآلية الجزيئية عمل السمسة corrole. في هذه التجربة، ونحن نعتبر مجمعين corrole: الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc). واستخدمت مقايسة RNA النسخ لدراسة خصائص مثبطة للcorroles. وقد أعدت خمسة ردود الفعل النسخ: DNA تعامل مع أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، جورجيا (tpfc)، tpfc في [معقدة]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01، على التوالي، وعنصر تحكم غير المعالجة. وقد تم تحليل ردود الفعل النسخ بعد 4 ساعات باستخدام الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. هناك تثبيط واضح من قبل جورجيا (tpfc)، أكتينوميسين D، وتريبتوليد triptolide. يمكن تعديل هذا الاختبار RNA النسخ لتقديم المزيد من التفاصيل الآلية من خلال تغيير تركيزات مجمع المضادة للسرطان، DNA، أو إنزيم البلمرة، أو التي يحتضنها DNA أو البلمرة مع مجمعاتXES قبل RNA النسخ؛ ان هذه التعديلات يفرق بين آلية تثبيط تنطوي على DNA أو الانزيم. واضاف ان المجمع بعد RNA النسخ يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان المجمعات تتحلل أو يتحلل الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن هذا الاختبار أن تستخدم لدراسة المرشحين المضادة للسرطان إضافية.

RNA النسخ نوعيا المقررة من قبل الاغاروز جل الكهربائي ويستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام لصورة RNA كتب. إيثيديوم بروميد تتفلور على ملزمة (λ م = 605 نانومتر، λ = 210 نانومتر السابق، 285 نانومتر) 46 التصوير السماح من...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole ونظائره فريبيس تظهر منخفضة السمية لخلايا مكرومولي. توضح هذه المخطوطة على رد فعل النسخ RNA، RNA التصوير مع إيثيديوم بروميد ملطخة هلام، وقياس RNA مع الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من أجل تقييم النسخ تثبيط من قبل corroles وتبين طريقة واضحة لتقييم الخصائص المضادة للسرطان مرشح.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH<sub&gt; 3</sub&gt; 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K Views.  California Institute of Technology.  الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole ونظائره فريبيس تظهر منخفضة السمية لخلايا مكرومولي. توضح هذه المخطوطة على رد فعل النسخ RNA، RNA التصوير مع إيثيديوم بروميد ملطخة هلام، وقياس RNA مع الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من أجل تقييم الن?...

Video: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; بصري منصة لاختبار العدسات اللاصقة

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...