Agradecemos sinceramente Dr. Cindy N. Chiu para obter ajuda com eletroforese em gel, e Andy Zhou e Michael Grodick por sua generosa doação de DNA e enzimas de restrição. Agradecemos Professor J. Heath e Professor D. Prober para acesso generoso para equipamentos e materiais. Agradecemos ao Dr. Karn Sorasaenee para sugestões úteis. Agradecemos Mary H. Tang para a criação da ilustração usada no panorama de conjunto no vídeo. O financiamento foi fornecido pela Johnson &amp; Johnson e USC Y86786.

NOTA: Quando se trabalha com RNA manter um ambiente de trabalho limpo para evitar a contaminação por DNase e RNase enzimas que degradam o DNA e RNA. Assegurar que as pontas de pipetas e tubos são DNase e RNase livre. Também é útil para limpar as superfícies de laboratório e equipamentos, tais como pipetas, suportes para tubos, etc., com uma solução de descontaminação. Transcrição com ARN 1. Tratamento Corrole <ol><li> Prepare o corrole e os compostos inibidores de 0,01: 1 proporção molar de [complexo]: [ADN]. NOTA: No nosso caso, a proporção foi de 4,3 complexo fmol: 0,43 pmol DNA, onde o modelo de DNA utilizado foi vector APET-28c com gene Liga de E. coli sob o controlo do promotor de T7. Outros ADN com o promotor T7 também são candidatos válidos para a execução do ensaio de transcrição. <ol><li> Dissolve-se Actinomicina D, triptolido, tpfc, e Ga (tpfc) em dimetil sulfóxido (DMSO) em recipientes limpos, separadas. Obter a concentração final de 0,01: 1 proporção molar de [complex]: [DNA] utilizando diluições em série com água livre de nuclease. <ol><li> Dissolve-se 1 mg de actinomicina D em 1,8 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final de actinomicina D é 4,3 fmol. </li><li> Dissolve-se 1 mg de triptólido, em 0,64 ml de DMSO. Alíquota 1 ul a um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma segunda diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol de triptólido. </li><li> Dissolve-se 1 mg tpfc em 2,9 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluídas para 1 ml com água isenta de nuclease para criar um 1/100 dilution. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final é de 4,3 fmol tpfc. </li><li> Dissolve-se 1 mg de Ga (tpfc) em 2,6 ml de DMSO. Aliquota de 10 ul para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição de 1/100. Aliquota de 1 ul da diluição para um recipiente separado e diluído para 1 ml com água isenta de nuclease para criar uma diluição 1 / 1.000. NOTA: A concentração da solução final de Ga (tpfc) é de 4,3 fmol. NOTA: Estes corroles e inibidores não são solúveis em água e devem ser pré-dissolvido em DMSO. Pequenas quantidades de DMSO (abaixo de 1%) não induzem citotoxicidade nas células (dados não publicados). </li></ol></li></ol></li><li> Antes do início da reacção de transcrição, preparar os reagentes necessários individualmente ou adquiri-los a partir de um fornecedor comercial. <ol><li> Thaw no gelo congelou todosn reagentes (consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes congelados). </li><li> Permitir que a 10x tampão de reacção e a 4 ribonucleótido (ATP, CTP, GTP, UTP) e soluções tempo a misturar até que eles estão completamente dissolvidos na solução. </li><li> Resumidamente Centrifugar todos os reagentes para evitar a perda de material sobre o aro do tubo. Uma vez descongelado, ribonucleótidos armazenar em gelo, mantendo a 10x tampão de reacção à temperatura ambiente. </li><li> Combine reagentes para a reação de transcrição na RT (consulte a Tabela 2 para obter uma lista de reagentes). NOTA: A espermidina na 10x tampão de reacção pode coprecipitado de DNA molde, se a reacção é montada sobre gelo, em vez de à temperatura ambiente. </li><li> Misture bem sacudindo o tubo ou pipetar a mistura para cima e para baixo com cuidado. Depois de se misturar, brevemente centrífuga para recolher mistura de reacção no fundo do tubo. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante um total de 2-4 horas. NOTA: Os tempos de reação necessárias variarácom o tamanho do modelo de ADN e a sequência. Este passo pode requerer optimização para sequências específicas. Modelos mais curtos podem requerem tempos de reacção mais longos para um elevado rendimento de ARN total. </li><li> Remover 4 mL alíquotas de cada reacção após cada hora e armazenar a -20 ° C. Modificar como necessário para timepoints desejados. </li></ol></li></ol> 2. RNA spin Coluna <ol><li> A seguir à reacção de transcrição, purificar o ARN utilizando colunas de cromatografia de microcentrífuga-compatível. NOTA:. A utilização de colunas de RNA de rotação para purificar RNA com maior do que 20 bases originou uma recuperação superior a 80% 44 NOTA: A cromatografia em coluna é um método comum e conveniente para purificar o ARN. Outros métodos de purificação também existir como precipitação Cloreto de lítio, extracção com fenol: clorofórmio, precipitação com isopropanol, bem como outros kits disponíveis comercialmente. <ol><li> Ressuspender uniformemente na matriz de Sephadex em tampão de coluna por vigorosamente invertendo ocoluna de três ou mais vezes. Faça isso por um movimento súbito da coluna acentuadamente. </li><li> Remover o tampão de topo da coluna. Haverá alguma matriz de Sephadex residual na tampa; se a tampa é preenchido com a matriz, substituir a tampa na coluna e repetir o passo anterior até que a maioria da matriz é na coluna. </li><li> E cortar a extremidade inferior da coluna. Nota: Alguns líquido pode escapar da coluna. </li><li> Encher a coluna. <ol><li> Coloque coluna em uma estéril (RNase e DNase livre) tubo de 1,5 ml de microcentrífuga. </li><li> Centrifuga-se o tubo numa centrifugadora de bancada a 1000 x g durante 1 min. </li></ol></li><li> Descartar o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com tampão de eluído a partir da coluna. </li><li> Colocar imediatamente a coluna em um novo tubo de 1,5 mL de microcentrífuga estéril e pipetar a amostra para o centro do leito da coluna. Use 20-50 mL de amostra para evitar sobrecarregar a coluna. </li><li> Centrifuga-se o tubo numa centrífuga de mesa a 1000 xgdurante 1 min. NOTA: O eluente é a amostra de RNA purificado. </li></ol></li></ol> 3. Agarose Gel de Eletroforese (1% do gel de agarose) 42 NOTA: O brometo de etídio fluorescência após a ligação ao ADN e ARN, por conseguinte, estas biomoléculas pode ser visualizada com luz UV, incubando-as com 0,5 ug ml de brometo de etídio / solução. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 1.000x brometo de etidio (0,5 mg / ml) por dissolução de 5 mg de brometo de etídio em 10 ml de água. </li><li> Prepare Tris Acetato EDTA (TAE) tampão de corrida para eletroforese em gel. Para fazer um tampão TAE combinar 50x 2,0 M de Tris-acetato com 0,05 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ajustar o pH para 8,5. </li><li> Prepara-se uma 1% (peso / volume) em gel de agarose por dissolução de 10 g de agarose UltraPure em 1 L de tampão 1x TAE e derretendo a agarose com um forno de microondas convencional. Uma vez arrefecida a 50 ° C, adiciona-se 1 ml de brometo de etídio a 1.000x a solu gel de agarose a 1%ção, misture agitando suavemente por inversão ou num recipiente fechado, em seguida, verter a solução de agarose num gel de plataforma de fundição e para permitir que o gel solidificar à temperatura ambiente. NOTA: O brometo de etídio é um agente mutagênico e potencial cancerígeno. Usar luvas e lidar com soluções cuidadosamente. Para o manejo adequado de brometo de etídio, por favor consulte: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Depois que o gel tem solidificado, coloque o gel set no tanque de eletroforese. Adicionar tampão TAE suficiente para cobrir o gel até que os poços estão submersos. Verificar se o nível do tampão TAE cerca de 1 mm acima do nível do gel. Remover o pente de gel. Observação: remover o pente depois de poços estão submersos impede bolsas de ar fique preso nos poços. </li><li> Preparar as amostras de ARN. Combine 1 ml de cada alíquota de amostra purificada com 1 ml Carregando Gel Buffer (ou com 1 ml de 10x tampão de carregamento e diluted para 10 mL com água livre de nuclease) e misture bem por pipetagem cima e para baixo com uma micropipeta. NOTA: tampão de carga 10x contém 20% de Ficoll 400, 0,1 M de Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% de azul de bromofenol. 0,25% de xileno cianol pode também ser adicionado ao tampão de carga, enquanto é executado ~ 50% mais rápido que o azul de bromofenol e pode ser útil para a monitorização muito longas. 42 </li><li> Carregar o gel com cada amostra, pipetando cuidadosamente a solução para o fundo de cada poço. Tome cuidado para não deixar as bolhas de ar ou misturar as amostras entre poços. NOTA: Uma escada de ARN também pode ser utilizado para determinar o tamanho do transcrito. </li><li> Ligue os fios de modo a que o ADN vai migrar para o gel em direcção ao polo positivo. Ajustar a tensão até ao nível desejado, tipicamente de 1 a 10 V / cm do gel. Submeter o gel independentemente do tempo é suficiente para a separação significativa entre os fragmentos de ARN, utilizando a migração de corantes para monitorar o progresso da separação. NOTA: A 23 cm x 25 cm gel em 250 V levará aproximadamente 1 hora, enquanto um 8 cm x 8 cm gel em 150 V levará cerca de 20 min. Fragmentos de RNA mais pequenas têm uma melhor resolução quando executado em voltagens mais altas. </li><li> Desligue a fonte de alimentação quando o corante do tampão de carregamento migrou uma distância considerados suficientes para a separação entre os fragmentos de RNA. </li><li> Imagem do ARN sob luz UV como o brometo de etídio ficam fluorescentes. </li><li> Tire uma foto da imagem e comparar intensidades de fluorescência do RNA purificado de cada condição. </li></ol> 4. RNA Quantificação via Espectroscopia UV-Vis <ol><li> Coloque 2 l H 2 O em uma NanoDrop 2000 ou máquina similar, e medir o Branco. </li><li> Em seguida, colocar 2 ul de cada amostra de ARN, após purificação, no espectrofotómetro e medir UV-Vis a partir de uma gama de comprimentos de onda de 200 nm a 800 nm. NOTA: O 260 Uma leitura de 1,0 é equivalente a cerca de 40 ug / ml de ARN,e ARN puro tem um A 260 / A proporção de 2,1 280 45. </li><li> No caso em que é absorvância superior a 1, OD, diluir as amostras em água isenta de nuclease para obter uma DO menor do que 1. </li><li> Use software de gráficos para traçar as várias amostras e comparar OD a 260 nm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este ensaio demonstra que a adição de Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN comparavelmente aos complexos anticancro de ligação de ADN conhecidos actinomicina D e triptólido. O comportamento citotóxico de Ga (tpfc) (GI = 50 58,1-154,7 M) pode, devido às suas propriedades inibidoras. Uma vez que não foi observada inibição da transcrição em tpfc, a citotoxicidade de tpfc não é devido a inibição da transcrição de ARN, mas é causada por outros meios, ainda não estudadas. <p class="jove_co...

A quimioterapia muitas vezes envolve amplo espectro agentes citotóxicos com efeitos colaterais indesejáveis ​​e segmentação limitado, mas com uma maior compreensão da biologia do câncer, há uma demanda cada vez maior por agentes anticancerígenos com maior eficácia a segmentação câncer e menos efeitos colaterais. 1 células cancerosas humanas tornam-se frequentemente dependente de um único oncogene activado ou super-expresso para a sobrevivência. 2 Assim, muitas drogas anti-cancro são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Os tratamentos que bloqueiam a expressão destes genes transformantes são eficazes na eliminação de células cancerosas e conduzir à morte celular. 3 As células transformadas são mais sensíveis às perturbações na transcrição de ARN que são células normais correspondentes. 4 fármacos anti-cancro que inibem a transcrição são esperados para inibem selectivamente a expressão de oncogenes que são necessários para a célula cancerosa para sobreviver. 5 Por conseguinte, a transcrição do RNA inhibition é uma maneira útil para identificar potenciais candidatos a medicamentos anticâncer e aprender mais sobre seu mecanismo de ação. Este protocolo demonstra que Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN na mesma ordem que as drogas quimioterápicas actinomicina D e triptólido; Comparações semelhantes podem ser feitas usando este protocolo com outros candidatos a fármacos anticâncer. Actinomicina D é um inibidor da transcrição RNA comumente usado para tratar câncer trofoblástica gestacional, câncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing do sarcoma 6. Actinomicina D tem sido utilizado em terapia de cancro para cerca de cinquenta anos desde que foi aprovado pela FDA em primeiro lugar em 1964.Triptolide é um inibidor selectivo de transcrição que tem sido investigado in vitro e em diversos modelos animais portadores de tumores de 30 anos. 7 A natureza macrocyclic amphiphilic de corroles confere vantagens significativas sobre outras classes de drogas, tais como moléculas pequenas ou biológicos. 8-14 O carácter macrocíclico permite a permeabilidade celular, que é maior do que o esperado para tais moléculas grandes, e que são suficientemente grandes para interagir com superfícies macromoleculares, tais como os de proteínas. Corroles 8 são conhecidas por formar complexos não covalentes apertadas com biomoléculas e drogas. 10 Além da citotoxicidade inerente do quadro corrole, nós demonstramos que a corrole sulfonados actua como uma molécula veículo para agentes quimioterapêuticos, especialmente a antraciclinas doxorubicina droga intercalante de ADN. Quando o corrole sulfonado foi co-administrado com a doxorrubicina, um aumento de 3 vezes na IC50 de doxorrubicina foi observado para células DU-145. 9 O quadro corrole é estável e tem de absorvância e fluorescência propriedades intrínsecas que, quando funcionalizado, se submetem a mudanças únicas de absorvância que podem ser utilizados para a caracterização. 10 Funcionalização de andaime não inerentemente affect as propriedades fotofísicas da corrole, 9-15, mas, como pode ser visto com um corrole sulfonado, modificando selectivamente a estrutura do corrole pode alterar substancialmente as suas propriedades biológicas. 16 já foi previamente avaliada seis metallocorroles contra sete linhas de células de cancro humano. Os resultados indicam que a toxicidade em relação às células cancerosas humanas é dependente do ião de metal específico, bem como a substituição do grupo funcional. Por exemplo, de gálio corroles sulfonados experimentado alta absorção celular e penetrou selectivamente para dentro do núcleo de células cerebrais de cancro da próstata metastizado (DU-145); células da mesma corrole, embora não penetre no núcleo de outras linhas de células, apresenta uma maior citotoxicidade da mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), e do ovário (OVCAR-3) do cancro do que para cancro da próstata. 9 Os ensaios baseados em células iniciais indicam que estes compostos são promissores como agentes terapêuticos anti-cancro, que merece Further investigação sobre o mecanismo de acção. Inibição da transcrição é observado com certos complexos organometálicos 17-27 e procurou-se examinar este processo como um mecanismo possível para o comportamento citotóxico da família corrole. Este ensaio de transcrição proporciona um método simples, de baixo custo, e fácil para avaliar a inibição de transcrição, o que irá conduzir a uma informação mais detalhada acerca dos efeitos destas moléculas em células vivas. Aqui, a inibição da transcrição de gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e o seu análogo de base livre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) são testados. Ao contrário de alguns complexos de metais de transição, gálio (III) é inactiva redox e, por conseguinte, não está directamente envolvido no processo redox de vias metabólicas à base de redox. 28 Independentemente, gálio (III) que apresentam propriedades citotóxicas e tem sido investigada para fins terapêuticos. Gálio é o segundo metal mais promissora para terapias anticâncer após platina e foi submetido a muitos estudos e investigações; sais de nitrato e cloreto de gálio foram avaliadas em ensaios clínicos contra hepatoma, linfomas, cânceres de bexiga, e outras doenças. 29-34 gálio (III) é, portanto, ideal para anticancerígenos estudos corrole. Os dados iniciais mostram Ga (tpfc) e tpfc têm baixa GI 50, a concentração de droga necessária para inibir 50% da proliferação celular máxima, com várias linhas celulares de cancro (ver Figura 2); este afirma a validade de novas experiências com estes dois compostos para determinar suas propriedades inibidoras. Nós comparar estes compostos com as drogas anticâncer comum Actinomicina D e triptólido. Actinomicina D intercala ADN, ARN inibe o alongamento, e induz a apoptose em certa linha de células em concentrações picomolares 6,35-37 Triptólido tem mostrado inibir o crescimento do tumor.; liga-se a XPB humano / ERCC3, uma subunidade ofactor de transcrição f TFIIH, levando à inibição da actividade de ARN-polimerase II. 6-7,38-40 Enquanto é vulgarmente conhecido que corroles apresentam propriedades citotóxicas, existe pouca informação sobre os diferentes mecanismos decorrentes de funcionalização. Inibição Corrole de RNA transcrição iria oferecer um maior conhecimento sobre suas interações com biomacromoléculas. Outros complexos conhecidos por se ligarem ao ADN, tais como dirhodium (II, II), complexos de crómio (III), complexos, de ruténio (II) polypyridyl, ródio (III), complexos, e vários outros, foram submetidas a ensaios de transcrição de ARN, 18- 27 resultando em uma maior compreensão de suas interações com biomacromoléculas. Esta experiência fácil e amplamente disponível é também um bom teste inicial para avaliar as propriedades de citotoxicidade de uma dada molécula e determinar se deveria ser mais testes biológicos. O ensaio também permite a transcrição do RNA para várias modificações, tais como varying, a quantidade de composto ou enzimas utilizada; variando o período de incubação, tempo de reacção e pontos de tempo de amostragem; e variando-se o comprimento e a sequência de DNA molde, entre outras variáveis ​​de interesse, assim, potencialmente oferecendo uma grande quantidade de dados. Este ensaio de transcrição também está prontamente disponível como kits preços acessíveis, com todos os componentes necessários, desde reação, embora os componentes podem ser comprados e preparados individualmente. Nestas experiências, podemos usar um kit disponível comercialmente conhecido por ter um rendimento elevado 41. Para avaliar a inibição da transcrição, usamos dois métodos: eletroforese em gel de agarose e espectroscopia UV-Vis. Electroforese em gel de agarose é um método simples e eficaz para a separação, identificação e purificação de 0,5 a fragmentos de ADN e ARN de 25 kb. 42 espectroscopia UV-Vis pode ser utilizado para determinar a concentração e pureza do ARN. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

A quimioterapia envolve frequentemente largo espectro de agentes citotóxicos com muitos efeitos secundários e direccionamento limitado. Corroles são uma classe de macrociclos tetrapirrólicos que exibem propriedades citostáticas e citotóxicas diferenciais em linhas de células específicas, dependendo das identidades dos metálico quelado e grupos funcionais. O comportamento única de corroles funcionalizados para linhagens celulares específicas introduz a possibilidade de quimioterapia alvejado. Muitos medicamentos anti-cancerígenos são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo para transcrição de ARN na presença de inibidores conhecidos e potenciais. A avaliação dos produtos de ARN da reacção de transcrição por electroforese em gel e espectroscopia de UV-Vis fornece informações sobre as propriedades inibidoras de potenciais candidatos a fármacos anti-cancro e, com modificações para o ensaio, mais sobre o seu mecanismo de acção. Poucoé conhecido sobre o mecanismo molecular de acção de citotoxicidade corrole. Neste experimento, consideramos dois compostos corrole: gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Um ensaio de transcrição do RNA foi usado para examinar as propriedades inibidoras dos corroles. Cinco reacções de transcrição foram preparados: ADN tratado com actinomicina D, triptolido, Ga (tpfc), a uma tpfc [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01, respectivamente, e um controlo não tratado. As reacções de transcrição foram analisadas após 4 h utilizando electroforese em gel de agarose e a espectroscopia UV-Vis. Existe um claro inibição por Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide. Este ensaio de transcrição de ARN pode ser modificado para proporcionar mais detalhe mecanicista, variando as concentrações do complexo anti-cancro, o ADN, ou uma enzima polimerase, ou por incubação da polimerase do ADN ou com o complexes antes da transcrição de ARN; estas modificações se diferenciar entre um mecanismo envolvendo a inibição do ADN ou a enzima. A adição do complexo após a transcrição do RNA pode ser utilizado para testar se os complexos de degradar ou hidrolisar o RNA. Este ensaio também pode ser usado para estudar candidatos anticancerígenos adicionais.

RNA Transcrição avaliados qualitativamente por Agarose Gel de Eletroforese Electroforese em gel de agarose é utilizada para a imagem do ARN transcrito. O brometo de etídio fluorescência após ligação (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46, permitindo imagens de ARN. Faixas mais escuras no gel correspondem a maiores concentrações de ARN. Se a Actinomicina D, triptolido, ou qualquer complexo corrole inibe a transcrição de ARN, a...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition-gallium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K visualizações.  California Institute of Technology.  O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas. 

Vídeo: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualizando Proteínas e Complexos Macromoleculares por Negative EM Stain: Preparação de Grid para Aquisição de Imagem

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Bioengenharia

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform para testar as lentes de contato

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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