This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1. إعداد الدهون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الدهون المبلغ المطلوب في أنبوب الزجاج واضحة. أنت ترى. القولونية استخراج الدهون القطبي، ولكن معظم التراكيب الدهون يمكن استخدامها. إذا كانت الدهون هي في شكل مسحوق، و resuspend لهم في الكلوروفورم إلى تركيز من 20 ملغ / مل. تجفيف الدهون في RT تحت N 2 الغاز حتى يتبخر كل المذيبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والدهون في البنتان وجففها مرة أخرى وجود تدفق مستمر من الغاز N 2 لإزالة بقايا آثار من الكلوروفورم. الجاف حتى تبخرت كل المذيبات. بينما التجفيف، وتناوب بلطف الأنبوب بحيث يتم توزيع الدهون في فيلم موحدة تغطي ثلث السفلي من أنبوب بدلا من تشكيل كتلة كثيفة في الجزء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المخزن المؤقت إعادة تحتوي المنظفات (300 ملي بوكل، 50 ملي حمض الستريك، 25 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 4.5، 35 ملي CHAPS) لإذابة الدهون. استخدام المنظفات معتدل الأخرى لهذه الخطوة إذا كان البروتين هو متسامح سيئة لCHAPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspenد الدهون إلى الوضوح باستخدام sonicator حمام الماء. تزج الأنبوب في وسط sonicator باث الماء في أقصى قدر من السلطة وباختصار (30 ثانية-1 دقيقة) نبضات قصيرة (30 ثانية-1 دقيقة) مؤقتا. وينبغي أن تصبح الحل واضح. ملاحظة: درجة النهائية من الوضوح حققت تعتمد على تكوين الدهون المحددة المستخدمة. بعض الاختلاف دفعة إلى دفعة في هذه الخطوة، حتى بين الدهون متطابقة اسميا، ممكن أيضا. ومن المقرر أن تشتت الضوء من قبل الجزيئات الكبيرة في التعليق، والتي يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي الضباب المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الدهون معلق في RT 20-60 دقيقة. </li></ol> 2. تشكيل Proteoliposome ملاحظة: العديد من الاستراتيجيات التي يمكن أن تستخدم لادخال البروتين المنظفات تذوب في الجسيمات الشحمية. لCLC-EC1 غسيل الكلى يعمل بشكل جيد وبالتالي فهي طريقة اختيار 6،9،10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البروتين النقي إلى المطلوب البروتين إلى الدهون (P / L) نسبة (معبرا عنها ميكروغرام س<html> و البروتين / ملغ الدهون). اختيار نسبة P / L يعتمد على الغرض من التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الهدف هو تقييم النشاط من البروتين من الفائدة، وإعادة تشكيل في ارتفاع P / L&#39;الصورة لتعظيم إشارة، حيث أن كل الحويصلية تحتوي على نسخ متعددة من البروتين. لقياس النشاط و / أو معدل النقل الوحدوي من البروتين، وإعادة تشكيل في نظام التخفيف بواسون في انخفاض P / L&#39;الصورة، بحيث يكون لكل حويصلة تحتوي في المتوسط ​​1 البروتين. راجع الخطوة 7 و مناقشة لأكثر في عمق تحليل متى تستخدم كل نظام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد القيم المثلى P / L لمختلف الأنظمة، إجراء المعايرة كاملة من النشاط بوصفها وظيفة من تركيز البروتين 8،11-13. ومع ذلك، لأي البروتين التي الوزن الجزيئي (MW، أعرب في كيلو دالتون) وحدة نشطة هو معروف يمكن استخدام القيم L P / التالية كما تخمينات أولية: خريج &quot;/&gt; <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل البروتين والدهون الخليط في أنبوب غسيل الكلى قبل المبللة أو الكاسيت. وضع الجهاز غسيل الكلى في دورق يحتوي على 500-1،000x حجم المخزن المؤقت الدهون إعادة (أي 1 L عازلة لل1 مل من الدهون إعادة تعليق) تحت التحريك لطيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير عازلة 3-4 مرات على فترات&gt; 3 ساعة. في كل تغيير الحل، وغسل كاسيت / أنابيب والكأس مع الماء المقطر وملء كوب مع العازلة إعادة الطازجة. تشمل 1-2 O / N فترات لتغيير الحل. يعتمد العدد الدقيق ومدة التغيرات حل على الدهون الدقيق والمنظفات المستخدمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة الأخيرة هي كاملة، وإزالة الجسيمات الشحمية من السفينة غسيل الكلى، وقسامة لهم في أنابيب وفلاش تجميد لهم في السائل N 2 أو التجميد في -80 ° C. </li></ol> 3. تسجيل مجموعة المتابعة &lt;ص الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ملاحظة: تسجيل انشاء (الشكل 2A) ويتكون من مجلسين (اسطوانات مسطحة القاع، ~ 3-4 حجم مل)، والكلور - (انظر أدناه) الكهربائي، ودرجة الحموضة متر مع التناظرية أو الإخراج الرقمي الكهربائية، والتحويل الرقمي، وجهاز كمبيوتر مع برنامج الحصول المناسب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الكلور - القطب إلى متر الرقم الهيدروجيني، والإخراج للمتر الرقم الهيدروجيني إلى التحويل الرقمي التي يتم توصيلها إلى الكمبيوتر. وضع القطب المرجع في غرفة واحدة وسلك إعادة ترميز في الآخرين (الشكل 2B). ملاحظة: قطبية من الأسلاك هو الصحيح إذا ΔV كال (انظر الخطوة 6.4 و 7.2) موجبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع غرف على طبق من ذهب ضجة مع بقضيب في تسجيل غرفة (الشكل 1B). تأكد من أن بقضيب لا تلمس القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الدوائر باستخدام جسر أجار (الشكل 2B) (100 ملي بوكل و 2٪ الاغاروز). تخزين الجسور أجار في 100 ملي بوكل. </لى&gt; </ol> 4. إعداد الكلور - الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ غير عاملة القطب درجة الحموضة القديم و-possibly-. كسر طلاء الزجاج لتكشف تماما أسلاك الفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طلاء من الأسلاك الفضة باستخدام شفرة المشرط. تنظيف الأسلاك باستخدام كميات وفيرة من H 2 O وETOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تغطية مكان في محلول مشبع من FeCl 3 (أو التبييض) حتى الأسلاك مع معطف الظلام موحد للأجكل. </li></ol> 5. إعداد Unilamellar الحويصلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الليلة التي سبقت التجارب، تنتفخ 1 غرام من باستخدام Sephadex-50 حبات في 15 مل من العازلة الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) مع طيف والهز (لا يحرك) ل على الأقل 3 ساعة على RT قبل الاستخدام. كل تجربة تتطلب ~ 3 مل من الخرز منتفخة. الحفاظ على حبات منتفخة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أيام على الأكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الجسيمات الشحمية والذوبان في RT، صب في كل عمود ~ 3 ملتر من تورم G-50 الخرز. السماح لهم الجافة قبل تدفق الجاذبية في RT. هذا عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحويصلات unilamellar بواسطة البثق في proteoliposomes 11 مرة من خلال ميني الطارد باستخدام قطع 0.4 م تفلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عمود في أنبوب الجولة القاع من البلاستيك. تدور الأعمدة لإزالة حل الزائد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20-30 ثانية في 1،400 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل التدفق من خلال عمود مكان في 13 × 100 مم أنبوب زجاجي وإضافة 100 ميكرولتر من الحويصلات مقذوف إلى العمود. تدور العمود لمدة 1 دقيقة في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ~ 200 ميكرولتر من التدفق من خلال التي ستضاف إلى غرفة تسجيل في الخطوة 6.5. </li></ol> 6. الدفق القياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2 مل من 100 ملي بوكل في إشارة الغرفة (الأرض) و 1.8 مل من المخزن المؤقت الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) إلى غرفة تسجيل. عدم التوازن الاسموزي طفيف بين الداخليةوالحلول الخارجية لا يؤثر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل البرنامج الاستحواذ. السماح للخط الأساس تتوازن، وهذا قد يستغرق بضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد وصول إشارة خط الأساس مستقرة (والجسيمات الشحمية جاهزة والأعمدة الجافة)، بدء التسجيل (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من 10 ملي بوكل حل لمعايرة نظام (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الجسيمات الشحمية. قفزة صغيرة قد تكون واضحة بسبب إزالة كاملة من الكلور خارجي - من proteoliposomes (الشكل 3A). الانتظار حتى تستقر خط الأساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Valinomycin (1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل في ETOH) لبدء هروب رأس المال (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للهروب رأس المال مجراها وقته حتى أنه الهضاب (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) التي أعدت في المخزن المؤقت الخارجي على حل جميع الجسيمات الشحمية (الشكل 3A). إنهاء التسجيل. </li></ol> 7. البيانات Analysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير ملف التتبع من في شكل ASCII أو النص واستيراده إلى برنامج تحليل الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الجهد في النقاط التالية (الشكل 3A): في بداية التسجيل (V 0)؛ بعد إضافة نبض معايرة (V كال)؛ بعد إضافة الجسيمات الشحمية (V يبو)؛ في نهاية هروب رأس المال (V زعنفة)؛ بعد إضافة المنظفات (V TOT)؛ خط الأساس الفولتية بحيث V 0 = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معادلة نرنست-بلانك لتحديد القيمة التجريبية ل <img alt="المعادلة 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> عن طريق قياس <img alt="المعادلة 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> حيث المجلد كال هو حجم نبض المعايرة في ميكرولتر، 1،800 وحجم الغرفة في بداية أعربت التجربة في1؛ ل، [الكلور] كال / في هم الكلور - تركيزات نبض المعايرة والمخزن المؤقت الخارجي في ملي وΔV كال هو قفزة في بالسيارات قياسها بعد نبض المعايرة. ملاحظة: هذا التحديد التجريبي للα يخدم ثلاثة أغراض: أنه يضمن أن النظام يستجيب بشكل صحيح، ويقدم مقياسا لاتساق استجابة الصك بين التجارب وكذلك للتأكد من أن تم إجراء أية أخطاء في صنع الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيزات الكلور بعد كل خطوة على النحو التالي: <img alt="المعادلة 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="المعادلة 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="المعادلة 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> عامل 3/400 يأتي من التخفيف من 15 ميكرولتر معايرة النبض في الحجم النهائي 2،000 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CALCULيأكل من التغيرات في [الكلور] في كل خطوة، ΔCl يبو / الزعانف / طفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل V (ر) في الكلورين (ر) مع <img alt="المعادلة 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> تحديد مباشرة [الكلور] القيم في النقاط الحرجة ومقارنتها مع القيم المحسوبة باعتبارها الرقابة الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع التتبع بحيث يبو الكلور يختلط = 0 و الكلور يختلط TOT = 1 <img alt="المعادلة 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب دوام هروب رأس المال إلى المعادلة التالية: <img alt="المعادلة 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> حيث L هو معدل الكلور - تسرب أن يتم تحديد تجريبيا من خلال قياس الكلور - هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية خالية من البروتين أعدت في نفس الظروف وτ هو ثابت وقت العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الخامس، سرعة الأولية: <bص /&gt; <img alt="المعادلة 11" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq11.jpg" /> حيث يتم التعبير عن ΔCl زعنفة في millimolar وV هو حجم الغرفة في ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معدل النقل / تصرف <img alt="المعادلة 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> حيث p هو P / L، MW هو الوزن الجزيئي للمجمع نشط أعرب في كيلو دالتون </li></ol>

<ol>
	<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li><li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+and+faster:+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production.">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li><li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cells+to+improve+protein+expression.">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li><li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li><li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+a+CLC+Cl-/H++exchange+transporter+by+polyatomic+anions.">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li><li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-/H++exchange+transporter.">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li><li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li><li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+required+for+H(+)/Cl(-)+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter.">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li><li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2++activated+Cl-+channels.">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367 (2013).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters.">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li><li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters.">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li><li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++block+and+permeation+in+a+K++channel+of+known+structure.">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li><li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bern&#232;che, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H(+)/Cl(-)+exchanger.">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li><li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes.">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li><li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K++channel.">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li><li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl(-)/H(+)+antiporter.">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li><li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture.">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084 (2013).</li><li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K++channel.">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7 (2004).</li><li>Brohawn, S. G., del M&#225;rmol, ., J, R., MacKinnon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK,+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K++Ion+Channel.">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li><li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+slow+CLC+Cl-/H++antiporter+from+a+cyanobacterium.">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

وصفناها بروتوكول مفصلة لقياس الكلور - النقل بوساطة قنوات أنيون انتقائية المنقى أو النقل تشكيلها في الجسيمات الشحمية. كان المثال المستخدم في بدائيات النواة H + / CL - مبادل CLC-EC1. ومع ذلك، فإن منهجية يمكن تكييفه بسهولة لدراسة قنوات بوابات بواسطة بروابط <su...

في اثنين العقود الماضية القدرة على بإفراط وتنقية البروتينات النقل الغشاء قد زاد بشكل كبير: القنوات الأيونية، والآن تنقيته النقل الابتدائية والثانوية بشكل روتيني من النظم التعبير مغاير وكذلك المصادر الطبيعية. ويجري باستمرار تطوير مناهج جديدة لمراقبة التعبير، وتحسين وتسهيل استخراج وتعزيز الاستقرار من هذه البروتينات 1-5. وكانت هذه الاختراقات التكنولوجية دورا أساسيا في إحداث انفجار المعلومات الهيكلية المستوى الذري على بروتينات الغشاء الذي، بدوره، وتعزيز فهمنا للقواعد الهيكلية وظيفتها. في المقابل، فإن قدرتنا على تحقيق في الخصائص الوظيفية لبروتينات المنقى لا تزيد بنفس المعدل، حتى أنه في بعض الحالات ويرافق المعلومات الهيكلية عالية الدقة من خلال بيانات وظيفية نوعية، مما يحد من قدرتنا على اختبار كميا التنبؤات القائمة على بنية. وبالتالي، فإن التنطن من المقايسات الفنية الكمية وتعميم هو خطوة رئيسية نحو استجلاء هذه الأسس الميكانيكية للوظيفة البروتين الغشاء. نحن هنا وصف مقايسة هروب رأس المال التي يمكن استخدامها لتحديد كميا الخصائص الفنية الرئيسية لتنقية وإعادة تشكيل الكلور - القنوات والنقل. المبادئ الأساسية للمقايسة يمكن تعميمها على مجموعة متنوعة من أنظمة النقل، فضلا عن البروتينات غير نقل أيون. وأعيد الجسيمات الشحمية مع تنقية الكلور - قناة / النقل في وجود الكلور كبير - التدرج (الشكل 1A، B). CL - يبدأ هروب رأس المال من خلال إضافة لحامل الأيون للسماح لتدفق مكافحة أيون، في حالتنا K + حامل الأيون valinomycin، الذي إنتقل الجهد الذي أنشأه الكلور - التدرج وتعيين غشاء المحتملة الأولية إلى إمكانية التوازن K + 6،7. دون رانه حامل الأيون لا صافي الكلور كبير - يحدث هروب رأس المال، كما منعت من قبل جيل من إمكانات عبر الغشاء. وكميا وصف البيانات بواسطة معلمتين قابلة للقياس (الشكل 1C): τ، ثابت وقت الكلور - هروب رأس المال، وو 0، وجزء من الجسيمات الشحمية لا تحتوي على البروتين النشط. من τ وو 0 من الكلور الوحدوي - معدل النقل، وجزء من البروتينات النشطة والكتلة الجزيئية للمجمع نشط يمكن أن تستمد 8. ويتضح هنا باستخدام تقنية proteoliposomes تشكيلها مع CLC-EC1، وتتميز كذلك CLC من نوع H + / CL - مبادل من هيكل معروف وظيفة. وتعميم هذا الاختبار بسهولة إلى قنوات أو النقل مع مختلف الانتقائية الأيونية أو التي تعتمد على وجود التيار الكهربائي و / أو بروابط النشاط. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد ما إذا جزيئات صغيرة تؤثر بشكل مباشر على البروتين المعاد،ل quantitate آثار هذه المركبات وكيفية تكوين غشاء أو الكواشف-تعديل المادة الدهنية تؤثر على وظيفة من القنوات وشركات النقل تشكيلها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

وصفنا بروتوكول مفصلة وقوية لقياس الكلور - النقل بوساطة النقى CLC-EC1، وبدائيات النواة من نوع CLC H + / CL - مبادل، تشكيلها في الجسيمات الشحمية. ويرد التمثيل التخطيطي للتجربة في الشكل 3 Proteoliposomes تشكيلها مع النقى CLC-EC1 والتي تحتوي على الكلور عالية الدا?...

Watch this Scientific Journal Video about A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters at JoVE.com

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور<sup&gt; -</sup&gt; القنوات وأنظمة نقل

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K Views.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Video: A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

مقايسة تنحية نازعة لاكتات — طريقة بسيطة وموثوق بها لتحديد النشاط تنحية أوتوفاجيك الأكبر في خلايا الثدييات

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...