وأيد هذه الدراسة من قبل الوكالة الوطنية دي لا بحوث (مشروع ANR-2010-1535-بلان) وبمنحة من منطقة إيل دو فرانس (DIM-Malinf 110058).

1. إنتاج البروتين وتنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MexA، MexB من الزائفة الزنجارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل البلازميدات إيواء MexA وMexB الجينات في E. سلالة إنتاج القولونية (مثل C43 DE3). لوحة على LB أجار تستكمل المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة. اختيار مستعمرة واحدة لتطعيم وO / N preculture. في صباح اليوم التالي، تلقيح preculture في 1 لتر من LB وينمو بمعدل 37 درجة مئوية تحت الإثارة (240 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة قد وصلت إلى مرحلة الخلايا الأسي (OD 600 = 0.6-0.8) لحث مع IPTG 1 ملم. أداء الاستقراء لمدة 2-3 ساعة عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي (9،000 x ج لمدة 20 دقيقة) و resuspend في 30 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك 20 ملم، ودرجة الحموضة 8، كلوريد الصوديوم 150 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية (10،000 رطل، 4 تمريرة). تجاهل الخلايا غير منقطعة والهيئات إدراج بواسطة الطرد المركزي في 9،000 x ج لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأغشية بيليه 1 ساعة على 100،000 XG وصesuspend كل بيليه في 30 مل مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 20٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين الكلي الغشاء باستخدام مقايسة اللونية BCA وذوبان الأغشية O / N مع 2٪ مالتوزيد دوديسيل (DDM) في الحجم النهائي يتحدد بحيث المنظفات: البروتين هو 1:1.5 (ث / ث). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة لتجاهل مواد غير solubilized والمجمعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طاف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الراتنج النيكل (تنقية MexA) أو الراتنج الكوبالت (تنقية MexB) معايرتها مع مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الراتنج في عمود فارغ. جمع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع 50 مل من مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 20٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪، ثم مع 25 مل من مكرر تريس 10 ملي درجة الحموضة 6، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل عrotein مع 20 مل مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، إيميدازول 300 ملم، 500 ملم كلوريد الصوديوم، DDM 0.2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز البروتين مع جهاز الترشيح الفائق وصولا الى 3 مل والحمل على عمود تحلية معايرتها مع العازلة خالية من إيميدازول. قبل إعادة (انظر أدناه)، نابذة فائقة السرعة البروتينات solubilized (100،000 x ج لمدة 20 دقيقة) للتخلص من الدهون والبروتينات unsolubilized. ثم تركيز البروتين مرة أخرى إلى 0.3 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرثومي من Halobacter salinarium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا salinarium Halobacter تحت إضاءة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 يوما في المتوسط ​​النمو السائلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 4 M، MgSO 4 150 ملم، 10 ملم سترات، بوكل 30 ملي، خلاصة الخميرة 5 جم / لتر، وببتون 5 ز / L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل الخلايا عن طريق dialyzing ضد الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية غشاء الأرجواني على 30-40٪ (ث / ت) التدرج السكروز (100،000 x ج لمدة 17 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان تعليق الغشاء مع 2٪ octylglucoside لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (حجم للذوبان من أجل resuspend والغشاء في 2:1 (ث / ث) المنظفات: نسبة البروتين). ويقدر تركيز BR solubilized باستخدام ε (570 نانومتر) = 54،000 M -1 سم -1. قبل إعادة (انظر أدناه)، نابذة فائقة السرعة وBR solubilized (100،000 x ج لمدة 20 دقيقة) للتخلص من الدهون والبروتينات unsolubilized. ملاحظة: يتم إثراء الأغشية الأم طبيعيا في غرفة واحدة حتى لا حاجة لمزيد من التنقية. </li></ol></li></ol> 2. إعداد Proteoliposomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل الحويصلية: وضع 400 ميكرولتر من DOPC يذوب في الكلوروفورم (25 ملغ / مل) في كوب زجاجي وإضافة 1.5 ملغ من الكولسترول المخزنة على شكل مسحوق. تجفيفها قبل التلاعب تحت البخار من النيتروجين أو فراغ لا يقل عن 1 ساعة في كوب زجاجي. وDOPC: نسبة الكوليسترول في الدم هو المولي 3.3:1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن جفت، هيدرات الدهون مع 1 مل من HEPES 25 ملي درجة الحموضة 7،K 2 SO 4 100 ملم، 2 MgCl 2 مم، 2 مم pyranine. يجب أن يظهر تعليق عكر في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين المحلول لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يصوتن لمدة 10 دقيقة في 40 W 30 ثانية مع نبض، 30 دورات وقفة ثانية في RT. يجب أن تظهر واضحة التعليق في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على السكان monodisperse من الجسيمات الشحمية، تنفيذ دورتين من قذف ولكل دورة، وتمرير تعليق الحويصلية من خلال تصفية 11X على الأقل. في الجولة الأولى، استخدم غشاء حجم المسام من 200 نانومتر وللدورة الثانية، استخدم غشاء حجم المسام من 100 نانومتر. قياسات تشتت الضوء الحيوي لا يمكن أن يؤديها في هذه الخطوة للتحقق من تجانس التعليق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج البروتين المبدأ: غشاء بروتينات يمكن تشكيلها في الجسيمات الشحمية بفضل تأثير solubilizing المنظفات. يتم تحضين الجسيمات الشحمية المنظفات solubilized مع بروتين الغشاء solubilized المنظفات وتشكيل عيتم تشغيل roteoliposomes قبل التخلص السريع من المنظفات مع الخرز البوليسترين 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 28 ملغ من تريتون X-100 (0.56٪ النهائي)، واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية (درجة حرارة الإذابة يمكن تكييفها للبروتين قيد الدراسة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البروتين المنظفات solubilized (BR، MexB وMexA) إلى الجسيمات الشحمية solubilized واحتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة البروتينات إلى تعليق الحويصلية solubilized في النسب التالية (ث / ث): الدهون / MexB = 20، MexB / MexA = 2.5، والدهون / BR = 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الخرز البوليسترين في 30:1 الخرز: نسبة المنظفات (ث / ث، بالنظر إلى الوزن الكلي للالمنظفات، بما في ذلك المنظفات وأضاف مع البروتينات المنقى)، واحتضان 5 ساعة، في الظلام (بسبب BR) في RT تحت لطيف التحريك. قبل هذا الإجراء، وتفعيل biobeads مع الميثانول والإيثانول الحضانة ويغسل بالماء على نطاق واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البروتين proteoliposomes وركائز حرة باستخدام PD-10عمود تحلية معايرتها مع HEPES 25 ملي درجة الحموضة 7، K 2 SO 4 100 ملي وMgCl 2 2 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين proteoliposomes عند 18 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم فعالية إعادة على التدرج السكروز. للتأكد من أن كل من MexB وBR تم تشكيلها في الجسيمات الشحمية، وتنقية التعليق proteoliposome على التدرج السكروز متقطع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسوية بلطف proteoliposomes على التدرج خمس طبقات من السكروز (60٪، 20٪، 10٪، 5٪، و 2.5٪، ث / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة لمدة 17 ساعة على 100،000 x ج (مع الحد الأدنى من تسارع وتباطؤ معدلات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بعناية مختلف الكسور التدرج (وخصوصا الواجهات بين كل طبقة من السكروز) وتحليلها على SDS-PAGE (10٪) باستخدام Coomassie تلطيخ أو النشاف الغربية. تم العثور على البروتينات تجميعها على الجزء السفلي من الأنبوب، في حين تم العثور على nonincorporated، البروتينات المنظفات solubilized في أعلىالأنبوب. تم العثور على Proteoliposomes والجسيمات الشحمية في واجهات السكروز التي تتوافق مع كثافتها الذاتية. يتم استرداد الليبوزومات فارغة أبعد تصل في الانحدار من proteoliposomes. </li></ol></li></ol> 3. قياس مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قياسات مضان في 25.0 درجة مئوية باستخدام الطيفي السماح لقياس ثنائي الطول الموجي (مصباح اكس، 150 W). فترات إضاءة بديلة (لتنشيط BR مع موجات الإثارة / الانبعاثات من 550 نانومتر / 550 نانومتر) والقياسات مضان مع موجات الإثارة / الانبعاثات من 455 نانومتر / 509 نانومتر لمدة 2 ثانية لقياس مضان pyranine. تعيين الإثارة وانبعاث عرض الموجات إلى 5 نانومتر. إجراء القياسات في وجود 50 نانومتر valinomycin لمنع تشكيل غشاء عكس ΔΨ المحتملة. ملاحظة: في الواقع، لأن مضخات البروتونات BR، وهناك اتهامات أكثر إيجابية داخل الحويصلية من الخارج. هذه التهمةيمكن التخلص منها باستخدام التدرج valinomycin، وهو K + حامل الأيون انتقائية. مرة واحدة تضاف إلى valinomycin الجسيمات الشحمية تعليق، كما جزيء مسعور، وسوف تضاف الى الغشاء الحويصلية، نقل سلبي K +، وبالتالي تبديد غشاء ΔΨ المحتملة. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

وصفنا إجراء إعادة تصميم لمعايرة غشاء النقل البروتين. بمجرد إنشائها، فإن الإجراء إعادة البروتين يؤدي إلى القياسات التي هي استنساخه جدا. ومع ذلك، فإن الظروف الدقيقة لإعادة تشكيل البروتين تختلف من البروتين واحدة إلى أخرى. يجب توخي الحذر كثيرا في تحقيق الاستفادة المثلى من المعلمات التالية: ط) جودة تنقية (النقاء وعدم وجود مواد مجمعة)؛ ب) كفاءة الخطوة المنظفات solubilizing (عندما يكون ذلك ممكنا، ينبغي تفضيل منخفضة المنظفات CMC لأنها أسهل للحصول على التخلص من)؛ ج) الامتزاز من المنظفات (هو على سبيل المثال من الممكن الجمع بين استخدام الخرز البوليسترين مع خطوة لغسيل الكلى ولكن هذا قد يؤثر على معدل الامتزاز، معلمة حرجة للنشاط اللاحقة من البروتين، انظر المرجع [ 9])؛ د) إعادة الدهن (الطبيعة الكيميائية للدهون، والدهون إلى نسبة البروتين، وجود amphiph إضافيةديزيل هي المعايير الضرورية التي يجب أن تكون متنوعة والأمثل). في درجة الحرارة وفترة حضانة بالإضافة إلى ذلك تؤثر على كل هذه القضايا. مراقبة الجودة وبالتالي البدائية في كل خطوة من إجراء إعادة. من وجهة النظر هذه، تشتت الضوء هي تقنية مريحة للغاية لأنها سريعة، غير تدميري، وأنه لا يتطلب سوى 20 ميكرولتر من عينة في التركيز على مجموعة مكرومولي. مرة واحدة تتشكل proteoliposomes، والتدرج السكروز هو أيضا من مساعدة كبيرة لأنه يفتح الطريق نحو التحقق المنهجي من إعادة: النوعية (هو البروتين جزءا لا يتجزأ من الواقع في غشاء الحويصلية)، وكذلك الكمية (كم من البروتين في الحويصلية واحد). وهذا الأخير سوف تعالج عن طريق قياس بالضبط البروتين والدهون تركيزات. لا تعتمد على مقايسة لدينا المعايرة الركيزة نفسها وهذا يتجنب الاعتبارات بعدم الارتياح بشأن احتمال نشر السلبي مصطنعة من<html> الجزيء بسبب تقسيم مسعور في الأغشية. مقايسة يستغل خصائص pyranine باعتباره التحقيق موثوقة والكمية لرصد التغيرات ودرجة الحموضة. نتائجنا تتفق مع النتائج التي تم الحصول عليها مع إجراء آخر حيث تم إجراء تشكيل بروتون التدرج باستخدام valinomycin 10، ولكن لأنها تتيح التدرج أكثر قوة واستنساخه 11. بالإضافة إلى ذلك، التدرج بروتون يمكن ضبطها على وجه التحديد، وذلك ببساطة من خلال تغيير التركيز من المخزن المؤقت (لمزيد من التفاصيل انظر Verchere وآخرون 12). في الإجراء يتم إجراء قياس التحكم الأول في غياب الركيزة (هذا يتيح الوصول إلى النشاط السلبي من البروتين). ثم يتم قياس البروتين غشاء نقل النشاط الفعلي بعد إضافة الركيزة في نفس كفيت. هذا هو حقا أحد الأصول لأن التجربة يمكن اعتباره، نتائج حقيقية، وغير غامضة الناجم عن الركيزة. الأنف والحنجرة &quot;&gt; بروتوكول يمكن أن تتكيف مع إنتاجية عالية ومتوسطة (على سبيل المثال 96 بئرا القياسات) أتمتة بسبب إلقاء الضوء على عينة يطلق فإن رد الفعل. أتمتة والموازاة تتمثل في إعداد دفعة كبيرة من proteoliposome، والاستغناء مأخوذة في 96 الآبار لوحة. ركائز (وكذلك مثبطات ممكن) ستضاف فيما بعد وبعد الحضانة في الظلام لمدة 45 دقيقة لوحة سيتعرض للدورات قياس مضان الإضاءة / pyranine على قارئ صفيحة ميكروسكوبية. للحصول على معلومات إضافية بشأن البروتوكول، مدعوون القراء لقراءة Verchere آخرون 12،13

بروتينات الغشاء لا يتجزأ تمثل ما يصل إلى 30٪ من الجينات المشفرة في الجينوم حقيقية النواة. إلا أنهما يشتركان أدوار محورية مثل حفظ بوابة (مستقبلات)، ونقل المواد المغذية، الأيونات أو المركبات الضارة (النقل) أو الحفاظ على نفاذية الغشاء عبر طبقات ثنائية (قنوات) بين جميع الخلايا الحية 1. مضخات هروب رأس المال دورا رئيسيا في المقاومة ضد العلاج بالمضادات الحيوية 2. في البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية، والتي هي محمية من قبل الغشاء الخارجي، ويتم تنظيم نقل هروب رأس المال كما نظم الثلاثي حيث MexB، مضخة هروب رأس المال الموجود في الغشاء الداخلي، يعمل جنبا إلى جنب مع MexA، وهو بروتين محيط بالجبلة، وOprM، و قناة الغشاء الخارجي. يعمل بروتين الغشاء الداخلي حشوية كما مضخة تعتمد على الطاقة مع خصوصية الركيزة واسعة. يعمل بروتين الغشاء الخارجي باعتباره porin بينما هو ثلث الموجود في الفضاء محيط بالجبلة ويعتقد لتحقيق الاستقرار في مجمع كامل <sتصل&gt; 3. في ما يلي، ونحن نركز على تصميم مقايسة وظيفية للجمعية MexA MexB. التي تراكمت لديها المعلومات الهيكلية على مدى 5 سنوات الماضية وذلك بفضل تقرير الأشعة السينية من AcrB البروتين مثلي من الإشريكية القولونية 4-7. على الرغم من أنه من الواضح أن مهمة لزوجين هذه المعلومات مع البيانات الديناميكية والحركية، وتصميم مقايسة وظيفية لهذا نقل هو التحدي الحقيقي 8. في الواقع، لا بد من الحفاظ على غشاء بروتينات في بيئة الغشائي ويجب المحافظة على حجرة مغلقة لنقل اتجاهي من الركيزة التي ينبغي تحقيقها. تم عرض إعادة تشكيل بروتينات الغشاء في proteoliposomes على نطاق واسع، واستعرضت (انظر ريغو وليفي 9). تسمح هذه البروتوكولات لرصد البروتينات الغشاء النشاط، على سبيل المثال عن طريق اتباع ركائز عبر الغشاء الحويصلية. في هذه الحالة تنشأ من القيود علىvailability من ركائز المعايرة (الفلورسنت، والإشعاعية، الخ.) وعن حقيقة أن في كثير من الأحيان هذه هي ركائز مسعور وتميل لعبور الأغشية بغض النظر عن وجود نقل. كبديل، يمكن للمرء متابعة التغيرات الطيفية من صبغة الإبلاغ حساسة للتغيرات الكيميائية التي تحدث نتيجة النقل. كما ذكر أعلاه، البروتونات تنشيط النقل عبر MexB. وبالتالي، خيارا ذات الصلة لرصد التغيرات الطيفية من صبغة حساسة لدرجة الحموضة التقارير لمتابعة تغيرات درجة الحموضة بسبب النقل الركيزة يحركها البروتون. اختيار صبغة الفلورسنت يتجنب أي آثار مصطنعة نظرا لطبيعة مسعور من الركيزة. وثمة صعوبة أخرى هي جيل من التدرج بروتون. عدة بروتوكولات يمكن العثور عليها في الأدب. فيما بينها، واستخدام تقنية valinomycin على نطاق واسع ولكن أظهرنا أنه مملة لأداء 10-11. وعلاوة على ذلك فمنلا استنساخه وليس عكسها. نحن لجأت الى استخدام جرثومي (BR)، وضوء تنشيط مضخة البروتون من Halobacter salinarium، وسلبية الغرام البحرية تلزم archaeon الهوائية المحبة للملوحة. وcoreconstituted هذا البروتين في الجسيمات الشحمية مع MexB، وعند الإضاءة، ومضخات البروتونات داخل غرفة واحدة من الجسيمات الشحمية ويخلق ΔpH (الحمضية داخل) البروتين التي يحتاجها لنقل الركيزة 12-13 بالتالي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

هناك حاجة العلمية الناشئة عن أدوات موثوقة لرصد غشاء النقل البروتين. نقدم منهجية تؤدي إلى إعادة تشكيل مضخات هروب رأس المال من البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية في بيئة بيوميمتيك التي تسمح لإجراء تحقيق دقيق لنشاطهم النقل. يتم استيفاء ثلاثة شروط مسبقة: تحاوز في بيئة شحمي، استخدام مؤشر ذات الصلة للنقل، وتوليد التدرج بروتون. يتم إعادة تشكيل غشاء نقل البروتين في الجسيمات الشحمية جنبا إلى جنب مع جرثومي، وضوء تنشيط مضخة البروتون الذي يولد التدرج بروتون الذي هو قوي وكذلك عكسها والانضباطي. واستخلص من نشاط البروتين من اختلافات درجة الحموضة التي تحدث داخل الحويصلية، وذلك باستخدام pyranin، التحقيق الفلورسنت التي تعتمد على درجة الحموضة. وصفنا خطوة بخطوة الإجراء حيث تنقية البروتين غشاء، وتشكيل الحويصلية، البروتين إعادة، والنقل وnalysis يتم معالجتها. على الرغم من أنها تم تصميمها خصيصا لنقل التجمع الوطني الديمقراطي، يحتمل أن تتكيف الأساليب المذكورة للاستخدام مع أي نقل البروتين غشاء أخرى تنشط بها التدرج بروتون.

يتكون فحص رصد pyranine مضان بوصفها وظيفة من الوقت في حين يتم إنشاء التدرج بروتون. لهذا الغرض، يتعرضون بدلا من العينات لإضاءة (وبالتالي ضخ البروتون بواسطة BR يتم تشغيل) ومن ثم إلى مضان القياس باستخدام الإثارة وانبعاث موجات من pyranine (λ = 455 نانومتر السابقين وλ = 509 نانومتر م). ويبين الشكل 1 عنصر تحكم تم الحصول عليها مع ممثل الفحص، في غياب MexA / MexB، والتحقق من أن التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR هو عكسها. بعد دورة واحدة من تحمض، يتم الاحتفاظ proteoliposomes في الظلام لمدة 45 دقيقة من أجل أن BR لوقف ضخ البروتونات (البروتونات منتشر ببطء وبشكل سلبي عبر طبقات ثنائية الدهون التالية التدرج تركيزهم). بعد هذا الوقت الانتعاش، وتفعيل BR هو ممكن، وذلك ببساطة عن طريق إلقاء الضوء على نفس التعليق مرة أخرى. الرقم 2يتوافق مع قياس النقل الفعلي. A السيطرة السلبية مع الجسيمات الشحمية الحرة البروتين يظهر أنه، كما هو متوقع، ودرجة الحموضة هو ثابت على الإضاءة (أرقام 2A و 2B، والدوائر البرتقالية). ومع ذلك، proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الأغشية لم ضخ البروتون، وبالتالي فإن درجة الحموضة داخل النقصان الحويصلية ويتم بناء التدرج مستقرة (أرقام 2A و 2B والساحات الأرجواني). مثلثات رمادي وأحمر الماس (الشكل 2A) تمثل درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة وMexB، في وجود أو في غياب هويشت 33342، على التوالي. نلاحظ النشاط الركيزة مستقلة حيث يتبدد التدرج بروتون فقط جزئيا MexB مكافحة النقل. ونحن نعزو هذه الملاحظة إلى النشاط القاعدية من MexB. من أجل اختبار تأثير MexA على نشاط MexB، وأضيف إلى إعادة MexA، أولا في غياب أي الركيزة ( <stرونغ&gt; الشكل 2B، والماس الازرق). مرة أخرى، يتبدد التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR جزئيا فقط. ويتحقق قياس النقل الفعلي على نفس العينة. مسبقا، يجب أن يكون reinitialized التدرج بروتون ويجب أن يضاف الركيزة في التعليق من أجل الوصول إلى موقع ملزمة لها في البروتين. لهذا الغرض وحضنت تعليق في الظلام في وجود الركيزة لمدة 45 دقيقة. عند إضاءة لاحقة، يمكن للمرء أن يرى أن التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR الآن تبدد تماما من MexAB (الشكل 2B، مثلثات خضراء)، نتيجة لنقل الركيزة بواسطة مضخة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . الرقم 1 عكس اتجاه التدرج بروتون بناها الإضاءة BR: Pyranine فلوريداuorescence من proteoliposomes BR تقاس بوصفها وظيفة من الوقت. من 0-15 دقيقة، BR مضخات البروتونات نتيجة لتفعيل الضوء. من 15-60 دقيقة، ويتم تحضين proteoliposomes في الظلام، وخلال هذا الوقت، والبروتونات تتحرك بشكل سلبي من الجسيمات الشحمية حتى درجة الحموضة ودرجة الحموضة intravesicular extravesicular متساوون. من 60-75 دقيقة، BR لا تزال الوظيفية ومضخات البروتونات على الإضاءة. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . الرقم 2 النقل مقايسة: pyranine مضان، وتحويلها إلى تغيرات الرقم الهيدروجيني المقابلة، بوصفها وظيفة من الوقت A) درجة الحموضة داخل الجسيمات الشحمية التحكم (دوائر البرتقال)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الغشاء (المربعات الأرجواني)؛ درجة الحموضة في الداخل. من proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB في الغشاء دون هويشت 33342 (د الحمراءiamonds)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة وMexB في الغشاء مع هويشت 33342 (مثلثات الرمادي) B) درجة الحموضة داخل الجسيمات الشحمية التحكم (دوائر البرتقال)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الغشاء (المربعات الأرجواني)؛ درجة الحموضة داخل من proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB MexA في الغشاء دون هويشت 33342 (الماس الأزرق)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB MexA في الغشاء مع هويشت 33342 (مثلثات خضراء).

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

نقدم بروتوكول للتحقيق في المختبر المضخات هروب رأس المال من الزائفة الزنجارية. هذا البروتوكول يسمح لتوليد قوية، عكسها، والانضباطي التدرج بروتون داخل الغشاء الحويصلية، وبالتالي يجب أن تكون قابلة للتكيف مع أي بروتين الغشاء تنشيط من قبل قوة protomotive.

في المختبر التحقيق في هروب رأس المال مضخة MexAB من الزائفة الزنجارية

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K Views.  CNRS & Université Paris Descartes.  نقدم بروتوكول للتحقيق في المختبر المضخات هروب رأس المال من الزائفة الزنجارية. هذا البروتوكول يسمح لتوليد قوية، عكسها، والانضباطي التدرج بروتون داخل الغشاء الحويصلية، وبالتالي يجب أن تكون قابلة للتكيف مع أي بروتين الغشاء تنشيط ?...

Video: In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

التصوير MALDI الكتلة الطيفي للتحقيق في المستقلبات في<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; الجذر العقيدات

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

تزامن<em&gt; العنيقاء Crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

انقباض القياسات على العضلات الحليمية معزولة للتحقيق في القلب Inotropy في الفئران

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

تحسين دقة التقييم السيتومتري للتدفق لإمكانات الغشاء الميتوكوندريا في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف من خلال تثبيط مضخات Efflux

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

التحقيق في آلية نقل الزنك في خلايا الثدييات باستخدام مقايسة FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تنظيم الزنك الخلوي من خلال وظائف ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...