This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1. הכנה ליפידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot שומני כמות הרצויה לתוך צינור זכוכית שקוף. השימוש E. תמצית coli קוטב שומנים בדם, אבל רוב יצירות שומנים ניתן להשתמש. אם השומנים הם בצורת אבקה, resuspend אותם בכלורופורם לריכוז של 20 מ&quot;ג / מיליליטר. ייבש את השומנים בRT תחת N 2 גז עד שכל הממס התאדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השומנים בפנטן ולייבש אותו שוב זרם יציב של הגז N 2 כדי להסיר עקבות שאריות של כלורופורם. יבש עד שכל הממס התאדה. בעוד ייבוש, בעדינות לסובב את הצינור כך שהשומנים מופץ בסרט אחיד המכסה את השליש התחתון של הצינור ולא מסה צפופה ויוצרת בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את חומר הניקוי המכיל חיץ הכינון מחדש (300 מ&quot;מ KCl, 50 חומצת לימון מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ K 2 4 HPO, pH 4.5, 35 מ&quot;מ בחורים) לפזר את השומנים. להשתמש בחומרי ניקוי עדינים אחרים בשלב זה אם החלבון הוא גרוע סובלני לבחורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspenד השומנים לבהירות באמצעות sonicator אמבט מים. לטבול את הצינור במרכז האמבטיה sonicator מים בכוח מרבי בפולסים קצרים (30 דקות שניות-1) עם (דקות שניות-1 30) קצרות עוצר. הפתרון צריך להיות ברור. הערה: התואר האחרון של בהירות השיג תלויה בהרכב השומנים הספציפי בשימוש. איזו וריאציה בשלב זה, אצווה לתצווה אפילו בין שומנים להלכה זהים, הוא גם אפשרית. האובך שיורית הוא עקב פיזור אור על ידי חלקיקים גדולים בהשעיה, אשר ניתן להסירו על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שומני resuspended ב RT עבור 20-60 דקות. </li></ol> 2. כינונה Proteoliposome הערה: מספר אסטרטגיות יכולה להיות מועסקות על מנת להכניס את חלבון אבקת-solubilized ליפוזומים. לCLC-ec1 דיאליזה עובדת היטב, ולכן השיטה של בחירה 6,9,10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את החלבון המטוהר לחלבון הרצוי לשומנים בדם (P / L) יחס (באו לידי ביטוי במיקרוגרם o<html> f חלבון / מ&quot;ג שומנים בדם). הבחירה של יחס P / L תלויה במטרת הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המטרה היא להעריך את הפעילות של החלבון של עניין, מחדש בP הגבוה L&#39;s על מנת למקסם את / האות, כמו כל liposome מכיל מספר עותקים של החלבון. כדי לכמת את הפעילות ו / או שיעור תחבורה אחיד של החלבון, מחדש במשטר דילול Poisson בP הנמוך / L&#39;s, כך שכל שלפוחית ​​מכילה חלבון על 1 ממוצע. ראה שלב 7 ודיון ליותר בניתוח המעמיק של מתי להשתמש בכל משטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את ערכי P / L אופטימליים למשטרים השונים, לבצע טיטרציה של הפעילות מלאה כפונקציה של ריכוז חלבון 8,11-13. עם זאת, לכל חלבון שהמשקל המולקולרי (MW, בא לידי ביטוי בKDA) של היחידה הפעילה ידוע ערכי L / P הבאים יכולים לשמש כguesstimates ראשוני: pg &quot;/&gt; <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החלבון ותערובת שומנים בצינור דיאליזה טרום רטוב או קלטת. מניחים את מכשיר הדיאליזה בכוס המכילה 500-1,000x היקף חיץ הכינון מחדש שומנים (כלומר, חיץ L 1 ל1 מיליליטר של resuspension שומנים בדם) תחת ערבוב עדין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ שינוי 3-4 פעמים במרווחים&gt; 3 שעות. בכל החלפת פתרון, לשטוף את הקלטת / צינורות ואת הכוס עם מים מזוקקים ולמלא את הכוס עם חיץ הכינון מחדש טרי. כולל 1-2 O מרווחי N / לשינוי הפתרון. המספר ומשך הזמן המדויק של שינויי הפתרון תלוי בשומנים המדויקים וחומרי הניקוי המשמשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב האחרון הוא מלא, להסיר את יפוזומים מספינת הדיאליזה, aliquot אותם בצינורות ופלאש להקפיא אותם בנוזל N 2 או הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. הקלטת Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה: הגדרת הקלטה (איור 2 א) מורכב משני תאים (צילינדרי תחתית שטוחה, ~ 3-4 מיליליטר נפח), Cl - (ראה להלן) אלקטרודה, מטר pH עם אנלוגי או פלט דיגיטלי חשמל, digitizer, ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את Cl - אלקטרודה למטר pH, הפלט של מטר pH לdigitizer אשר מחובר למחשב. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות בחדר אחד וחוט הקידוד מחדש באחר (איור 2). הערה: הקוטביות של החוטים נכונה אם ΔV קאל (ראה שלב 6.4 ו -7.2) הוא חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים על צלחת ומערבבים עם בר ומערבב בחדר ההקלטה (איור 1). ודא שהבר והמערבב לא נוגע באלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התאים באמצעות גשר אגר (איור 2) (100 מ&quot;מ KCl ו -2% Agarose). אחסן את הגשרים אגר ב100 מ&quot;מ KCl. </li&gt; </ol> 4. הכנת Cl - אלקטרודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח אלקטרודת תפקוד שאינו ישנה ו-possibly-. לשבור את ציפוי הזכוכית כדי לחשוף את חוטי הכסף לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הציפוי מחוטי הכסף באמצעות להב סכין מנתחים. נקה את החוטים באמצעות כמויות עצומות של H 2 O וEtOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בתמיסה רוויה של FeCl 3 (או אקונומיקה) עד חוטים מכוסה במעיל כהה אחיד של AgCl. </li></ol> 5. הכנת Unilamellar שלפוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה שלפני הניסויים, להתנפח 1 גרם של Sephadex G-50 חרוזים ב 15 מיליליטר של חיץ חיצוני (1 מ&quot;מ KCl, 150 מ&quot;מ K 2 SO 4, חומצת לימון 25 מ&quot;מ, pH 4.5) עם רעד עדין (לא לעורר) ל לפחות 3 שעות בRT לפני השימוש. כל ניסוי דורש ~ 3 מיליליטר של חרוזים נפוחים. שמור את חרוזים הנפוחים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לכל היותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בעוד ליפוזומים הם מפשירים בRT לשפוך בכל עמודה ~ 3 מ &#39;l של G-50 חרוזים נפוחים. לתת להם להתייבש על ידי זרימת כוח הכבידה בRT; זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלפוחית ​​unilamellar באמצעות משייכת proteoliposomes 11 פעמים באמצעות מיני-Extruder באמצעות חתך 0.4 מ &#39;טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור בצינור עגול תחתית פלסטיק. ספין העמודות כדי להסיר פתרון עודף. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות ב1,400 XG בצנטריפוגה קלינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זורק זרימת דרך, עמודת מקום בצינור זכוכית 13 x 100 מ&quot;מ ולהוסיף של שלפוחית ​​extruded 100 μl לעמודה. ספין עמודת דקות 1 ב XG 500 בצנטריפוגה קלינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ~ 200 μl של זרימה דרך שיתווסף לתא ההקלטה בשלב 6.5. </li></ol> 6. בזרימת מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 מיליליטר של 100 מ&quot;מ KCl בהתייחסות הקאמרית (קרקע) ו -1.8 מיליליטר של החיץ החיצוני (1 מ&quot;מ KCl, 150 מ&quot;מ K 2 SO 4, 25 חומצת לימון מ&quot;מ, pH 4.5) לתא ההקלטה. חוסר האיזון האוסמוטי הקל בין הפנימיופתרונות חיצוניים אינו משפיעים על </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תכנית הרכישה. בואו הבסיס לאזן, זה עלול לקחת כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהאות מגיעה לבסיס יציב (ליפוזומים מוכנים ועמודות ייבוש), להתחיל בהקלטה (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של פתרון מ&quot;מ KCl 10 לכייל את המערכת (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליפוזומים. קפיצה קטנה עשויה להיות גלויה בשל ההסרה חלקית של Cl החיצוני - מproteoliposomes (איור 3 א). חכה עד תחילת המחקר מייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Valinomycin (1 μl ב1 מ&quot;ג / מיליליטר בEtOH) ליזום בזרימת (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזרימה מיצתה את עצמו הזמן עד שהוא מישורים (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) שהוכן במאגר החיצוני לפזר כל יפוזומים (איור 3 א). לסיים את ההקלטה. </li></ol> 7. נתוניםnalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את קובץ זכר בפורמט ASCII או טקסט ולייבא אותו לתכנית הניתוח של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את מתח בנקודות הבאות (איור 3 א): בתחילת ההקלטה (V 0); לאחר תוספת של דופק הכיול (V cal); לאחר תוספת של יפוזומים (שאיבת V); בסופו של הזרימה (סנפיר V); לאחר תוספת של חומרי ניקוי (tot V); Baseline המתחים כך שV 0 = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשוואת נרנסט-פלאנק כדי לקבוע את הערך הניסיוני של <img alt="משוואה 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> על ידי מדידה <img alt="משוואה 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> איפה כרך קאל הוא הנפח של דופק הכיול בμl, 1,800 הוא קאמרי הנפח בתחילת הניסוי בא לידי ביטוי ב1; l, [Cl] קאל / בהוא Cl - ריכוזים של דופק הכיול ולמאגר החיצוני במ&quot;מ וΔV cal הוא הקפיצה בmV נמדדה לאחר דופק הכיול. הערה: קביעה אמפירית זה של α משרתת שלוש מטרות: הוא מבטיח כי המערכת מגיבה כראוי, מציעה מידה מסוימת של העקביות של התגובה של המכשיר בין ניסויים, כמו גם לבדוק שאין טעויות נעשו בהתהוות הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוזי Cl לאחר כל שלב באופן הבא: <img alt="משוואה 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="משוואה 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="משוואה 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> הגורם 3/400 מגיע מהירידה בשיעור דופק כיול 15 μl לתוך הנפח הסופי 2,000 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calculאכלתי את השינויים ב[ Cl] בכל שלב, שאיבת ΔCl / סנפיר / tot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת V (t) בCl (t) עם <img alt="משוואה 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> ישירות לקבוע את הערכים [Cl] בנקודות הקריטיות ולהשוות אותם לערכים מחושבים כבקרה פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את העקבות כך ששאיבת rel = 0 Cl וCl rel tot = 1 <img alt="משוואה 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את מהלך הזמן בזרימת למשוואה הבאה: <img alt="משוואה 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> כאשר L הוא שיעור Cl - הדליפה שנקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת Cl - זרימה מיפוזומים ללא חלבון מוכן באותם תנאים וτ הוא מתמיד של התהליך הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב v, המהירות ההתחלתית: איפה סנפיר ΔCl בא לידי הביטוי בmillimolar וV הוא הנפח של החדר בμl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שיעור תחבורה / מוליכות <img alt="משוואה 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> איפה p הוא P / L, MW הוא המשקל המולקולרי של המתחם הפעיל בא לידי ביטוי בkDa </li></ol>

<ol>
	<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li><li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+and+faster:+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production.">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li><li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cells+to+improve+protein+expression.">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li><li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li><li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+a+CLC+Cl-/H++exchange+transporter+by+polyatomic+anions.">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li><li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-/H++exchange+transporter.">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li><li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels.">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li><li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+required+for+H(+)/Cl(-)+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter.">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li><li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2++activated+Cl-+channels.">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367 (2013).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters.">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li><li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters.">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li><li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++block+and+permeation+in+a+K++channel+of+known+structure.">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li><li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bern&#232;che, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H(+)/Cl(-)+exchanger.">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li><li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes.">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li><li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K++channel.">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li><li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl(-)/H(+)+antiporter.">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li><li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture.">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084 (2013).</li><li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K++channel.">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7 (2004).</li><li>Brohawn, S. G., del M&#225;rmol, ., J, R., MacKinnon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK,+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K++Ion+Channel.">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li><li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+slow+CLC+Cl-/H++antiporter+from+a+cyanobacterium.">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

יש לנו תיארנו פרוטוקול מפורט למדידת Cl - תחבורה בתיווכו של ערוצי אניון סלקטיבי מטוהרים או מובילים מחדש ביפוזומים. הדוגמא בה השתמשה הייתה H + / Cl פרוקריוטים - מחליף CLC-ec1. עם זאת, מתודולוגיה ניתן להתאים בקלות ללמוד ערוצים מגודר על ידי ligands 12,13,15, מתח <su...

בשני עשורים האחרונים את יכולת ביטוי יתר ולטהר חלבוני קרום תחבורה גדלה באופן דרמטי: תעלות יונים, מובילים ראשיים ומשניים כעת מטוהרים באופן שיגרתי ממערכות ביטוי Heterologous כמו גם מקורות טבעיים. גישות חדשות כדי לפקח על ביטוי, לשפר ולהקל על החילוץ ולשפר את היציבות של חלבונים אלו נמצאות בעיצומה פיתחו 1-5. פריצות דרך טכנולוגיות אלה כבר סייעו במפעילים הפיצוץ של מידע מבני ברמה האטומית על חלבוני קרום ש, בתורו, העמיקו את ההבנה של הבסיסים המבניים של תפקידם שלנו. בניגוד לכך, היכולת שלנו לחקור את התכונות פונקציונליות של החלבונים המטוהרים לא גדלה באותו קצב, כך שבמקרים מסוימים מידע מבני ברזולוציה גבוהה מלווה בנתונים פונקציונליים איכותיים, הגבלת היכולת שלנו לבדוק כמותית תחזיות המבוסס על מבנה וכך. לפיכך, development של מבחני פונקציונליים כמותי ולהכליל הוא צעד מפתח כלפי הבהרת היסודות מכניסטית של תפקוד חלבון קרום. כאן אנו מתארים assay זרימה שיכול לשמש כדי לקבוע כמותית תכונות פעילות מרכזית של Cl מטוהר ומחדש - ערוצים ומובילים. העקרונות שבבסיס assay ניתן להכליל את מגוון רחב של מערכות תחבורה, כמו גם לחלבוני הובלת יון שאינו. ליפוזומים מחדש עם Cl מטוהרים - ערוץ / מובילים בנוכחות Cl גדול - שיפוע (איור 1 א &#39;, ב&#39;). Cl - זרימה היא ביוזמת התוספת של ionophore כדי לאפשר לשטף דלפק-יון, במקרה שלנו K + ionophore valinomycin, אשר לדחוק את המתח שהוקם על ידי Cl - השיפוע ולהגדיר את פוטנציאל הקרום הראשוני לפוטנציאל שיווי המשקל של K + 6,7. ללא tהוא ionophore לא Cl נטו משמעותי - בזרימת מתרחשת, כפי שהוא מונע על ידי הדור של פוטנציאל הטרנסממברני. הנתונים מתואר כמותית על ידי שני פרמטרים הניתנים למדידה (איור 1 ג): τ, מתמיד של Cl זמן - בזרימת, וf 0, את החלק היחסי של יפוזומים לא מכילים חלבון פעיל. מτ וf 0 Cl יחידתי - שיעור תחבורה, את החלק היחסי של חלבונים פעילים והמסה המולקולרית של המתחם הפעיל ניתן לגזור 8. הטכניקה מודגמת כאן על ידי שימוש proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1, H CLC-סוג מאופיין היטב + / Cl - מחליף של מבנה ותפקוד ידועים. assay זה להכליל בקלות לערוצים או מובילים עם הסלקטיביות יונית שונה או שפעילותם תלויה בנוכחות של מתח ו / או ligands. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי לקבוע אם מולקולות קטנות משפיעות ישירות על החלבון מחדש,כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות וכיצד הרכב קרום או חומרים כימיים המשנה את שומנים בדם משפיעים על התפקוד של הערוצים ומובילים מחדש אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

אנו מתארים פרוטוקול מפורט וחזק כדי למדוד Cl - תחבורה בתיווכו של CLC-ec1 המטוהר, H פרוקריוטים CLC הסוג + / Cl - מחליף, מחדש ביפוזומים. ייצוג סכמטי של הניסוי מוצג באיור 3 Proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1 מטוהר ומכיל Cl הפנימי גבוה -. שקוע בפתרון אמבטיה המכיל Cl הנ...

Watch this Scientific Journal Video about A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters at JoVE.com

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K Views.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Video: A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &amp;#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...