وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (NHMRC) (526615 و 545906)، وجزئيا من خلال برنامج منظمة المؤتمر الاسلامي وحكومة فيكتوريا. DS زميل NHMRC.

1. إعداد [H 3] الكوليسترول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء محرك السيارة دخان، الاستغناء عن المبلغ المطلوب من [3 H] الكولسترول في أنبوب 1،5 microfuge مل (0.5 مطلوب μCi (19 kBq) لكل بشكل جيد لفحص نموذجي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا [3 H] معلقة الكوليسترول في التولوين، يجف عليه تماما مع غاز N2 وresuspend مع الإيثانول بنسبة 100٪ لتركيز النهائي من 1 μCi (37 kBq / ميكرولتر. دوامة ويخلط جيدا. </li></ol> 2. خلايا الطلاء ووسمها نسبة الكولسترول في الدم الخلوية وقد تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام أنواع الخلايا التالية: حيدات الإنسان 4،5، THP-1-الضامة الإنسان الوحيدات 6،7،8، RAW 264.7 الضامة الفئران 5،9،10،11، خلايا هيلا 12، الإنسان الوريد السري البطانية الخلايا (HUVEC)، BHK-21 خلايا 9، الخلايا الليفية الإنسان والفأر 13،14، HepG2 الخلايا سرطانة الكبد البشري 15 و، في صيغة معدلة، من الصفائح الدموية &lt;سوب&gt; 16. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا واحصروهم. خلايا لوحة في 12-جيدا لوحات في كثافة 0.2x10 النهائي من 6 خلايا لكل بئر في المتوسط ​​0.9 مل كاملة. وسوف تستمر الخلايا تنمو وستصل إلى 0.8x10 6 خلايا لكل بئر بحلول موعد التجربة هروب رأس المال. عن الخلايا التي لا تفرق، مثل خلايا متمايزة THP-1، يجب أن تكون كثافة بذر 0.8x10 6 خلايا لكل بئر. إذا باستخدام 6 - لوحات أو 24 أيضا، مزدوجة أو نصف عدد الخلايا لكل بئر على التوالي. وينبغي أن عدد الآبار تكون كافية لقرارات quadruplicate لكل حالة تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان مطلوبا تمايز الخلايا THP-1، إضافة سلطة النقد الفلسطينية (نهائي تركيز 0.1 ميكروغرام / مل) إلى وسائل الإعلام عن 48-72 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة صغيرة من وسائل الاعلام في أنبوب microfuge التي تحتوي على [3 H] الكوليسترول في الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وجهي أنبوب مع وسائل الإعلام قبل أن يضيف [3 H] الكولسترول في قسامة منفصلة من وسائل الإعلام كاملة (100 ميكروليتر / جيد). </li> &lt;لى&gt; إضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على [3 H] الكولسترول في الآبار مع الخلايا (الحجم النهائي للبئر هو 1 مل). إذا لم يكن يحتاج علاج الخلايا قبل وضع العلامات، قد يكون مطلي الخلايا في المتوسط ​​[H 3] التي تحتوي على الكوليسترول في الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا لمدة 48 ساعة في خلية ثقافة حاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2). </li></ol> 3. موازنة الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة لمدة 48 ساعة، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. تأكد من أنهم يتمتعون بصحة جيدة ونحن في نقطة التقاء ما يقرب من 80٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على [3 H] الكوليسترول في الدم. غسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني. كرر مرات غسيل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مصل خالية من وسائل الاعلام. إذا كان ذلك مطلوبا، تنشيط خلايا بإضافة ناهض LXR (مثل TO-901317 في 1-4 مليمول / لتر) أو مخيم (0.3 μMol / L؛ لخلايا المنشأ الماوس فقط) لمصل الدم وسائل الاعلام الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكروليتر وسائل الإعلام الحرة في المصل إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 18 ساعة في الخلية الحاضنة ثقافة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2). </li></ol> &lt;ف الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. الكولسترول الدفق الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 18 ساعة حضانة في مصل الدم خالية من المتوسط، والتحقق من الخلايا تحت المجهر. تأكد من أنهم يتمتعون بصحة جيدة ومتموجة (الحد الأدنى 80٪ confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل من هروب رأس المال يقبلون الكولسترول في الدم خالية من المتوسط. أمثلة من يقبلون ما يلي: ئي لمنظمة العفو الدولية (برنامج عمل ألماتي-I) (تركيز نهائي 10 ميكروغرام / مل) عالية الكثافة (HDL) (تركيز نهائي 20 ميكروغرام / مل) Cyclodextrin (نهائي تركيز 200 ميكروغرام / مل) البلازما (تركيز النهائي 1-2٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكروليتر من المصل خالية من وسائل الاعلام مع يقبلون على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك مجموعة واحدة من الآبار لتحديد خلفية هروب رأس المال (هروب رأس المال إلى وسائل الإعلام الحرة في المصل مع NO متقبل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا لمدة 2 ساعة في خلية ثقافة حاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2). قد مدة حضانة هروب رأس المال تختلف من 30 دقيقة إلى 8 ساعات إذا لزم الأمر. </li></ol> 5. تجهيز ساmples <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة حضانة فحص الخلايا تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائل الاعلام الى 1،5 أنابيب microfuge مل. تدور في 14000 دورة في الدقيقة لدقيقة 1-10 في درجة حرارة الغرفة لازالة الحطام الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكروليتر وسائل الاعلام الى 7 مل قنينة التلألؤ. إضافة 5 ملل من إنستا جل زائد (PerkinElmer) وخليط دوامة. تخزين العينات المتبقية في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات في الثلاجة لمدة 30 دقيقة. إضافة 500 ميكروليتر درهم 2 O إلى كل بئر. فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن كل الخلايا قد رفعت من قاع الآبار. إذا لا تزال ملتصقة، إما ترك لوحات مع DH 2 O في 4 آبار درجة مئوية خلال الليل أو كشط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة كل الخلايا قد انطلق، ماصة صعودا وهبوطا لتفتيت كتل الخلية. نقل 100 ميكروليتر إلى 7 قوارير التلألؤ مل. إضافة 5 ملل من إنستا جل زائد (PerkinElmer) وخليط دوامة. تخزين لوحات المتبقية في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة التلألؤ في عداد التلألؤ. تكوين عداد لحساب ل[H 3] فيوحدات DPM. </li></ol> 6. تحليل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما يتم التعبير عن معدل الكولسترول هروب رأس المال كنسبة من الكولسترول من الخلايا انتقلت إلى متقبل. وتستخدم الصيغة التالية: </li></ol><img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حساب هروب رأس المال محددة كما فرق بين هروب رأس المال في وجود أو غياب متقبل (فارغة). </li></ol><img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. الجدول الزمني <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. ممثل النتائج ويرد مثال على نتائج تجربة هروب رأس المال نسبة الكولسترول في الشكل. 1. في هذه التجربة كانت متباينة THP-1 حيدات الإنسان في الضامة، وهروب رأس المال إلى نسبة الكولسترول يقبلون مختلفة كاناختبار. وكان هروب رأس المال الكولسترول والمتوسطة مع عدم وجود يقبلون (&quot;فارغة&quot;) بنسبة 0.79٪، وكان يعتبر هذه القيمة بمثابة هروب رأس المال غير محددة، وكان مطروحا من القيم الأخرى. وكان هروب رأس المال البشري الكوليسترول إلى برنامج عمل ألماتي-I (تركيز نهائي 30 ميكروغرام / مل) 4.75٪. تم تضمين عينة البلازما إشارة إلى هذه التجربة لمراقبة مشتركة بين التجريبية تقلب. ويمكن استخدام عينة مرجعية لتطبيع البيانات عبر عدد كبير من التجارب، لكننا وجدنا أنه من الحكمة تكرار تجربة إذا تقلب مرتفع. وقد أجريت اختبارات على بلازما المريض (نهائي تركيز 2٪) قبل وبعد التعامل مع المريض مع الدواء. وخلص إلى أن هذا الدواء في المريض كان له أثر سلبي على قدرة بلازما هروب رأس المال لدعم الكولسترول. ويرد مثال آخر على نتائج تجربة هروب رأس المال في الشكل. 2. في هذه التجربة تم تنشيط خام 264،7 الضامة أو تفعيلها ليس عن طريق حضانة بين عشية وضحاها مع ناهض LXR TO-901317 (تركيز النهائيتم اختبار 1 μmol / لتر) وهروب رأس المال الكولسترول إلى نفس العينة من البلازما البشرية (2٪). وخلص إلى أن تفعيل التعبير الخلوية من نقل اي بي سي مع ناهض LXR يزيد قدرة الخلايا على اطلاق سراح الكوليسترول إلى متقبل خارج الخلية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> الشكل 1. ويظهر هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا-1 THP إلى يقبلون مختلف. النسبة المئوية من هروب رأس المال الكوليسترول (أي نسبة الكوليسترول الموسومة انتقلت من الخلايا إلى متقبل معين) بعد الطرح من القيم الفارغة. يعني ± التنمية المستدامة من قرارات quadruplicate *، P &lt;0.05. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> الشكل 2. انتقل هروب رأس المال من نسبة الكوليسترول في الدم 264.7 تنشيط أو تفعيل وليس مع ناهض LXR إلى البلازما البشرية. RAW من هروب رأس المال الكوليسترول (أي نسبة الكولسترول من الخلايا التي تحمل علامات للويرد متقبل المحدد) بعد الطرح من القيم الفارغة. يعني ± التنمية المستدامة من قرارات quadruplicate، * P &lt;0.001.

<ol>
	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المتعلقة بهذه الدراسة.

تم تصميم الطريقة الموضحة لقياس نسبة الكوليسترول هروب رأس المال لقياس حركة الكولسترول من الخلايا الى متقبل الكوليسترول خارج الخلية. هناك اعتبارات عدة حاسم في فهم هذه المنهجية. وضع البطاقات التعريفية وموازنة <p class="jove_content" style=";text-...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف \ خلايا </td><td> هيلا </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> كاملة وسائل الإعلام </td><td colspan="3"> RPMI - FCS 10٪ - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 0.2٪ </td><td> M199 - FCS 5٪ - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 1٪ - HEPES 2٪ (1M) - 7٪ نمو الخلايا البطانية الملحق (رسم القلب) </td><td colspan="2"> DMEM - FCS 10٪ - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 0.2٪ </td></tr><tr><td> حرية الإعلام في المصل </td><td colspan="3"> RPMI - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 0.2٪ </td><td> M199 - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 1٪ - HEPES 2٪ (1M) - الخلايا البطانية 7٪ النموالملحق الرابع (رسم القلب) </td><td colspan="2"> DMEM - 1٪ L-الجلوتامين - بكتيريا القلم 0.2٪ </td></tr><tr><td> مرور الطريقة </td><td> 1 × التربسين </td><td> تعليق </td><td> كشط </td><td colspan="3"> 1 × التربسين </td></tr><tr><td> نسبة مرور </td><td> 03:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 01:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> تنشيط الخلية (اختياري) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR ناهض - اضرب النهائي. 4 ميكرومتر </td></tr><tr><td> الكواشف الأخرى </td><td></td><td> phorbol 12-13-myristate خلات (PMA) - خلية التمايز - اضرب النهائي. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

يجب الحفاظ على نسبة الكولسترول من الخلايا في حدود ضيقة جدا، وكثيرا جدا أو قليلا جدا نسبة الكولسترول في نتائج خلية في اختلال الأغشية الخلوية، وموت الخلايا المبرمج ونخر 1. يمكن للخلايا الكولسترول مصدر من تركيب الخلايا والبروتينات الدهنية من البلازما، وعلى حد سواء مصادر كافية لتلبية متطلبات تماما الخلايا للكولسترول. وينظم بإحكام عمليات تركيب الكولسترول وامتصاص وأوجه القصور من الكوليسترول هي 2 نادر. الكولسترول الزائد هو أكثر 3 المشتركة المشكلة. مع استثناء من خلايا الكبد، وبعض الخلايا درجة قشرة الكظر، والخلايا غير قادرة على تتحلل الكولسترول. خلايا ديك خياران للحد من محتواها الكولسترول: لتحويل الكولسترول إلى استرات الكوليسترول، وهو خيار مع قدرة محدودة على الحمولة الزائدة الخلايا مع استرات الكوليسترول أيضا السامة، وهروب رأس المال الكولسترول، وهو خيار مع قدرة غير محدودة على الأرجح. هروب رأس المال الكولسترول هي المواصفاتIFIC العملية التي يتم تنظيمها من قبل عدد من شركات النقل داخل الخلايا، مثل ملزم للاعبي التنس المحترفين كاسيت نقل البروتينات A1 ​​(ABCA1) وG1 (ABCG1) وB1 زبال نوع المستقبلة. ومتقبل طبيعي من الكوليسترول في بلازما عالية الكثافة (HDL) ومنظمة العفو الدولية ئي. تم تصميم فحص الكولسترول هروب رأس المال إلى quantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف. فهو يقيس قدرة الخلايا للحفاظ على هروب رأس المال الكوليسترول و / أو قدرة على قبول يقبلون بلازما الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من الخطوات التالية. الخطوة 1: وصفها الكولسترول الخلوي من خلال إضافة إلى مصل الكوليسترول المسمى المحتوية على المديين المتوسط ​​واحتضان مع الخلايا لمدة 24-48 ساعة. ويمكن الجمع بين هذه الخطوة مع التحميل من الخلايا التي تحتوي على الكوليسترول في الدم. الخطوة 2: حضانة الخلايا في مصل الدم خالية من المتوسط ​​للتوازن الكوليسترول باللقاء بين جميع أحواض الكولسترول بين الخلايا. ويمكن الجمع بين هذه المرحلة مع تفعيل الفصل الخلويةolesterol النقل. الخطوة 3: حضانة الخلايا مع متقبل خارج الخلية وتحديد الكميات من حركة الكولسترول من الخلايا التي تحمل علامات للمتقبل. إذا تم استخدام السلائف الكولسترول لتسمية الكولسترول تصنيعه حديثا، وهي الخطوة الرابعة، وتنقية من الكوليسترول، قد يكون مطلوبا. الفحص توفر المعلومات التالية: (ط) كيف يمكن لعلاج خاص (طفرة، ضربة إلى أسفل، overexpression 1 أو علاج أ) يؤثر على قدرة الخلية إلى هروب رأس المال ونسبة الكولسترول (II) كيفية قدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول متضرر من المرض أو العلاج. وغالبا ما تستخدم هذه الطريقة في سياق البحوث القلب والأوعية الدموية، والاضطرابات الأيضية والاعصاب، والأمراض المعدية والصحة الإنجابية.

Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

فحص تدفق الكولسترول | طب | فيديو

Cholesterol Efflux Assay

تم تصميم فحص الكولسترول لquantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف وقدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من خلايا وصفها مع موازنة، والكولسترول الكولسترول بين تجمعات داخل الخلايا وإطلاق الكوليسترول في الدم إلى متقبل خارج الخلية.

الكولسترول الدفق الفحص

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

29.5K Views.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. تم تصميم فحص الكولسترول لquantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف وقدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من خلايا وصفها مع موازنة، والكولسترول الكولسترول بين تجمعات داخل الخلايا وإطلاق الكوليسترول في الدم ?...

Video: Cholesterol Efflux Assay

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

الفحص التجريبي الإنبثاث

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

فيفو الناب في العضلات وظيفة الفحص

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

نموذج الفأر من القرنية الفحص جيب للدراسة الأوعية الدموية

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

على<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; الفحص لفحص الدم نفاذية سفينة

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

ال<em&gt; في البيضة</em&gt; CAM-مقايسة باعتبارها Xenograftmodel عن الورم اللحمي

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

الآثار المتفاوتة للأدوية الخافضة للدهون في تحوير مورفولوجيا جزيئات الكوليسترول

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.