The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. إعداد الآلات، ركائز، الثقافة وسائل الإعلام وأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعامل مع من السيليكون نتريد (سي 3 ن 4) النوافذ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الكبسولة قليلا من خلال الضغط على نهاية واحدة تحتوي على نافذة في مثل هذه الطريقة لعدم الضغط على نافذة نفسه، في حين تناوب على الطرف الآخر من الكبسولة مع جهة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق زوج من الاتجاه المعاكس، ملاقط غرامة ذات الرؤوس تحت stereomicroscope للتأكد من عدم وجود لاصق، ثغرات أو الانحناءات على الحافة. خلاف ذلك، قد يكون كسر النوافذ بواسطة ملاقط أو يطير منهم خلال الخطوات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نافذة من الكبسولة التي كتبها استيعاب بعناية إطار النافذة مع ملاقط، في حين الضغط بلطف الكبسولة قرب نهاية مفتوحة الضغط في اتجاه وذلك لجعل الكبسولة أوسع حيث تحتاج حواف نافذة للخروج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نافذة قبل غسل (اختياري). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، والنوافذ قبل غسل بلطف بواسطة غمس لهمفي الماء المقطر لمدة 5 ثانية، تليها 2 دقيقة يغسل في 70٪ من الإيثانول و 2 دقيقة يغسل في الإيثانول بنسبة 100٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الالصاق وتعقيم النوافذ على طبق الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيب النوافذ، تعيين نافذة مع الجانب المسطح يصل في أسفل الطبق الثقافة، ضع قطعة من الشريط على شريحة زجاجية نظيفة. قطع نحو قطاع ربع بوصة من أسفل الجانب طويلة من الشريط. خذ قطعة من الشريط قبالة الجانب القصير (في ⅛ &quot;من قبل ¾&quot;) بشفرة حلاقة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط لتطبيق شريحة من الشريط إلى حافة الشبكة أو النافذة. استخدام ما يكفي للالتزام بشكل آمن دون تغطية افتتاح النافذة نفسها. التلاعب في الشريط الالتزام مع ملاقط، وضعت نافذة أسفل على الجزء السفلي من الطبق الثقافة. استخدام غيض من ملاقط التمسك الشريط إلى أسفل الطبق الثقافة بحزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الشريط الشريط أخرى إلى الحافة الأخرى والتقيد هذا إلى أسفل بحزم مع غيض من ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة كل النوافذمسجلة، وتعقيم النوافذ في أطباق الثقافة مع الأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة. تحقيق ذلك عن طريق وضع طبق تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في غطاء تدفق الصفحي لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) إذا النوافذ لتكون مرحلة ما قبل المغلفة مع البولي يسين، تفعل ذلك بعد نافذة التعقيم. معطف النافذة مع 10 ميكرولتر من العقيمة 0.01٪ بولي-L-يسين الحل لمدة 1 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية، ثم شطف الحل المتبقية قبالة مع وسائل الإعلام الثقافة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخازن لغسل النهائي قبل XFM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إما تريس الجلوكوز أو piperazine- N، N &#39;-bis (حمض ethanesulfonic) (أنابيب) -sucrose عازلة خالية من أي المعادن النزرة مع الأسمولية ودرجة الحموضة ما يعادل Dulbecco والفوسفات عازلة المالحة (D-PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام أحد هذه المخازن المؤقتة لشطف الخلايا بعد الخلايا الثابتة كيميائيا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل حل تريس، الجلوكوز (10 ملي تريس، 260 ملي الجلوكوز، 9 ملي حمض الخليك،) إضافة 1.4 غرام من الجلوكوز، 36 ملغ من قاعدة تريس و16 ميكرولتر من حمض الخليك إلى 20 مل من الماء عالى النقاء. ثم، وضبط الحجم النهائي إلى 30 مل مع الماء عالى النقاء. ليس هناك حاجة إلى تعديل درجة الحموضة. تخزين في RT تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل أنابيب السكروز (20 أنابيب ملي و 200 ملي السكروز) إضافة 0.18 غرام من أنابيب و 2.0 غرام من السكروز إلى 20 مل من الماء عالى النقاء وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع كميات صغيرة من حمض الخليك المركز. ثم، وضبط الحجم النهائي إلى 30 مل مع الماء عالى النقاء. تخزين في RT تصل إلى أسبوع واحد. ملاحظة: السبب لتجنب استخدام برنامج تلفزيوني في الشطف النهائي هو أن تركيزات الفوسفات وكلوريد البوتاسيوم وفي برنامج تلفزيوني مرتفعة بحيث يمكن أن تتداخل مع XFM إذا لم يتم إزالته تماما قبل التجفيف في الهواء. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخازن للطلاء الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أو إخراج جميع وسائل الإعلام، مثل RPMI المتوسطة 1640، 1X التربسين-EDTA الحل، D-PBS، وأي الكواشف الأخرى حسب الحاجة لمعين خط خلية ملتصقة كما عادة يتم ذلك عن الركض الخلايا الملتصقة سالفائدة و، وتدفئة لهم إلى 37 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 2. التصفيحات من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الطبق الثقافة تعقيم تحتوي على النوافذ، في غطاء تدفق الصفحي، إضافة بلطف وسائل الإعلام (10 مل لطبق ثقافة 100 ملم)، على طول الجانب من الطبق الثقافة معها يميل بزاوية. تجنب خلق التوتر السطحي لزوم لها أو إسقاط وسائل الاعلام مباشرة على سطح النوافذ نيتريد السيليكون. كما تم إضافة وسائل الإعلام، وتخفيف ببطء زاوية الميل إلى معطف الشبكة ونافذة مع وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خط خلية ملتصقة الاهتمام بشكل مناسب، trypsinizing أو كشط الخلايا الخروج من لوحات كالمعتاد لالركض خط الخلية. القيام بأي العد الخليوي، أو إعداد الأخرى الضرورية قبل تطبيق الخلايا إلى لوحة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الخلايا إلى صحن الثقافة مع ويندوز في مناطق ذات كثافة خلية ما هو مطلوب للوصول إلى عادة 50٪ -70٪ التقاء في غضون 24-72 ساعة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة نمو الخلايا في بعض الأحيان، وذلك باستخدام المجهر الضوئي مقلوب، حتى كثافة الخلية المطلوب (عادة 50٪ -70٪ التقاء) يتم التوصل. </li></ol> 3. تثبيت للخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ في D-PBS عن طريق تمييع الأسهم المشتراة (مثل 25٪ امتصاص العرق) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الخليك (لتجنب مضيفا الصوديوم الزائد للعينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم نمت الخلايا كما هو مطلوب، ولقد تم تطبيق أي البقع الحيوية (مثل Hoescht) وتصويرها، وإزالة وسائل الإعلام التي كتبها طموح لطيف، إمالة الطبق في زاوية 45 درجة مع يد واحدة، والشفط باليد ماصة مع الآخر . ملاحظة: بدلا من pipetting لقضى وسائل الإعلام، والبديل هو اختيار النافذة تصل، وتراجع نافذة أنابيب microcentrifuge مع D-PBS مرتين ثم وضعه في وعاء ثقافة جديدة مع حلول تثبيتي لمدة 20 دقيقة تليها 2 مرات من PBS يغسل لإزالة مثبتات المتبقية. إذا ما تم اختيار هذا، انتقل ديرectly إلى الخطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الطبق برفق مع D-PBS واستبدال السائل إزالتها على الفور عن طريق إضافة بلطف الطازجة 4٪ PFA / PBS حين عقد الطبق في زاوية 45 درجة، pipetting لنحو الجانب من الطبق، والاسترخاء ببطء زاوية الميل للسماح لل الحل تثبيتي لتغطية النوافذ. الحفاظ على خلايا مغطاة تثبيتي لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل بواسطة طموح لطيف، ومرة ​​أخرى على النحو الوارد أعلاه، إمالة الطبق قليلا والشفط باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال السائل إزالتها عن طريق إضافة بلطف بعض أنابيب / حل السكروز، وذلك باستخدام أسلوب إمالة وpipetting لهو موضح في الخطوة 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.4 و 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد للتجفيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المناشف خالية من الوبر مثل Kimwipes، وسحب واحد من مربع لذلك هو مفيد للغاية بسرعة وسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد، مكان نظيف غير مستوى لضبط نافذة لتجف. المبين حصيرة شبكة المطاط من الأنواع المستعملة في المجهر الإلكتروني، الذي لديه التلال ذلكيمكن مسنود نافذة واحدة على نهاية في حين أن يجف. هذا وسوف تبقي نافذة من أن يعلقوا على سطح التجفيف لأنه يجف، واستنزاف أي عازلة المتبقية إلى حافة العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينتف الريش بعناية الشريط تعلق على نافذة لعقد نافذة للخروج من السائل. استرداد النوافذ التي تأتي من خارج الشريط من خلال تطبيق كمية صغيرة من أنابيب / السكروز لحملهم على تعويم ثم انتشالها مع ملاقط العكسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية (بدون لمس نافذة نفسه) وبدقة جصص أي أنابيب الزائد / السكروز من على حافة النافذة مع Kimwipe. جصص أيضا منطقة بادئة مرة أخرى باستخدام أضعاف مقربة من Kimwipe. ملاحظة: إن الهدف هو أن يكون تبلور أقل قدر من الأملاح أو مخازن على سطح النافذة وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نافذة على حصيرة الشبكة. تأكد من أن نافذة لا الاستلقاء على حصيرة الشبكة، ولكن مسنود حتى على حافة (باستخدام التلال من حصيرة الشبكة) ولمس اقل من الشبكةحصيرة ممكن. السماح للنافذة الجافة. </li></ol> 4. تصاعد عينة والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة قد جفت العينة، تحقق من وجود خلايا على النوافذ باستخدام المجهر الضوئي. تنفيذ هذا التحقق، قبل إعداد العينات للنقل إلى السنكروترون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حزمة النوافذ للنقل إلى beamline السنكروترون استضافة تجربتك. يضعوا بلطف النوافذ مع الشريط على الجانبين لشريحة زجاجية، ثم يلصق الشريحة الزجاجية مع الشريط إلى أسفل طبق بتري البلاستيك. الشريط طبق بيتري مغلقة. ملاحظة: قبل هذه النقطة، ويمكن تنفيذ هذه الخطوات في أي مختبر نموذجي. من الأفضل أن يتم ذلك بالخطوات التالية في beamline السنكروترون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط من نافذة بلطف مع ملاقط. استخدام طلاء الأظافر، حتى في طبقة رقيقة على طول حافة النافذة، لتأمين النوافذ إلى حامل الألومنيوم التي تقدمها المتعاونين beamline في السنكروترون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج حامل الألومنيوم فيوالحركية جبل، ومن ثم وضعه في موقف في المجهر الأشعة السينية. جبل العينة على شريحة توصيله إلى مراحل الآلية، داخل حجرة العينة في beamline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخروج من الأشعة السينية منطقة أداة المجهر عينة (أ القفص مصنوعة من الجدران المليئة الرصاص)، والإعداد للمسح. باستخدام برنامج beamline محددة، واختيار المنطقة المناسبة من العينة إلى مسح، أثناء عرض موقف شعاع الأشعة السينية على العينة باستخدام كاميرا مجهزة الفيديو عبر الشعر ومع كاميرا ماض المصب الانحياز مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار القرار المناسب للعينة، استنادا إلى تقدير لحجم أصغر سمة من سمات الفائدة. لتصوير خلايا الثدييات واحدة (~ 20-40 ميكرومتر في الحجم)، واستخدام قرار من 0.25-0.5 ميكرون. لتصوير مناطق من الأنسجة، والتمييز بين طبقات الخلايا عن بعضها البعض، استخدام دقة من 2-20 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الوقت المناسب ليسكن العينة، استنادا إلى تقدير كمية من التقىآل المصالح الحاضر. لمحة المسح السريع، أو إذا كميات عالية من المعادن موجودة، استخدام فحوصات الطاير مع الأوقات يسكن من 30-300 ميللي ثانية لكل بكسل. إذا كانت المادة قليلة موجودة، أو لقياس المعادن من الوفرة النسبية منخفضة، واستخدام خطوة بالاشعة مع أوقات يسكن من 1-2 ثانية لكل بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برمجة المسح في البرنامج beamline محددة. الحصول على صورة خطوط المسح الضوئي. العمل مع المتعاونين beamline لتحليل البيانات مع البرامج التي من شأنها تحديد القمم الطاقة المميزة لكل عنصر. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الأشعة السينية التصوير مضان مفيد في العديد من المجالات، بما في ذلك علوم الأرض، وعلوم المواد، والبيولوجيا الكيميائية 26-34. أنتجت التقدم في السنكروترون الأشعة السينية، والتركيز، وللغاية الحزم عالية الكثافة. الحزم تركيزا الأشعة السينية كافية لإثارة المعادن المح...

الأشعة السينية التصوير مضان يسمح لكل من الهوية وكمية من العناصر الموجودة في عينة لحلها مكانيا. حادث الأشعة السينية، من الطاقة مختارة لتكون أكبر من الإلكترون الطاقة من أعنف عنصر من مصلحة ملزمة، والتغلب على طاقة الربط الإلكترونات الداخلية قذيفة إلى النواة 1. وهذا يخلق &quot;ثقب&quot; في قذيفة الإلكترون. كما الإلكترونات طاقة أعلى تسقط في هذه الثقوب، وتنبعث الفلورسنت الأشعة السينية التي تعتمد على الطول الموجي فصل الطاقة من تلك المدارات. منذ تباعد الطاقة في المدارات هو سمة من عنصر معين، لديه الانبعاثات مضان الأشعة السينية أيضا موجات مميزة، تعتمد على العنصر. هذا هو الانبعاثات في الطول الموجي المميز الذي يتيح التعرف على العناصر الحالية. معايرة كثافة مضان تسمح الكميات من العناصر الحالية. الأشعة السينية مضان microscopأصبح ص (XFM) تستخدم على نحو متزايد، ويرجع ذلك جزئيا إلى تطوير مصادر السنكروترون الأشعة السينية رائعة جدا، مثل تلك التي في الربيع-8 في اليابان، ومرفق الأوروبي الإشعاع السنكروترون (ESRF) في فرنسا، وفوتون المصدر المتقدم ( APS) في الولايات المتحدة (2). وتوفر هذه المصادر كثافة عالية جدا الحزم الأشعة السينية. في نفس الوقت، وإدخال تحسينات في مجال البصريات والأشعة السينية، مثل تكنولوجيا لوحة منطقة، سمح التركيز من هذه الحزم إلى البقع ميكرون الفرعي، وإن كان غير فعال بدلا 3. مع جدا الحزم عالية الكثافة، حتى كمية صغيرة نسبيا من الضوء الذي يمكن أن تركز كافية لإثارة المعادن الذاتية في الخلايا، وتنتج إشارة التي يمكن قياسها مع التكنولوجيا كاشف المتاحة حاليا. وهكذا، ودراسة البيولوجيا الكيميائية للمعادن في الخلية هي تطبيق واحد على وجه الخصوص أن يجعل من استخدام العديد من التطورات الأخيرة في هذه التقنية 4-10. هناك العديد من العوامل الحاسمة لأخذها في الاعتبار عند التطبيقالكذب XFM للتحقيق في توزيع الأولي والكمي لخلايا الثدييات مثقف أو عينات بيولوجية أخرى. أولا، تحتاج العينة أن تبقى سليمة من الناحية الهيكلية وفيما يتعلق تكوينها عنصر، وذلك لقياس لتكون ذات مغزى. ثانيا، لا بد من الحفاظ على عينة أيضا في بعض الطريق بحيث يكون هاردي إلى أضرار الأشعة التي يمكن أن تسببها تركيزا شعاع الأشعة السينية. إحدى الطرق التي عينة يمكن تلبية كل من هذه المعايير في آن واحد هو أن يتم تجميدها بسرعة إلى الجسم الزجاجي، والجليد غير متبلور 11،12. كثيرا ما يتم تحقيق التجميد السريع من خلال تقنيات الحفظ بالتبريد مختلفة مثل يغرق تجميد أو ارتفاع ضغط تجميد 13-16. ومن المسلم به عموما أن الحفظ بالتبريد يحفظ العمارة الخلوية الشاملة والتراكيب الكيميائية في العينات البيولوجية أقرب إلى الدولة الأم وقت ممكن. تثبيت الكيميائية، من ناحية أخرى، ويرجع ذلك إلى انتشار بطيء والانتقائي للمثبتات إلى الخلايا والأنسجة كما ثالذراع تغييرات لاحقة كما في نفاذية الغشاء، قد تسمح مختلف أيونات الخلوية وخاصة أيونات إنتشاري مثل الكلور، الكالسيوم وK إلى أن ترشح، المفقودة أو نقلهم، مما يجعل التحقيق في هذه العناصر دون المستوى الأمثل 17-19. وعلى الرغم من ميزة واضحة من البرد التثبيت على تثبيت الكيميائية بشكل عام، لخلايا الثدييات ملتصقة على وجه الخصوص، الحفظ بالتبريد لديها مختلف القيود 20-23. أكثرها وضوحا هو أن ليس كل مختبر البحوث ويسهل الوصول إلى أدوات الحفظ بالتبريد. معظم المجمدات ارتفاع ضغط الحالية أو حتى يغرق المجمدات مكلفة ومملوكة فقط من قبل مجموعة فرعية من مرافق البرد، والتي قد تكون بعيدة عن حيث يتم تحضين الخلايا. قد يتم تداولها صالح الحفظ بالتبريد لعيب الإجهاد السفر المفروضة على الخلايا. وهكذا، في حين الحفظ بالتبريد هو بالتأكيد الطريق الأكثر صرامة للحفاظ على عينات للتحليل مضان الأشعة السينية، فمن المؤكد أنها ليست الأكثر في متناول جميع الباحثين في جميع الظروف.كما أنها ليست دائما ضرورية - إذا كان المعادن ذات الأهمية لا بد بإحكام على الجزيئات يمكن حلها، والقرار الذي سيتم تصويرها على عينة أكبر من الأضرار التي لحقت-المجهرية جدا التي قد تحدث أثناء التجفيف. وإذ تضع في اعتبارها المحاذير 24، تثبيت الكيميائية وتجفيف قد يكون خيارا مناسبا. وتشمل العوامل الأخرى في الأشعة السينية تجربة التصوير مضان ناجحة تحليل سليم. الأشعة السينية التصوير مضان هو في الأساس الأشعة السينية الطيفي الانبعاثات مضان جنبا إلى جنب مع النقطية المسح إلى توفير تحليل المكاني. أطياف الانبعاث مضان الأشعة السينية التي تم جمعها تحتوي على مزيج من تداخل القمم الانبعاثات، الخلفية، والقمم نثر المرنة وغير المرنة من شعاع الحادث. البرمجيات التي تمكن من الإلتواء اجتثاث هذه المساهمات، وتركيب قمم الانبعاثات كان، وهو تطور حاسمة في هذا المجال 25. أيضا، وتطوير وشعبة نظم التجاريribution المعايير الأغشية الرقيقة من تكوين معروفة، وتستخدم لمعايرة كثافة مضان بالنسبة لكمية المواد، وقد تم أيضا مهم جدا. يوفر هذا البروتوكول وصفا لإعداد الخلايا الملتصقة من قبل التثبيت الكيميائية والتجفيف في الهواء. خطوة حيوية في هذه العملية هي نمو الخلايا على النوافذ نيتريد السيليكون، والتي غالبا لا تلتزم بشكل جيد، مما يجعل الشطف لطيف في مفتاح الأزياء معين لتحقيق النجاح.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

قدرة التصوير مضان الأشعة السينية لتوفير المعلومات حول العينات البيولوجية تتوقف على هذه العينات التي يجري إعدادها في مثل هذه الطريقة أنها متماسكة إلى أضرار الإشعاع على مقياس الوقت من التجربة، وبعد هم الكيميائية والسمات الهيكلية بشكل جيد الحفاظ عليها. في عرض نتيجة ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation at JoVE.com

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Views.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

Video: Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

حيود الأشعة السينية مسحوق في علوم الحفظ: نحو روتيني البنية البلورية تحديد التآكل المنتجات على كائنات التراث الفن

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

التحديد الكمي للبيانات Fluorescence الأشعة السينية باستخدام خرائط

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

رقائق موائع جزيئية لنثر الخفيفة الديناميكية في الموقع حيود الأشعة السينية كريستال و في الموقع لعلم البلورات المسلسل

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

امتصاص المعادن الأساسية في البكتيريا سلبية الغرام: الأشعة السينية الأسفار، النظائر المشعة، والخلية تجزئة

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

الكشف عن عنصري المراعية لمادة الكيمياء في البطاريات عن طريق التحليل الطيفي امتصاص الأشعة السينية اللينة، وتبعثر الأشعة السينية غير مرن رنانة

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

تحليل المعادن التي تنتجها هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني مع Microanalysis الأشعة السينية المشتتة الطاقة

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

يجند بوساطة التنو ونمو البلاديوم معدنية جسيمات نانوية

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...