Name: preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

楽器、基質、文化メディアと皿の調製<ol><li>窒化ケイ素（のSi 3 N 4）は、Windowsの取扱い。 <ol><li>もう一方の手でカプセルのもう一方の端を回転させながら、少しウィンドウ自体を圧迫しないような方法でウィンドウを含む一方の端を絞ることによってカプセルを開きます。 </li><li>逆のペアを確認して、実体顕微鏡下での先の細いピンセットは先端の接着剤、隙間や曲がりがないことを確認します。そうでない場合は、Windowsは、ピンセットにより破損またはその後の工程中にそれらの飛散することもできる。 </li><li>ウィンドウの端が出てくる必要がある広いカプセルになるように優しく方向に開放端加圧付近でカプセルを圧迫しながら、慎重にピンセットでウィンドウの枠をつかんでカプセルからウィンドウを削除します。 </li></ol></li><li>窓プレウォッシュ（オプション）。 <ol><li>穏やかにそれらを浸漬することにより、予備洗浄ウィンドウを所望の場合70％エタノール中で2分間洗浄し、100％エタノール中で2分間洗浄し、続いて5秒間蒸留水に。 </li></ol></li><li>貼り付けと培養皿上のウィンドウを殺菌する。 <ol><li>ウィンドウを固定するためには、培養皿の底の平らな面を上にしてウィンドウを設定、清浄なガラススライド上にテープ片を置く。テープの長辺下4インチのストリップをオフ約カット。きれいなかみそりの刃で（「3/4」⅛で）の短辺からテープのスライスを取る。 </li><li>グリッドまたはウィンドウの端にテープのスライスを適用するためにピンセットを使用してください。しっかりと窓の開口部自体を覆うことなく、それを接着するために十分なを使用してください。ピンセットで接着テープの操作、培養皿の底にダウンウィンドウを設定。しっかりと培養皿の底にテープを接着するためにピンセットの先端を使用してください。 </li><li>他のエッジに別のテープストリップを適用し、ピンセットの先でしっかりと底にこれを付着する。 </li><li>一旦全ての窓があるテープ、紫外線（UV）照射で培養皿でWindowsを殺菌する。約1時間、層流フード内でUVランプ下で皿を置くことによってこれを達成する。 </li><li> Windowsはポリ - リジンでプレコーティングする場合（オプション）、ウィンドウ·滅菌後そう。 37℃のインキュベーター中で1時間のための無菌0.01％ポリ-L-リジン溶液10μlとコートのウィンドウをした後、培養培地に残った溶液を洗い流してください。 </li></ol></li><li> XFMの前に最後の洗浄のためにバッファを準備します。 <ol><li>トリスグルコースまたはピペラジンNのいずれかを準備し、N &#39; -ビス（エタンスルホン酸）（PIPES）、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）のオスモル濃度およびpH同等の任意の微量金属を含まない緩衝液-スクロース。細胞は化学的に固定された後、細胞をリンスし、これらのバッファのいずれかを使用します。 <ol><li>トリスグルコース溶液（10 mMトリス、260 mMグルコース、9 mMの酢酸、）を作るためには、トリス塩基の36 mgのグルコースを1.4g追加超純水20mlに酢酸16μlの。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 pH調整は必要ありません。 1週間まで室温で保管してください。 </li><li>作るPIPES、スクロース（20mMのPIPES、200mMのスクロース）を超純水20mlにPIPES 0.18gのスクロースと2.0gを追加し、濃酢酸少量のpHを7.4に調整する。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 1週間まで室温で保管してください。 注：最終すすぎにPBSを使用しないようにする理由は、PBS中のリン酸塩、塩化物、カリウムの濃度は、それが完全に空気乾燥する前に除去されていない場合、それはXFMを妨害できるように高いことである。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞プレーティングのためのバッファを準備します。 <ol><li>準備または正常O接着細胞を継代するために行われるであろうように、特定の付着細胞株の必要に応じて、そのようなRPMI培地1640などのすべてのメディアを、1×トリプシン-EDTA溶液、D-PBS、および任意の他の試薬を取り出すFの関心、そして37℃にそれらを温める。 </li></ol></li></ol>細胞の2.メッキ<ol><li>窓を含む滅菌した培養皿に、層流フード中で、穏やかな角度で傾け、それに培養皿の側面に沿って、メディア（100mm培養ディッシュ10 ml）を加える。不要な表面張力を作成または窒化ケイ素の窓の表面に直接メディアを落とさない。メディアが追加されると、徐々に被覆する傾斜角を媒体とグリッドウィンドウを和らげる。 </li><li>細胞株を継代するためにいつものように、プレートのオフの細胞をトリプシン処理または掻き、適切に関心の付着性細胞株を準備します。新鮮なプレートに細胞を適用する前に必要なすべての細胞計数、または他の準備を行います。 </li><li>典型的には24〜72時間以内に50％〜70％のコンフルエンスに到達するために必要とされる細胞密度で窓付きの培養皿に細胞を追加し、5％二酸化炭素を含む加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </LI&gt; <li>所望の細胞密度（通常50％〜70％の集密度）が達成されるまで、倒立光学顕微鏡を使用して、時折、細胞の成長を観察する。 </li></ol>細胞の3。固定<ol><li> （サンプルに過剰のナトリウムを加えることを避けるために）購入した株式（例えば25％のパラホルムアルデヒド）を希釈し、酢酸でpHを7.4に調整することにより、D-PBS中で新鮮な4％パラホルムアルデヒドを準備します。 </li><li>細胞は、必要に応じて成長してきた、と（例えばヘキストなどの）重要な汚れが適用され、画像化されてきた、片手で45°の角度でディッシュを傾け、穏やかな吸引によってメディアを削除し、他のと手のピペットで吸引した場合。 注：代わりにペッティング過ごしたメディアの、代替案は、ウィンドウを拾う二回D-PBSでマイクロ遠心チューブにウィンドウを浸した後、PBS洗浄の2回に続いて20分間固定液ソリューションを新しい培養容器にそれを置くことです残留固定剤を除去することができる。これを選択すると、ディレクトリを移動ectly 3.5に移行する。 </li><li> D-PBSで優しく料理をすすぎ、皿の側に、45°の角度でピペット操作を一品を押しながら静かに新鮮な4％PFA / PBSを追加し、ゆっくりとできるように、傾斜角度を緩和することにより、すぐに除去された液体を交換固定液は、Windowsをカバーする。室温で20分間固定液で覆われた細胞を保管してください。 </li><li>少し料理を傾け、手で吸引、上記のように、再び、穏やかな吸引によって液体を除去します。 </li><li>優しくステップ3.3で説明した傾斜とピペット操作方法を使用して、パイプ/スクロース溶液の一部を追加することにより除去された液体を交換してください。 </li><li>繰り返します3.4と3.5を繰り返します。 </li><li>乾燥のための材料を準備します。 <ol><li>そのようなキムワイプなどの糸くずの出ないタオルを収集し、それは非常に迅速かつ簡単に便利ですので、箱から1を引く。 </li><li>乾燥するためにウィンドウを設定するには、きれいな、非レベルの場所を準備します。そうリッジを持つ電子顕微鏡に使用する種類のゴム製のグリッドマットを設定しますそれが乾燥しながら、ウィンドウは、一方の端部に支えことができる。これは、乾燥などの乾燥表面に立ち往生からウィンドウを維持し、サンプルの縁に残っているバッファを排出します。 </li></ol></li><li>慎重に液体の外にウィンドウを保持するためのウィンドウに接続されているテープをピンセットで抜く。彼らが浮遊し、その後、逆ピンセットでそれらを拾ってもらうことPIPES /スクロースの少量を適用することにより、テープの外れのウィンドウを取得します。 </li><li>慎重に（ウィンドウ自体に触れることなく）、徹底的にキムワイプでウィンドウの端から余分なパイプ/ショ糖を塗りつける。また、キムワイプの丸い倍を使用して戻ってインデント領域を​​塗りつける。 注：目標は、できるだけ窓の表面上の塩または緩衝剤のような小さな結晶を有することである。 </li><li>グリッドマットの上にウィンドウを配置します。ウィンドウがグリッドマットの上に平らに横たわったが、端に立てかけ（グリッドマットのリッジを使用して）、グリッドのわずかに触れていないことを確認してくださいできるだけマット。ウィンドウを乾燥してみましょう。 </li></ol> 4.サンプル取付け·イメージング<ol><li>サンプルが乾燥した後、光学顕微鏡を使用したWindowsでの細胞の存在を確認します。シンクロトロンへの輸送のためのサンプルを準備する前に、この検証を行います。 </li><li>あなたの実験をホストしているシンクロトロンビームラインへの輸送のための窓をパッケージ化します。優しくその後、スライドガラスに両面テープを使用してWindowsを貼付プラスチックシャーレの底にテープでスライドガラスを貼付。ペトリ皿を閉じてテープで固定します。 注：以前は、この時点まで、これらのステップは、任意の標準的な実験室で行うことができる。次の手順は、最高の放射光ビームラインで行われます。 </li><li>ピンセットでそっと窓からテープを外します。シンクロトロンでのビームラインの協力者が提供するアルミホルダーにWindowsを保護するために、ウィンドウの端に沿って薄い均一なコーティングで、マニキュアを使用してください。 </li><li>にアルミニウムホルダーを挿入しますキネマティックマウントした後、X線顕微鏡の位置にそれを配置します。ビームラインでの試料室の内部で、電動ステージに接続するブラケットのサンプルをマウントします。 </li><li>サンプルのX線顕微鏡計器エリア（鉛満たされた壁で作られておりません）を出た後、セットアップスキャン。ビデオ十字線とを備えたカメラを用いて試料上のX線ビームの位置を確認しながら、スキャンするサンプルの適切な領域を選択し、ビームライン固有のソフトウェアを使用して、プリアライメント下流シンチレータカメラで。 </li><li>興味のある最小の特徴の大きさの推定値に基づいて、試料のための適切な解決を、選択してください。シングル、哺乳動物細胞（サイズは〜20〜40μm）を画像化するための、0.25〜0.5ミクロンの解像度を使用。組織の領域を画像化し、相互に細胞層を区別するために、2~20ミクロンの解像度を使用する。 </li><li>満たさの量の推定値に基づいて、試料の適切な滞留時間を選択する存在する目的のアル。簡単な概要スキャンのために、または金属の高い量が存在する場合、ピクセルあたり30〜300ミリ秒の滞留時間でフライスキャンを使用。少ない材料が存在する場合、または、低い相対的存在の金属を測定するピクセルあたり1〜2秒の滞留時間でステップスキャンを使用します。 </li><li>ビームライン固有のソフトウェアにスキャンをするプログラム。ラスタスキャン画像を取得する。各要素の特性エネルギーのピークを同定するソフトウェアを使用してデータを分析するためにビームラインの協力者と一緒に作業します。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X線蛍光イメージングは、地球科学、材料科学、化学、生物学26-34を含む多くの分野において有用である。シンクロトロンX線の進歩、およびそれらの焦点は、非常に高強度のビームを生成した。フォーカスX線は、現在利用可能なシリコンドリフト検出器技術を用いて測定可能な信号を生成する、現在存在する細胞における内因性金属を励起するのに十分なビーム。そして細胞中の金?...

X線蛍光イメージングは​​、空間的に分解されるサンプル中に存在する元素の同一性および量の両方を可能にする。 、関心の重い元素の電子の結合エネルギーよりも大きいこと核1内殻電子の結合エネルギーを克服するために選択されたエネルギーの入射X線、。これは電子殻の「穴」を作成します。高エネルギー電子は、これらの孔に落下するように、蛍光X線は波長がそれらの軌道のエネルギー間隔に依存して放出される。軌道のエネルギー間隔は、与えられた要素の特性であるので、X線蛍光放射は、要素に依存する特徴的な波長を有する。これは、存在する元素の同定を可能にする特性波長におけるこの放出である。蛍光強度の較正要素の定量が存在することができます。 X線蛍光microscopY（XFM）は、フランスの日本におけるSPring-8のもの、欧州の放射線シンクロトロン施設（ESRF）のように、部分的に非常に鮮やかなX線シンクロトロン源の開発に、ますます利用になり、光量子ソース（い米国2でAPS）。これらのソースは、非常に高強度のX線ビームを提供する。同時に、このようなゾーンプレート技術としてX線光学系の改善は、かなり非効率的ではあるが3、サブミクロンのスポットにこれらのビームの集束を可能にした。非常に高強度のビームを、焦点を合わせることができる光の比較的少量が、現在利用可能な検出器技術を用いて測定することができる信号を生成する、細胞中の内因性金属を励起するのに十分である。このように、セル内の金属の化学生物学を研究することは、この技術の4-10における最近の進展の多くを利用し、特に1のアプリケーションです。 アプリながら検討すべき多くの重要な要因があります培養哺乳動物細胞または他の生物学的サンプルの元素分布と定量化を調査するXFMに横たわっ。まず、サンプルは有意義であると測定するために、構造的にも、その元素組成については、そのまま保持される必要がある。それは、集束X線ビームによって引き起こされる可能性が放射線損傷に丈夫であるように第二のサンプルはまた、いくつかの方法で保存されなければならない。サンプルを一度にこれらの基準の両方を満たすことができる一つの方法は、急速にガラス質、アモルファス氷11,12に凍結されるべきである。急速凍結は、多くの場合、プランジ凍結または13-16の凍結高圧のような種々の凍結保存技術を介して達成される。これは、一般的に凍結保存が可能な限り天然の状態に近い生体試料中の全体的な細胞構造や化学組成を保持することが認められている。 Wなどの細胞や組織への固定剤のゆっくりと選択的な浸透に起因する一方、化学的固定、膜透過性のその後の変化などのエル、従って17-19次善のこれらの要素の調査をレンダリングする、紛失したり、再配置、例えば、Cl、CaおよびKとして特に拡散イオンを浸出させるための種々の細胞のイオンを可能にすることができる。特に接着性の哺乳動物細胞のための一般的な化学固定、オーバークライオ固定の明らかな利点にもかかわらず、凍結保存は、様々な制限20-23を持っています。最も明らかな1ではなく、すべての研究室は、凍結保存機器に簡単にアクセスを持っていることである。現在のほとんどの高圧冷凍庫、あるいは冷凍庫を急落は、高価なだけ遠くに細胞が培養される場所からのものであってもよいクライオ施設のサブセットによって所有されている。凍結保存の利点は、細胞上に置か走行ストレスの欠点のために取引されている可能性があります。凍結保存は確実に蛍光X線分析用のサンプルを保存するための最も厳格な方法ですがこのように、それは確かに、すべての状況下で、すべての研究者に最もアクセスすることはできません。またそれは常に重要である - 興味のある金属がしっかりと固定可能な巨大分子に結合して、サンプルが画像化される解像度は、乾燥時に発生する可能性がある超微細構造へのダメージよりも大きいしている場合。警告24留意、化学固定、乾燥は、適切な選択である。 成功したX線蛍光イメージング実験における他の要因は、適切な分析を含む。 X線蛍光画像化は、基本的に空間分解能を提供するために、ラスタースキャンと組み合わせたX線蛍光発光分光法である。収集されたX線蛍光発光スペクトルは、発光ピーク、背景、及び入射ビームの弾性および非弾性散乱ピークの重複の組み合わせを含む。これらの貢献のデコンボリューション、及び発光ピークのフィッティングを可能にするソフトウェアは、このフィールド25に重大な開発であった。また、開発および商業DIST物質量に対する蛍光強度を相対的に較正するために使用される既知の組成の薄膜規格ributionも非常に重要であった。 このプロトコルは、化学固定し、空気乾燥による接着細胞の準備について説明します。このプロセスにおける重要なステップは、多くの場合、成功への特定のファッションのキーに優しいリンスを作り、うまく接着しないシリコン窒化窓に細胞の成長である。

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200&amp;nbsp;nm. Frame size: 5&amp;nbsp;mm x 5 mm. Frame thickness: 200 &amp;micro;m.</td><td>Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &amp;ndash; Ultra Fine Tweezers</td></tr><tr><td>Rubber grid mat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Round Grid Mat</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>trace metals grade concentrated acetic acid</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>solid PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stock solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

生物学的サンプルについての情報を提供するために、X線蛍光イメージングの能力は、これらのサンプルは、それらが実験の時間スケールでの放射線障害に対してロバストであるように準備され次第であり、しかもそれらの化学的および構造的特徴は周知である保存。固定は、細胞のこれらの側面に（ 図1）に保存されていることを示す-上述のように調製し、撮像されたサンプル?...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K ビュー.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

化学

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

環境学

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

生化学

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

生物工学

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

生物学

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

要約

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この動画の章

その場で検出および核マイクロプローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

要約

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その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

その場で検出および核マイクロプローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ