The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

ملاحظة: جامعة بيتسبرغ المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وافقت جميع التجارب. 1. إعداد الأدوات الموجات فوق الصوتية-حقن مكروي والأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء المرحلة، جبل، والتحقيق (الشكل 1)، وكذلك الأدوات الجراحية (الشكل 2). مكان الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (pH7.4) في 37 ° C حمام الاحترار. ملء حقن مكروي إبرة تماما مع الزيوت المعدنية، وذلك باستخدام 1 مل حقنة تعلق على الثانية مرن 25 G إبرة، من خلال قاعدته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح إبرة على دوران جبل الذراع، وإبرة فارغة من حل الزيوت المعدنية. إعادة ملء مع 2.5 ميكرولتر من حل TL. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء موجودة داخل إبرة الحقن. تدوير الذراع الإبرة نحو الجدار، بعيدا عن خشبة المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأم الحامل في غرفة التخدير عن طريق الحقن المستمر للالأيزوفلورين. عندما يتم تقديم الأم فاقد الوعي، ونقل التخدير لأنبوب الأنف المتمركزة على جالجانب audal من المسرح، والأم في مكان موقف ضعيف مع خطم في أنبوب الأنف للسماح استمرار حالة تخدير كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطرافه الشريط في 45 ° الزوايا، أو مع اليدين والقدمين راحة وضعه فاق ECG علامات التبويب / رصد درجة الحرارة. من المهم أن السد حامل يتم رصد مستمر لضمان التخدير غير كافية وأن مرهم في تطبيقها على العيون للحد من التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق لإزالة الشعر المنتج في جميع أنحاء البطن السفلي من الأم، ويمسح برفق باتجاه آخر مع قطعة قطن جافة، وبعد ذلك مرة أخرى مع 70٪ مسحات القطن المشبعة الإيثانول لإزالة أي منتج الزائدة والشعر. ضمان لتنظيف الجلد في منطقة البطن الخروج من كل الشعر في موقع شق (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء عملية فتح البطن على الأم الحامل باستخدام ملقط ومقص جراحي غرامة. الحرص على تجنب قطع أي الأوعية الكبرى أو الأعضاء الحشوية. تأكد أولا، شق التوالي من البشرة 1.5-2 سم فوق المهبل وواصل قطع نحو الأضلاع لapproximatاعل 2-3 سم. فضح الغشاء تحت الجلد، حدد موقع ألبا الخط (&quot;الخط الأبيض&quot;) (الشكل 3)، وقطع بالتوازي مع شق الأولي، وعلى طول طول نفس، لفضح الداخلية الأجهزة الحشوية والكييسات الرحم. </li></ol> 2. استخراج الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 6 بوصة تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمناورة الأم والأجنة. دفع بلطف (لا قوة) على الجلد مع قضيب للتلاعب الجنين الأول من افتتاح شق. بعد استخراج أول كيس الجنين، برفق وببطء سحب ما تبقى من قرن الرحم من خلال والخارج على الأم. تجنب سحب الأمعاء أو غيرها من الأجهزة من خلال شق في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة ووضع بلطف غادر قرن الرحم مرة أخرى إلى الأم. ثم يبدأ وضع الحق في الرحم القرن مرة أخرى إلى الأم بدءا من أبعد الجنين كيس من المهبل على قرن والتحرك نحو الانخفاض. يستمر هذا حتى تبقى سوى اثنين من الأجنة تتعرض (فايجوري 4). وأخيرا، الأجنة الموقف في عمود أعلاه وبالتوازي مع شق خط، ويجري تدرك لا لقطع الدورة الدموية في الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كتل من الطين وموقف بين الأسلحة والجسم، وكذلك الساقين والذيل. تأكد من أن الأسطح الطينية هي المستوى تقريبا مع شق البطن. الرطب طبق بيتري منوفذة مع 37 ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم توسيع ملقط مع اليد اليمنى وطبق بيتري منوفذة مع اليد اليسرى (نوفذة بالتوازي مع الأجنة) وجلب ملقط مغلقة ~ 5 سم، من خلال نوفذة، من أعلى طبق بيتري. ملقط مفتوحة تماما دون تمزق شبكة نوفذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناورة أيدي فوق الأجنة وتركز الأنظار على اثنين من الكييسات الجنين. دون (أو خفيفة) لمس الكييسات مع الربط بين نوفذة أو ملقط، مرر لهم من خلال شق ووضع طبق بتري على البطن الأم. مع ملقط لا يزال تمديد، والتلاعب شبكة منوفذة لمقعد على جانبي وعلى قاعدة من كل جنين (الشكل 5 </stرونغ&gt;) وسحب ملقط من افتتاح الشق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد ذلك، وضع المطاط الأزرق تحتوي على الجدار في طبق بتري، من دون معسر أو إصابة الأجنة (الشكل 6). جعل كتل من الطين والتأكد من تحقيق التوازن بحزم طبق بيتري، الجنين، والتي تحتوي على المطاط الجدار. وأخيرا، وملء طبق بيتري مع 37 ° C PBS حتى يتم المغمورة أجنة تماما (الشكل 6)، في حين تسيطر من وجود تسرب في الربط بين منوفذ. </li></ol> 3. إجراء حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقل مرحلة الحقن مع الأم والأجنة أسفل باستخدام مقبض تعديل مستوى Z (الشكل 1)، ثم تناوب حقن الإبرة وجبل الذراع ويصطف مباشرة مع مسبار الموجات فوق الصوتية، مع ½ سم الإبرة إلى اليسار وتحت تلميح التحقيق (الشكل 7) . دفع إبرة الذراع (لا إبرة) 45 درجة بعيدا عن التحقيق. يجب الحرص على عدم ضرب رأس الإبرة مع الطبق أو الموجات فوق الصوتية التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع مرحلة الحقن يعود إلى الارتفاع الأصلي، مع الموجات فوق الصوتية صرداء مباشرة فوق الأجنة التحقيق يجب أن غمرت قليلا وضمن 3-4 ملم من الأنسجة الجنينية. استخدام X &amp; Y المقابض التكيف المرحلة (الشكل 8) لتعديل الجنين / الأم / مرحلة يمكنها من تحديد موقع منهجي قلب الجنين الضرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة من مركز الشاشة الموجات فوق الصوتية مراقبة سوداء علامة المستهدفة مركز الانتباه (*). تحديد موقع البطين الأيسر (الأفضل) أو الأذين باستخدام المقابض التكيف مرحلة X &amp; Y (الشكل 8)، ثم رفع أو خفض مرحلة باستخدام مقبض دوار على المسرح لوضع هدف حقن بالضبط على مركز علامة سوداء على الشاشة الموجات فوق الصوتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام X التعديل مرحلة مقبض الباب لتحرك الجنين إلى اليمين، الخروج من الشاشة الموجات فوق الصوتية. إعادة حقن مكروي إبرة وتسليح العودة الى المكان، ½ سم بعيدا عن و90 درجة إلى مسبار الموجات فوق الصوتية (الشكل 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق حقن مكروي جبل المقابض التكيف (الشكل 9C-G)، موقف إبرة مع طرف بوضوح آلigned مع علامة المركز. ضبط زاوية حقن (باستخدام المقابض في الشكل 9C وEG)، وX، Y، Z وناقلات الإبرة الدقيقة لضمان ركز طرف الإبرة في الطائرة الصحيحة. التراجع عن حقن مكروي إبرة باستخدام فقط على &quot;حقن&quot; مقبض الباب (الشكل 9F)، الحرص على عدم ضبط أبعاد أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى، وذلك باستخدام فقط على X غرامة التكيف مرحلة مقبض الباب الخطوة الجنين مرة أخرى تحت التحقيق، مع الهدف بالضبط على العلامة مركز على الشاشة الموجات فوق الصوتية. تأكد من أن البطين الأيسر هو الآن بالضبط على نفس X، Y، Z والطائرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد ذلك، مع مجرد &quot;حقن&quot; مقبض الباب على حقن مكروي جبل، ثقب ببطء الجنين مع إبرة حقن مكروي وتقديم معلومات سرية تدريجيا إلى البطين الأيسر. ضخ 2.5 ميكرولتر كاملة من حل TL إلى البطين الأيسر أو حتى فارغة أصوات تحذير صفير، من خلال عقد &quot;فارغة&quot; والتنصت &quot;ملء&quot; مرة واحدة (أرقام 2A &amp; B). في هذا الوقتالحقن مراقبة الظل المنبثقة من رأس الإبرة وهو TL الدخول في غرفة القلب (الشكل 10). في الاتجاه المعاكس، يتراجع بسرعة حقن مكروي إبرة الدورية لل&quot;حقن&quot; مقبض الباب (الشكل 9F) على حقن مكروي جبل عندما حقن كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستمر إلى الجنين القادم، وكرر هذا الإجراء الأجنة المتبقية بعد هذه السلسلة من الخطوات ووضع أخيرا الأجنة النهائية مرة أخرى في البطن السد. التبديل التخدير إلى صندوق الغرفة وتحرك بلطف الأم هنا لمدة 15 دقيقة من وقت لآخر حقنة. </li></ol> 4. حصاد الأجنة وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية السد عبر خلع عنق الرحم. توسيع شق البطن لإزالة قرون الرحم بسهولة من الأم. الحفاظ على الأجنة داخل الرحم الكيس. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني مبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأجنة من الرحم كيس (إذا جمع الأنسجة اللازمة لالتنميط الجيني) ووضع الجنين كله أنان 4٪ لامتصاص العرق (PFA) بين عشية وضحاها، ثم إلى 30٪ سكروز بين عشية وضحاها، وتجميد ناظم البرد في باجتزاء المتوسطة. ثم قطع cryosection ووضعه على الشرائح للتحليل المناعى. اختياريا، واستخدام الأنسجة لكله يشن من قبل التجفيف في الميثانول بنسبة 100٪، بعد التثبيت في 4٪ PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل المناعى وضع cryosections في برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر ثم منع المقاطع مع 10٪ مصل حمار عادي لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة PECAM الأجسام المضادة الأولية في 1: 100 التخفيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وغسل الشرائح في PBT 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل وإضافة حمار لمكافحة الجرذان 594 الثانوي واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. ملاحظة: هذا هو أسلوب تطالب غاية تتطلب التحسين وتنسيق الموجات فوق الصوتية وحقن مكروي. هناك منحنى التعلم حاد جدا تتعلق هذه التقنية ويتطلب أربعة إلى ستة أسابيع من الحقن إرشادهم قبل واحد يصبح بارعا. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

التخدير حقن مكروي والإطار الزمني وفيما يتعلق تخدير الأم، فمن الضروري للحفاظ على ثبات تدفق الهواء (2-3 لتر / دقيقة) وعند انخفاض PSI. يجب أن تعقد تدفق مهدئ في حوالي الساعة 1،75 حتي 2 لتر / دقيقة. في وقت واحد والأطر الزمنية التي الحقن تتم يج?...

أثناء التطور الجنيني تأخذ اثنين منفصلة، ​​ولكن في وقت واحد، وعمليات الأوعية الدموية المكان: الأوعية الدموية، العملية التي تنمو سفينة من رئيسي موجودة من قبل السفينة، وتكون الأوعية، وهو تشكيل من جديد من السفن من الأسلاف البطانية السكنية 1،2. على التوالي، والسابق هو مرادف مع تدفق الدم، في حين يعتقد هذا الأخير أن يأخذ مكان إلى حد كبير في غياب ذلك. في وقت واحد لتشكيل الأوعية الدموية، عملية دورية وديناميكية من التوليف السلف الكلى خلية، والانتشار، والتمايز تبدأ تتكشف في يوم الجنينية 9.5 (E9.5). في هذه المرحلة مهدها الحالبي (UB) يغزو ظهريا إلى المحيطة اللحمة المتوسطة الكلوة التالية (MM)، ويستمر حتى الولادة 3. كرر المتفرعة من UB إلى التكثيف بسرعة الكلوة التالية سقف اللحمة المتوسطة يبدأ تشكيل وحدات وظيفية في الكلى، وكليون. مع كل جيل جديد من UB وnephرون، وتشرد الأجيال الأكبر سنا في المناطق القشرية والنخاعية الداخلية، حيث ثم الخضوع لمزيد من النضج والتمايز داخل البيئات في المقام الأول الأوعية الدموية-الكثيفة. كما يتضح من دريسلر وآخرون. 3، وعجلت هذه العملية الجنينية التي كتبها إشارات الاستقرائي، مثل الحديث المتبادل بين UB وMM، وعدد لا يحصى من العوامل خارج الخلية 3-6. عاملين خارج الخلية التحقيق مؤخرا داخل البنكرياس النامية والكلى وتشمل توتر الأكسجين وتدفق الدم 7،8. وسيتم مناقشة هذا الأخير في مزيد من التفاصيل أدناه مع يتعلق بالتنمية الكلى. من أجل فضح دور الاستقرائي أن تدفق الدم يلعب يحتمل أن تكون في كليون السلف تمايز الخلايا، وكذلك في عمليات توالد الأعضاء الأخرى، وأساليب محددة ودقيقة لرسم الخرائط الجنينية تدفق الدم أمر حتمي. طرق بديلة لقياس تدفق الدم وتشمل وصفة طبية من المجاهدينالتصوير trasound والراتنج يلقي 9،10. قاطع، وقد ثبت هذه الأوضاع أن هناك نقصا بطبيعتها في قدرتها على كشف بالتزامن تجاورات الزمانية والمكانية بين تدفق الدم وتمايز الخلايا الجذعية. يلقي الراتنج، وعلى سبيل المثال، تقدم نموذجا صالحا من الزخرفة سفينة داخل أنسجة البالغين، ولكن في السفن غير الناضجة، مثل مع النقاط الزمنية الجنينية، والسفن هي تعاني من التخلف الشديد وتتسرب منها المياه. ولذلك، الراتنج يلقي تفشل في عقد داخل الأوعية الصغيرة، التي يسهل اختراقها في كثير من الأحيان. لهذه العقبات واضحة، من بين أمور أخرى، اخترنا أن تدرج في الجسم الحي داخل القلب الجنينية كتين الطماطم (TL) إبر دقيقة جدا في تحقيقاتنا التنمية الكلى الموجهة بالأمواج فوق الصوتية. في هذا الإجراء نستخدم مسبار الموجات فوق الصوتية لتوجيه متزامن إبرة ممص مكروى شنت مليئة 2.5 ميكرولتر من حل TL إلى البطين الأيسر من أجنة الفئران في نقاط E11.5، E13.5، E15.5، والوقت E17.5. E17.5 هو أحدث سن التنموي مثل الإبر ليست قوية بما فيه الكفاية لاختراق الجنين أكثر تطورا. مزايا هذه الطريقة حقن مكروي وفيرة. الموجهة بالأمواج فوق الصوتية حقن مكروي يسمح تحديد المواقع بدقة من إبرة الحقن داخل البطين الأيسر الجنينية، طرد السلبي ورقابة من حل في القلب النابض للحيوان، والضرر الحد الأدنى من القلب والأنسجة المحيطة بها، وتجنب الفشل القلبي المفاجئ وفاة الجنين قبل التروية كامل الجسم. مع استخدام TL FITC المسمى، فإن أي الأوعية الدموية perfused لتحافظ على علامة على طول الغشاء القمي البطانية. في تركيبة مع المناعية، وذلك باستخدام PECAM (CD31، صفائح الدم البطانية جزيء التصاق الخلية) ومختلف علامات الأوعية الدموية الأخرى، ونحن قادرون على التمييز بوضوح بين السفن perfused لوالامم المتحدة وperfused ل، فضلا عن تميز أي تلطيخ الشاذة من الأنسجة المحيطة بها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

ودراسة سلوكه إلى حد كبير في تشكيل ونضح تطوير الأوعية الدموية الكلوية (بصرف النظر عن الكبيبات). ومع تطور الأوعية الدموية عبر الأوعية الدموية (والذي هو المتفرعة الخروج من السفن الكبرى) وتكون الأوعية (دي نوفو تشكيل السفينة)، تم تقنيات رسم الخرائط نضح مثل يلقي الراتنج، في الجسم الحي التصوير بالموجات فوق الصوتية، والصغرى تشريح محدودة في مما يدل على العلاقات الحميمة بين هاتين العمليتين والهياكل الكلى النامية في الجنين. هنا، نحن تصف إجراءات في الرحم داخل القلب الموجهة بالأمواج فوق الصوتية-FITC المسمى الطماطم إبر دقيقة جدا كتين على أجنة الفئران لقياس مدى تطور الجنين من نضح الكلوي. تم perfused لكتين الطماطم (TL) في جميع أنحاء الجنين والكلى المقطوع. وقد شارك في الأنسجة الملون لمختلف الهياكل الكلى بما في ذلك: الأسلاف نفرون، والهياكل كليون، الحالبي ظهارة، والأوعية الدموية. ابتداء من الساعة E13.5 السفن ذات عيار كبير وperfused ل، ومع ذلك المحيطيوظلت السفن unperfused. قبل E15.5 وE17.5، بدأت السفن المحيطية الصغيرة وكذلك الكبيبات لتصبح perfused ل. هذه التقنية التجريبية أمر بالغ الأهمية لدراسة دور الأوعية الدموية وتدفق الدم أثناء التطور الجنيني.

تشكيل الأوعية الدموية تسبق تدفق في تطوير الكلى أغلبية من الأنسجة الجنينية (بما في الكلى) تحتوي على الأوعية الدموية الكثيفة (سواء unperfused وperfused ل)، وحتى في وقت مبكر نقطة زمنية الجنينية. لأفضل مقياس وتحليل تدفق الدم داخل الكلى تطوير ع...

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

في حقن الرحم البينية القلب الطماطم كتين على أجنة الفئران لقياس تدفق الدم الكلوي

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Video: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

استخدام قياس التدفق الخلوي للكشف عن تكوين الدم المعدل وكميته في سمك الحمار الوحشي النامي

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

الصب الوعائي لرئتي فأرة ما بعد الولادة المبكرة للتصوير المقطعي المجهري

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.