وأيد هذا العمل من قبل أعداد منحة R01AI055001 وR01AI082127 من NIAID لإدارة الموارد الطبيعية وSREB جائزة الزمالة لأطروحة JLB.

1. وصفت فلوريسئين ديكستران GSL I-B 4 isolectin حقن الوريد الوجه لتسمية الأوعية الدموية الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد FITC-ديكستران (50ug/mL) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) في برنامج تلفزيوني في أنبوب إيبندورف 1.5mL ودافئة إلى 37 ° C. إضافة 100uL من الأسهم 1.25mM سريعة الأخضر / PBS في حل FITC-ديكستران (إجمالي حجم 1ML) و180uL من الأسهم 1.25mM سريعة الأخضر / PBS إلى ال 1 GSL - isolectin B 4 (مجموع حجم 200uL)، بحيث الحل هو الأزرق بوضوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح E14.5-E18.5 الأجنة وكيس المح معا، وترك ساق السقاء (الشريان والوريد السري) سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى طبق بتري جديد (60 X 15 ملم) وتزج بهم في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين لتقديم وجهة نظر السهمي من الرأس / الوجه. استخدام ملقط تشريح الدقيقة لفهم بلطف الجنين في الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة 30G، وضخ 50uL FITC-ديكستران (50ug/mL) أو GSL1 - isolectin B 4 (PBS 20ug في 200uL) في الوريد الوجه مشيرا الإبرة نحو الجزء الخلفي من الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الصبغة مرئيا في الوريد السري، وإزالة الإبرة وفصل الجنين من ساق السقائي (الشريان والوريد السري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، والسماح الجنين على البقاء في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق حتى الصبغة يدور في جميع أنحاء الجنين. </li></ol> 2. كامل جبل تحليل الأوعية الدموية الجلد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد السماح الصبغة أن يعمم في جميع أنحاء الجنين، وإزالة الجلد عينات من مناطق في الأطراف والظهر والمعدة و، الخ. 8،9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجلد في عينة PBS الباردة، وإصلاح في PFA 4٪ / لمدة 2 ساعة PBS 8،9. يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل من القارورة واضحة 4mL مع 2mL الباردة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان عينة الجلد على شريحة المجهر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل شريحة متزايدة والزجاج غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح لتجف في منطقة التخزين الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proceed إلى الخطوة الباب &quot;الحصول على صورة&quot; 2. </li></ol> 3. متعددة الألوان والعلامات على الغدة الصعترية الأوعية الدموية والخلايا حول الأوعية القلبية لcryosections (متابعة من القسم 1، الخطوة 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;فلاش تجميد &#39;الجنين كله في النيتروجين السائل. يمكن أن تكون الأجنة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، من تشريح الغدة الصعترية، وشطف في 4 PBS C °، وإصلاح في 2mL امتصاص العرق 4٪ (PFA) / برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة. يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني الباردة، التوتة مكان في OCT، وتجميد وتخزين حتى استخدام في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لcryosectioning، وانتشار أكتوبر على &#39;وقف&#39; قسم تحميل والجنين أو أجهزة تشريح / أنسجة لتقطيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة المجمدة في البابين 10 ميكرومتر سميكة وجمع على الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح المقاطع في الأسيتون لمدة 5-10 دقائق. يغسل 3 مرات في TBS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع 10٪ في المصل حمار / TBS في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ليلة وضحاها أقسام ساعة مع 100 ميكرولتر من الابتدائيالأجسام المضادة في غرفة الرطوبة في 4 درجات مئوية: في هذا المثال، فإننا نستخدم الفئران لمكافحة فأر CD31 (1:100) لالبطانة التسمية، والماعز المضادة للماوس PDGFR-β (1:100) لتسمية الخلايا حول الأوعية. ومن المفيد لتغطية الشرائح مع شرائط Parafilm خفض بشكل فردي لضمان أن ينتشر بشكل موحد في جميع أنحاء الجسم المضاد القسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل أقسام 3 مرات في TBS الباردة. احتضان مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الحد الأدنى المناسب ل30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات في TBS الباردة. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل شريحة متزايدة والزجاج غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح لتجف في منطقة التخزين الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى قسم &quot;الحصول على صورة&quot;. </li></ol> 4. متعددة الألوان وسم الأوعية الدموية والخلايا حول الأوعية الغدة الصعترية لأقسام vibratome (متابعة من القسم 1، الخطوة 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح من فصوص الغدة الصعترية من الجنين وشطف في برنامج تلفزيوني الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الغدة الصعترية في PFA 4٪ / PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعةق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في برنامج تلفزيوني-X تريتون (0.15٪) 3 مرات، و10 دقائق التوتة مكان في خرطوشة من البلاستيك الصغيرة ويغرق في 4٪ انخفاض ذوبان الاغاروز / PBS (~ 4 ° C). يجب أن تكون على اتصال الغدة الصعترية مع الجزء السفلي من الخرطوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ الاغاروز على الجليد (3-5 دقائق). استخدام شفرة حلاقة لقطع الاغاروز الزائدة. إضافة الغراء إلى كتلة vibratome والالتزام عينة إلى كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حمام الباردة PBS المياه vibratome حتى يتم مغمورة العينة والنصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين السرعة والسعة (السعة العالية والسرعة المنخفضة المعتدلة مثالية للأقسام الغدة الصعترية لينة). ينبغي خفض السعة إذا أقسام تفريق بسبب التحريض الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض 50 أقسام ام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام، وجمع المقاطع في صفيحة ميكروسكوبية 24 بشكل جيد في PBS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام كتلة في 500 ميكرولتر من المصل حمار 10٪ في PBS-تريتون X (0.15٪) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 8 ساعات أقسام ليلة وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية، مثل CD31 المضادة للطائرات والمضادة للPDGFR β-، في صفيحة ميكروسكوبية 24-غطت بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات في PBS-تريتون X (0.15٪) على ما مجموعه 8 ساعات في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام كتلة في المصل حمار 10٪ في PBS-X تريتون (0.15٪) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 8 ساعات أقسام ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات في PBS-X تريتون (0.15٪) على ما مجموعه 8 ساعات في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الإصلاح في عينات PFA 4٪ / PBS لمدة 30 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات في PBS-X تريتون (0.15٪) أكثر من 30 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى عينات من خلال سلسلة متدرجة X MeOH / PBS-تريتون: 25٪ MeOH، MeOH 50٪، 75٪ MeOH، و 100٪ في MeOH 10 دقائق لكل خطوة. استبدال MeOH 100٪ مع MeOH جديدة بعد 10 دقائق، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وعاء زجاجي، مزيجا BABB (البنزيل الكحول: بنزوات البنزيل) في نسبة 1:2. الجمع بين BABB مع MeOH لتركيز النهائي من 50٪ وBABB MeOH 50٪. احتضان العينة في BABB: MeOH لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل SAmple إلى وعاء زجاجي مع BABB 100٪ واحتضان لمدة 10-15 دقيقة أو حتى تطهيرها، في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الشريحة الاكتئاب (0.7mm العمق) مع الطازجة BABB 100٪ وعينة نقل إلى الجانب. إضافة تغطية الزجاج (رقم 1.5) وختم مع 2-3 طبقات من طلاء الأظافر. تسمح طلاء الأظافر لتتصلب في الظلام في درجة حرارة الغرفة، ثم تخزين العينة في C. ° 4 ملاحظة: يجب الشرائح مختومة تماما قبل الحصول على الصور مبائر. وينبغي الحصول على صور داخل 12-24 ساعة، والأصباغ الفلورية يمكن أن تتلاشى في BABB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى قسم &quot;الحصول على صورة&quot;. </li></ol> 5. الصورة اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة رقم 10 ميكرومتر المقاطع المجمدة مع المجهر متحد البؤر باستخدام خطة لامزيغ-20X/0.8 الهدف (512 X 512 بكسل) مع 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4)، 543 -، وخطوط الليزر 633-نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مبائر Z-مقاطع من الجلد جبل كامل و 50 ميكرومتر الاغاروز جزءا لا يتجزأ من خطة أقسام باستخدام-Apochroma<html> ر 10X/0.4 الهدف (512 X 512 بكسل) مع 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4)، 543 -، وخطوط الليزر 633-نانومتر. وينبغي جمع المسلسل Z-المقاطع بالتسلسل في ميكرون-1 لكل قناة منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة المسلسل Z-المقاطع باستخدام زايس Axiovision 4.6 أو غيرها من البرامج تحليل الصور. </li></ol> 6. ممثل النتائج: وضع العلامات كفاءة الأوعية الدموية الجنينية هو أمر حاسم لتقييم عيوب الأوعية الدموية في الفئران الجنينية. ويظهر الشكل 1 وضع العلامات المحددة للE16.5 الأوعية الدموية الغدة الصعترية (1A-B) وشارك في وضع العلامات مع CD31 (1B)، بالإضافة إلى تلطيخ من البطينين الأيمن والأيسر (1E-F) على التوالي. تم استخدام I-isolectin GSL B 4 بروتوكول للcryosections كما هو موضح في الأبواب 1 و 3 و 5 في هذه التجارب. جبل كامل وصفها للسفينة شبكة الدم على الجلد E16.5 الفئران، وذلك باستخدام بروتوكولات المبينة في القسمين 1 و 2، ويظهر الشكل 5 في 1C-D. ntent &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg" /> الشكل 1 أسطورة. FITC GSL I - isolectin B 4 حقن الوريد الوجه في أجنة الفئران E16.5. وCryosection. من الغدة الصعترية الجنينية بعد الحقن. ب. دمج من شارك في وضع العلامات CD31 مع B isolectin 4. ج. ود. الجامعة جبل من الجلد الجنينية حقن الأوعية الدموية التالية. ه. وو. Cryosection ه القلب الجنينية. (يمين البطين) و (البطين الأيسر) الحقن التالية.

<ol>
	<li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus.">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture.">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus.">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li><li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus.">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization.">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li><li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice.">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

جبل كامل وPECAM 1-(CD31) على تلطيخ أقسام هي الأساليب التقليدية لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية. هذه الأساليب تتطلب استخدام المناعي المباشر و / أو غير المباشرة، والمنظفات لpermeabilize الأنسجة الماوس. هذا يبرهن على أن تكون عملية في الوقت المناسب إلى حد ما. هنا، لقد است?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th></tr><tr><td> FITC-ديكستران </td><td> سيجما </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> فلوريسئين المسمى GSL 1 - B 4 isolectin </td><td> ناقلات المختبرات </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> سريع الأخضر </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> أتلانتا الحيوية </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> درجة الحرارة المثلى مجمع قطع (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> الأسيتون </td><td> JT بيكر </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> حمار المصل </td><td> جاكسون </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> الفئران مكافحة CD31 الماوس، </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للماوس PDGFR-β </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> حمار مكافحة الفئران CD31 اليكسا 647 (إينفيتروجن) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> حمار مكافحة الماعز اليكسا 594 (إينفيتروجن) </td><td> إينفيتروجن </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> تريتون X -100 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> انخفاض ذوبان الاغاروز / PBS </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> فيشر العلمية </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> البنزيل الكحول </td><td> أكروس العلمية </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> بنزيل بنزوات </td><td> أكروس العلمية </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> الاكتئاب الشرائح </td><td> فيشر العلمية </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> تغطية الزجاج (22X22) -1.5 </td><td> علميا الحراريةج </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> زايس LSM 510 مجهر متحد البؤر ميتا </td><td> زايس </td><td></td></tr><tr><td> ملقط تشريح الصغيرة </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm رقم OM992 </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 و 24 microplates جيدا </td><td> دائمة الخضرة العلمية </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> شرائح المجهر Superfrost / بلس </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL قوارير واضحة </td><td> العلمية الوطنية </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

a method for labeling vasculature in embryonic mice

إنشاء شبكة الأوعية الدموية الوظيفية هو جزء أساسي من توالد الأعضاء، ومطلوب من أجل وظيفة الجهاز الأمثل. على سبيل المثال، في تشكيل الأوعية الدموية السليمة الغدة الصعترية والزخرفة أمر ضروري لدخول خلية توتية في الجهاز وناضجة الخلايا T-الخروج إلى المحيط. الترتيب المكاني للأوعية الدموية في الغدة الصعترية يعتمد على إشارات من المكروية المحلية، وهي الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TEC). التقارير الأخيرة تشير إلى أن العديد من تعطيل هذه النتائج في الغدة الصعترية إشارات عيوب الأوعية الدموية 1،2. وقد وصفت دراسات سابقة التقنيات المستخدمة لتسمية المواليد والأوعية الدموية الغدة الصعترية الكبار 1،2. نبين هنا تقنية لوصفها الأوعية الدموية في الغدة الصعترية الجنينية. هذا الأسلوب يجمع بين استخدام FITC-ديكستران أو غريفونيا (Bandeiraea) Simplicifolia I كتين (GSL 1 - isolectin B 4) حقن الوريد الوجه والجسم المضاد تلطيخ CD31 لتحديد الغدة الصعترية فاهياكل scular وPDGFR β-لتسمية الغدة الصعترية حول الأوعية اللحمة المتوسطة 3-5. وتقدم أيضا خيار استخدام cryosections أو أقسام vibratome. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العيوب الأوعية الدموية الغدة الصعترية، وهو أمر حاسم لتحديد أدوار جزيئات TEC المستمدة من الغدة الصعترية في الدم تشكيل السفينة. كأسلوب تصف الأوعية الدموية بأكملها، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتحليل الشبكات الأوعية الدموية في عدة أعضاء وأنسجة الجنين بما في ذلك في جميع أنحاء الجلد والقلب 6-10.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice at JoVE.com

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

هذه المقالة طريقة لوصفها الجلد والأوعية الدموية الجنينية الغدة الصعترية.

A طريقة لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  University of Georgia. هذه المقالة طريقة لوصفها الجلد والأوعية الدموية الجنينية الغدة الصعترية.

Video: A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D التصوير تعدد الوسائط من<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; التهابات في الفئران

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

التعريفي للشلل وإصابة النظام المرئي في الفئران التي تي الخلايا المحددة للبصري المياليني أقوابورين أوتوانتيجين-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

طريقة لقياس وظيفة الغدة اللعابية في الفئران

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death through pulmonary embolism or results in the post-thrombotic syndrome, characterized by chronic leg pain, swelling, and ulceration, or in chronic pulmonary hypertension resulting in significant chronic respiratory compromise. This is the most common cardiovascular disease after myocardial infarction and ischemic stroke and is a clinical challenge for all medical disciplines, as it can complicate the course of other disorders such as cancer, systemic disease, surgery, and major trauma.
Experimental models are necessary to study these mechanisms. The stasis model induces consistent thrombus size and a quantifiable amount of thrombus. However, it is necessary to systematically ligate side branches of the inferior vena cava to avoid variability in thrombus sizes and any erroneous data interpretation. We have developed a non-invasive technique to measure thrombus size using ultrasonography. Using this technique, we can assess thrombus development and resolution over time in the same animal. This approach limits the number of mice required for quantification of venous thrombosis consistent with the principle of replacement, reduction, and refinement of animals in research. We have demonstrated that thrombus weight and histological analysis of thrombus size correlate with measurement obtained with ultrasonography. Therefore, the current study describes how to induce deep vein thrombosis in mice using the inferior vena cava stasis model and how to monitor it using high frequency ultrasound.

The present protocol describes the steps to obtain venous thrombosis using a stasis model. In addition, we are using a non-invasive method to measure thrombus formation and resolution over time.

تجلط الوريد العميق الناجم عن ركود في الفئران التي يرصدها الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

أسلوب نانوحبيبات الفضي للتخفيف من حدة المتلازمة الكبدية الصفراوية في الفئران

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...