The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

참고 : 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 실험을 승인했다. 초음파 미세 주입 장비 및 태아의 1. 준비 <ol><li> 단, 마운트 및 프로브 (그림 1)과 수술 도구 (그림 2)를 설정합니다. 37 ° C 온난화 목욕 장소 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 (pH 7.4로). 그 자료를, 제 2가요 25 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 전적으로 미세 주사 바늘을 입력합니다. </li><li> 회전에 바늘을 고정 마운트 암, 미네랄 오일 솔루션의 빈 바늘. TL 솔루션의 2.5 μL에 다시 입력합니다. 공기 방울이 주사 바늘 내에 존재 없는지 확인합니다. 멀리 단계에서, 벽을 향해 바늘 암을 돌립니다. </li><li> 이소 플루 란의 연속 주입을 통해 마취 실에서 임신 한 어머니를 마취. 어머니가 무의식 경우, C에 위치 코 튜브에 마취를 전송코 튜브의 주둥이와 앙와위에서 audal 무대의 측면, 그리고 장소 어머니는 완전히 마취 상태의 지속을 허용합니다. </li><li> 45 ° 각도에서, 또는 손과 발을 테이프 사지는 휴식과 솟다 ECG / 온도 모니터 탭에 위치. 이는 임신 댐 지속적 그 마취를 위해 모니터링하는 것이 중요 충분하며, 눈에인가에 해당 연고 건조 감소. </li><li> 부드럽게 초과 제품과 머리를 제거하기 위해 70 % 에탄올 포화 면봉으로 다시 마른 면봉으로 닦아하고, 어머니의 하복부에 걸쳐 머리 제거 제품을 적용합니다. 절개의 사이트 (그림 3)에서 모든 머리 떨어져 복부 피부를 청소해야합니다. </li><li> 미세 수술 집게와 가위를 사용하여 임신 어머니에 개복술을 수행합니다. 주요 혈관이나 내장 기관을 절단 않도록주의하십시오. 1.5 cm 질보다 먼저 표피의 직선 절개를하고 approximat 리브으로 잘라 계속엘리 2-3 cm. 내장 기관과 자궁 saccules 내부를 노출, 동일한 길이를 따라, 피하 막을 노출 원격 교육 알바 ( &quot;화이트 라인&quot;) (그림 3)를 찾아 초기 절개에 평행하게 잘라. </li></ol> 태아의 2. 추출 <ol><li> 어머니와 배아를 기동 6 인치 면봉을 사용합니다. 조심스럽게 절개 개방에서 처음으로 배아를 조작 할 수 주걱으로 피부에 (강제하지 않음) 누릅니다. 최초의 배아 saccule의 추출 후, 부드럽게 천천히 통해 어머니의 외부에 자궁 뿔의 나머지 부분을 잡아 당깁니다. 이 단계에서 절개를 통해 소장 또는 다른 장기를 당겨하지 마십시오. </li><li> 배아를 정량화하고 부드럽게 어머니로 다시 왼쪽 자궁 경적을 배치합니다. 그런 다음 뿔에 질에서 배아 saccule 멀리 시작하여 아래쪽으로 이동 다시 어머니에 오른쪽 자궁 경적을 배치 시작합니다. (두 개의 배아가 노출 남아 때까지 Fi 인터넷이 계속gure 4). 마지막으로, 위의 열 병렬로 위치 배아는 자궁 순환을 차단하지 인식되고, 선을 절개합니다. </li><li> 팔과 몸뿐만 아니라 다리와 꼬리 사이에 점토 블록과 위치를 놓습니다. 점토 표면이 개복 수술 절개와 약 수준 있는지 확인합니다. 37 ° C PBS로 유창 페트리 접시를 젖은. </li><li> 왼쪽 (배아 창호 병렬)와 오른손과 유창 페트리 접시와 연장 집게를 잡고 페트리 접시의 상단에서, 창호를 통해 폐쇄 집게 ~ 5 cm를 가져온다. 완전히 창호 메쉬를 찢어없이 열기 집게. </li><li> 배아 위에 손을 책략과 두 개의 배아 saccules에 시력을 초점을 맞추고있다. 없이 (또는 가볍게) 슬릿을 통해 슬라이드와 어머니의 복부에 페트리 접시를 설정, 창호 메쉬 또는 집게로 saccules을 터치. 집게가 계속 확장으로, (양쪽에 각각 배아의 기지에서 그것을 장착 할 때 그림 5 유창 메쉬를 조작 </st룽&gt;)과 슬릿 개방에서 집게를 잡아 당깁니다. </li><li> 다음으로, (그림 6) 곤란 또는 배아를 손상없이 페트리 접시에 벽을 포함하는 파란색 고무를 배치합니다. 확인 점토 블록을 단단히 페트리 접시, 배아, 고무 함유 벽을 균형되어 있는지 확인합니다. 유창 메쉬에서 누출을 제어하면서 배아가 완전히 (그림 6) 침수 될 때까지 마지막으로, 37 ° C PBS와 페트리 접시를 입력합니다. </li></ol> 3. 사출 절차 <ol><li> 다음 낮은 사출 어머니와 배아 다운 Z-레벨 조정 노브 (그림 1)를 사용하여 함께 무대 및 프로브 팁 왼쪽과 아래 바늘 ½ 센티미터로, 주사 바늘을 ​​회전하고 팔을 탑재하고 초음파 프로브와 직접 줄 (그림 7) . 45 ° 거리 프로브에서 바늘 팔 (안 바늘)을 밀어 넣습니다. 접시 또는 초음파 프로브 바늘의 끝 부분을 충돌하지 않도록주의하십시오. </li><li> 초음파 페이지로, 다시 원래의 높이에 주입 단계를 올립니다직접 배아 프로브 위의 옷은 약간 잠긴 배아 조직의 3-4mm 내에서해야합니다. 사용 X &amp; Y 단계 조절 노브 (그림 8)는 체계적으로 박동 배아 마음을 찾습니다 배아 / 어머니 / 무대 위치를 수정합니다. </li><li> 직접 초음파 화면의 중심이 그려진 검은 센터 대상 마커 (*)를 관찰한다. X &amp; Y 단계 조절 노브를 사용하여 좌심실 (바람직한) 또는 심방 (그림 8)를 찾은 후 올리거나 초음파 화면에 검은 센터 마커를 통해 정밀하게 분사 대상의 위치를 무대에 회전 노브를 사용하여 무대를 내려 놓습니다. </li><li> 초음파 화면 오프, 오른쪽으로 배아를 이동 X 단계 조절 노브를 사용합니다. ½의 거리에서 cm 및 초음파 프로브 90 ° (그림 7), 미세 주사 바늘의 위치를 변경하고 다시 제자리에 팔. </li><li> 미세 주입 명확하게 팁 등으로 조정 노브 (그림 9C-G), 위치 바늘을 장착하여중앙 마커 igned. 니들 팁 올바른 평면 집중되도록하고, X, Y, 및 미세 니들의 Z 벡터 (도 9C 및 EG의 손잡이를 사용하여) 사출 각도를 조정한다. 오직 &quot;주입&quot;노브 (그림 9F)를 사용하여 미세 주사 바늘을 ​​후퇴, 조심하지 다른 크기를 조정합니다. </li><li> 다시, 정확하게 초음파 화면 중심 표시 대상에서 다시 프로브하에 전적으로 X 미세 조정 스테이지 노브 배아 움직임을 이용하여. 좌심실 정확히 같은 X, Y 및 Z 평면에 지금 있는지 확인하십시오. </li><li> 미세 주입에 그냥 &quot;주입&quot;노브 마운트와 다음, 천천히 미세 주사 바늘로 배아에 구멍을 점차적으로 좌심실에 팁을 가져. 한 번 (그림 2A &amp; B)를 &quot;빈&quot;잡고 &quot;입력&quot;눌러 빈 경고음 소리 좌심실로 또는 때까지 TL 솔루션의 전체 2.5 μl를 주입한다. 이 때주사의 심장 챔버로 유입되는 TL (그림 10)는 바늘의 끝에서 나오는 그림자를 관찰한다. 반대로, 빠르게 주입이 완료되면 마이크로 인젝션에 &quot;주입&quot;노브 (도 9F)가 회전 마운트 마이크로 인젝션 니들을 후퇴. </li><li> 다음 배아에 계속 이러한 일련의 단계 다음 남은 배아에 대해이 절차를 반복하고 마지막으로 다시 댐의 복부에 최종 배아를 놓습니다. 챔버 상자로 마취를 전환하고 부드럽게 마지막 주입 시간에서 15 분 동안 여기에 어머니를 이동합니다. </li></ol> 4. 수확 배아 및 분석 <ol><li> 자궁 경부 전위를 통해 댐을 희생. 쉽게 어머니의 자궁 뿔을 제거하는 개복 수술 절개를 확장합니다. 자궁 주머니 내에서 배아를 유지합니다. 냉장 PBS에서 배아를 놓습니다. </li><li> (경우 유전자형에 필요한 수집 조직) 자궁 주머니에서 배아를 해부하고 전체 배아를 배치 전n은 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 하룻밤, 그 다음으로 30 % 자당 하룻밤, 매체 단면 저온 유지 장치에 고정. 그런 다음 동결 절단 (Cryosections)을 절감하고 면역 조직 화학 분석을위한 슬라이드에 배치합니다. 선택적으로, 조직에 대한 사용을 100 % 메탄올 탈수 4 % PFA로 고정을 수행하여 전체를 실장. </li><li> 면역 조직 화학 분석을 위해 OCT를 제거하기 위해 PBS에 저온부를 배치합니다. 그런 다음 30 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 섹션을 차단합니다. 그런 다음 1 PECAM 차 항체를 추가 : 100 희석 4 박 ° C에서. 다음 날, 10 분 각각 PBT 3 번 슬라이드를 세척 및 보조 당나귀 안티 쥐 594를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 :이 초음파와 미세 주입의 최적화 및 조정을 필요로하는 매우 까다로운 기술이다. 이이 기술에 관련된 매우 가파른 학습 곡선이고 하나는 능숙되기 전에 멘토링 주사 4 ~ 6 주 정도가 필요합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

마이크로 인젝션 마취 시간 프레임 어머니의 마취에 관해서, 그것은 공기 흐름 상수 (2-3 L / 분)과 낮은 PSI에 유지하는 것이 필수적입니다. 진정제의 흐름 / 분 약 1.75-2 L에서 개최합니다. 동시에, 주사가 수행하는 시간대는 면밀히 관찰하고 각각의 쓰레기에 대한 제어되어야한다. 각 쓰레기를 들어 주사 과정은 45 분하에 유지되어야한다. 각각의 배아 체 관심 장기에 걸쳐 조절...

배아 개발하는 동안 두 개의 분리 된, 그러나 동시에, 혈관 프로세스는 자리를 차지할 : 혈관 신생을, 과정을 선박이 주거 내피 전구 세포 1,2에서 선박의 새로이 형성이 큰 기존의 선박 및 혈관 형성에서 성장된다. 후자는 주로 그것의 부재하에 일어날 것으로 생각되는 반면, 각각 전자는 혈류와 동의어이다. 혈관 형성에 동시, 신장 전구 세포 합성, 증식, 분화의 순환과 역동적 인 과정은 배아 일 9.5 (E9.5)에 전개하기 시작한다. 이 시점에서 ureteric 버드 (UB)는 metanephric 중간 엽 (MM)를 주변에 등쪽에 침입, 출생 3 때까지 계속됩니다. 빠르게 metanephric 캡 중간 엽 응축에 UB의 분기에 반복 신장의 기능 단위, 네프론의 형성을 시작합니다. UB와 neph의 모든 새로운 세대와 함께론은, 이전 세대들은 다음 주로 혈관 밀도가 높은 환경에서 더욱 성숙과 분화를 거쳐 내부 피질과 수질 지역으로 변위. 레슬러 외. (3)에 의해 입증되는 바와 같이,이 프로세스는 예컨대 배아 UB 및 MM, 및 세포 외 인자 3-6의 무수 간의 크로스 토크로, 시그널링 유도하여 침전된다. 두 최근 조사 외 개발 췌장 내 요인과 신장 산소 긴장과 혈액의 흐름 7,8를 포함한다. 후자는 신장 개발과 관련하여 이하​​에서 더 상세히 설명 될 것이다. 혈류 잠재적 네프론 전구 세포 분화뿐만 아니라 다른 기관 형성 공정, 배아 혈류 맵핑의 정밀하고 정확한 방법으로 재생되는지 유도 역할을 노출하기 위해 필수적이다. 혈류 이징의 다른 방법은 UL의 처방을 포함trasound 이미징 및 수지는 9,10을 캐스팅합니다. 결론적으로, 이러한 모드는 동시에 본래 혈류 간의 공간적 병치을 공개하고 세포 분화 줄기 능력이 부족한 것으로 밝혀졌다. 수지 캐스팅은, 예를 들면, 그러나 배아 시점과 같은 미성숙 용기에, 성인 조직 내의 혈관 패턴의 유효한 모델을 제공하는, 선박 조잡한 외교적 누설이다. 따라서, 수지, 자주 다공성, 작은 혈관 내에 유지하는 데 실패 캐스트. 이러한 명백한 장애물, 다른 사람의 사이에서, 우리는 초음파 유도 신장 개발의 우리의 조사에 생체 내 심장 배아 토마토 렉틴 (TL) microinjections에 통합하기로 결정했습니다. 이 절차에서는 동기 E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 및 시점에 마우스 배아 좌심실 TL 용액 2.5 μL를 가득 탑재 마이크로 피펫을 안내하는 바늘 초음파 프로브를 이용한다. E17바늘이 더 발달 된 배아를 관통 할만큼 강하지으로 0.5 최신 개발 시대입니다. 이 미세 주입 방법의 장점은 풍부하다. 초음파 유도 미세 주사는 정확한 배아 좌심실 내 주사 바늘의 위치, 동물, 심장 손상을 최소화하고 주변 조직의 고동 치는 심장에 솔루션의 수동 및 제어 추방, 갑자기 심장 장애의 회피와 죽음을 수 있습니다 배아 전신 관류 전에. FITC 표지 된 TL를 이용하여, 임의의 관류는 혈관 내피 세포의 정단 막 따라 마커를 유지할 것이다. 면역 함께, PECAM (CD31, 혈소판 내피 세포 접착 분자) 및 기타 다양한 혈관 마커를 이용하여 알기 쉽게 할 수있는 관류 비 - 관류 용기 구별뿐만 아니라 주변 조직의 모든 비정상적인 얼룩을 특성화.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

형성 및 (떨어져 사구체) 신장 혈관의 관류 현상 understudied 크게된다. 혈관은 수지 캐스트, 생체 초음파 이미징 및 마이크로 해부와 같은 관류 매핑 기술 사이의 친밀한 관계를 입증 제한되었습니다 (드 노보 혈관 형성)과 혈관 생성 (주요 혈관의 떨어져 분기 인) 혈관을 통해 개발로 배아 내에서이 두 가지 프로세스와 개발 신 구조. 여기서 우리는 신장 관류의 개체 발생을 측정하기 위해 마우스 배아에 자궁 내 심장 초음파 유도 FITC 표지 토마토 렉틴 microinjections에서의 절차를 설명합니다. 토마토 렉틴 (TL)를 수확 배아 신장에 걸쳐 관류했다. 네프론 전구 세포, 네프론 구조, ureteric 상피 세포 및 혈관 : 조직을 포함, 다양한 신장의 구조에 대해 공동으로 염색 하였다. E13.5 구경이 큰 혈관에서 시작하는 것은, 그러나 말초 관류선박 unperfused 남아 있었다. E15.5 및 E17.5으로 작은 말초 혈관뿐만 아니라 사구체 관류 될 시작했다. 이러한 실험 방법은 배아 발생 동안 혈관 혈류의 역할을 연구하는데 중요하다.

혈관 형성은 신장을 개발 흐름을 선행 (신장 포함) 배아 조직의 대부분은 심지어 초기 배아 시점에서, 조밀 한 혈관 (unperfused 및 관류 모두)가 포함되어 있습니다. 개발 신장 내에서 더 나은 게이지 분석 혈액의 흐름에 우리는 자궁 내 배아 심장 내 microinjections의 방법을 이용했다. 개복술을 통해 추출 번의 자궁 saccule 노출 다음 E17.5 통해 E11.5에서 배아 심장을 식별하는 고해상?...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K 조회수.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

발생학

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

손쥐 태아 Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

비 침습 M-모드 초음파 심장 검진 법에 의한 마우스의 심장 박동의 자궁 측정

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Β-aminopropionitrile-유도 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 Aortopathy의 양적 마이크로 CT 분석

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...