واعترف بشكل كبير على إذن من الوثاب وإلسفير في إعادة طبع الأرقام.

1. عزل E. القولونية المشارك transformants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في E. المناسب سلالة القولونية إلى أن تتحول. نقل إلى 1 مل من LB المتوسطة (تريبتون، مستخلصات الخميرة، كلوريد الصوديوم بنسبة 10، 5، و 10 غرام / لتر على التوالي) مستعمرة واحدة من سلالة من الاختيار، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف تهتز من 180 دورة في الدقيقة. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في 25 مل من الطازجة المتوسطة LB واحتضان الثقافة في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة)، و resuspend بيليه في 10٪، والخامس / الخامس للمياه معقمة الجلسرين الجليد الباردة في نصف حجم ثقافة الأصلي. كرر هذه الخطوة 4 مرات، في كل مرة خفض حجم إعادة تعليق. وأخيرا، resuspend الكرية في الجلسرين / المياه وتقسيم تعليق الخلايا في 50 مكل. تخزين aliquots في -80 ° C تصل إلى 6 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل البلازميد المطلوب في الماء المعقم تستكمل مع 0.5 ملي EDTA. ذوبان الجليد على جيمالبريد قسامة من الخلايا الكهربائية المختصة وتخلط مع كمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من النواقل. الاستغناء الخليط في 0.1 سم كفيت مناسبة ل electroporation، وتطبيق 1.8 كيلو فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل الخلايا electroporated في 1 مل من SOC المتوسطة (LB المتوسطة تستكمل مع 0.2٪ ث / ت الجلوكوز، 10 ملي MgCl 2، 2.5 ملي بوكل)، واحتضان لمدة 1 ساعة تحت الهز، وأخيرا نقل 100 مكل إلى أطباق بتري تحتوي على LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية transformants بواسطة تسليط الضوء على المستعمرات واحد على أطباق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في transformants الابتدائية وكرر الخطوات من 1،1-1،5 لتحويل مع مزيد من البلازميدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مخزون الجلسرين من شارك في transformants. نقل مستعمرة واحدة في LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت الهز، والمعرضة للمرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في LB-المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسطة 15٪ ت / ت الجلسرين. الاستغناء في مأخوذة وتخزينها في - 80 ° C. </li></ol> 2. المشارك التعبير عن α ε والوحدات الصغرى من E. القولونية البلمرة DNA III <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مع حلقة عقيمة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين سلالة المناسب (على سبيل المثال، TOP10 / pGOOD-ε243 وTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160، انظر الشكل 1) في طبق بتري تحتوي على LB المتوسطة والمضادات الحيوية. السماح للخلايا جافة تعليق على طبق بيتري، ومسحة الخلايا الحبرية. احتضان عند 37 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل، وذلك باستخدام مسواك العقيمة، مستعمرة واحدة في 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان 8 ساعة عند 37 ° C. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في متوسطة جديدة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة IPTG، أرابينوز، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. جمع الخلايا، وتخزين الكريات في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات ذوبان الجليد على الجليد و resuspend في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي dithiothreitol، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، ودرجة الحموضة 8). التجانس بلطف تعليق الخلايا مع بوتر الزجاج البارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن في 15 W لمدة 15 ثانية، تليها 15 ثانية فاصل التبريد (4 دورات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي إجمالي مقتطفات البروتين في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة، في 4 درجات مئوية لاسترداد جزء القابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل بواسطة SDS-PAGE (12.5٪ الأكريلاميد) aliquots من كل استخراج البروتين القابلة للذوبان. لتحقيق هذا الهدف، ونقل 20 ميكرولتر من كل مستخلص بروتين قابل للذوبان لأنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ (ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة. </li></ol> 3. المشارك التعبير عن α الوحدة الفرعية من Deinococradiodurans سلطات الجمارك البلمرة DNA الثالث وε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA III <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما قبل ثقافة E. القولونية سلالة TOP10 / pBAD-α الدكتور / pGOOD-ε243 في 1 مل من المتوسط ​​LB-الأمبيسلين-التتراسيكلين واحتضان 8 ساعة عند 37 درجة مئوية. تمييع 1: 1،000 في متوسطة جديدة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1: 100 إلى 200 مل من المتوسط ​​الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم حمل لمدة 3 ساعة مع أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. حصاد الخلايا، وتخزين بيليه في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. التجانس وتعطيل الخلايا كما هو موضح في 2.4 و 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي فورا الخلايا المحللة في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه. تصفية طاف مع قمع بوشنر مجهزة 3 طبقات من ورق الترشيح. تطبيق فراغ لطيف. لتجنب رغوة المفرطة، والحفاظ على فراغ قارورة مخروطي على الجليد أثناء الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين وفقا لبرادفورد 14. </li></ol> 4. جل الترشيح اللوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن ل16x70-تغلف المياه (200) عمود الترشيح هلام مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8. تحميل على العمود استخراج البروتين القابلة للذوبان. لحل الأمثل، واستخدام 1 مل عينة حلقة. أداء اللوني عند 0.6 مل / دقيقة. الحفاظ على درجة الحرارة عمود في 4 درجات مئوية طوال الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 0.9 مل الكسور وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. نقل 20 ميكرولتر من كل جزء صلة أنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ ( ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد &quot;نوكلياز خارجية 3&#39;-5 والنشاط البلمرة DNA من كل جزء في 96-نحنليرة لبنانية microplates. فحص النشاط نوكلياز خارجية باستخدام ثيميدين 5&#39;-أحادي البارانتروفنيل استر (ص NP-TMP) كما الركيزة 15. تقدير النشاط البلمرة DNA باستخدام PPX (بيروفسفاتاز، البيورين فوسفوريلاز، الزنثين أوكسيديز)، إلى جانب انزيم فحص 16 و 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) كلوريد -5-فينيل-2H-نتروبلو (INT) كما متقبل الإلكترون 16. </li></ol> 5. تحليل الطفرة من السكان المشارك معربا عن البرية من نوع ε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA الثالث والطفري εD12A البديل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مستعمرة واحدة من E. القولونية TOP10 تحتوي على pBAD-ε وpGOOD1-εD12A 11 ناقلات إلى 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع ما قبل الثقافة 1: 250 في 3 قوارير تحتوي على المتوسط ​​الطازجة (10 مل)، إضافة محرضات مناسبة (أرابينوز، IPTG، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما) واحتضان عند 37 ° Cلمدة 8 ساعة. إعداد موازية في الثقافات غير المتعمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع aliquots من 1 مل، ثم تمييع 1: 500 في قوارير جديدة تحتوي متوسطة جديدة (10 مل) تستكمل أم لا مع محرضات مناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.2 و 5.3 وجمع aliquots من 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وقوع عدد من الأجيال في كل ثقافة. نقل على لوحات LB، 100 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل المناسبة من اللقاح والثقافة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات على لوحات LB، وحساب سجل من عدد الخلايا الموجودة في اللقاح (سجل I) وفي الثقافة في نهاية النمو (تسجيل C). لتحديد عدد من الأجيال، استخدم الصيغة: (تسجيل C - تسجيل I) /0.301. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend الخلايا في 1 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 50 مم كلوريد الصوديوم. لpermeabilize الخلايا، إضافة 2-3 قطرات من الكلوروفورم ودوامة لمدة 20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد β-النشاط جلوكوزيد كل قسامة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا، وذلك باستخدام ص -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc)، والركيزة. إضافة إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الخلايا permeabilized و 100 ميكرولتر من الركيزة (16 ملغ / مل حل الأوراق المالية في H 2 O). الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الآبار. قراءة الامتصاصية في 420 نانومتر، وذلك باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية والمرشح المناسب. </li></ol>

<ol>
	<li>Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+protein+expression+with+ligation-free,+traceless+and+tag-switching+plasmids.">Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids.</a> Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).</li><li>Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+landscape+of+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli.">Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).</li><li>Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+systems:+a+comparison.">Eukaryotic expression systems: a comparison.</a> Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+PBAD+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).</li><li>Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+and+homogeneous+regulation+of+the+Escherichia+coliaraBAD+promoter+by+use+of+a+lactose+transporter+of+relaxed+specificity.">Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).</li><li>Tabita, F. R., Small, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+assembly+of+active+cyanobacterial+ribulose-1,5-bisphosphate+carboxylase/oxygenase+in+Escherichia+coli+containing+stoichiometric+amounts+of+large+and+small+subunits.">Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).</li><li>Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cyanobacterial+and+higher+plant+ribulose+bisphosphate+carboxylase+subunits+into+functional+homologous+and+heterologous+enzyme+molecules+in+Escherichia+coli.">Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli.</a> EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).</li><li>Amann, E., Brosius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG+vectors+for+regulated+high-level+expression+of+cloned+genes+in+Escherichia+coli.">ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli.</a> Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).</li><li>Scheich, C., K&#252;mmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., B&#252;ssow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+co-expression+of+an+unrestricted+number+of+proteins.">Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).</li><li>Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGOODs:+new+plasmids+for+the+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).</li><li>Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+PBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li><li>McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replicases+from+a+bacterial+perspective.">DNA replicases from a bacterial perspective.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Hamdan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+the+5&#8217;-p-nitrophenyl+ester+of+TMP+by+the+proofreading+exonuclease+(&#949;)+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III.">Hydrolysis of the 5&#8217;-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (&#949;) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).</li><li>Guill&#233;n Su&#225;rez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+of+phosphate-+or+pyrophosphate-releasing+enzymes.">A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes.</a> BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).</li><li>DeRose, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+the+catalytic+domain+of+the+proofreading+&#949;+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+based+on+NMR+structural+data.">Model for the catalytic domain of the proofreading &#949; subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data.</a> Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).</li><li>Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proofreading+exonuclease+subunit+&#949;+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+is+tethered+to+the+polymerase+subunit+&#945;+via+a+flexible+linker.">The proofreading exonuclease subunit &#949; of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit &#945; via a flexible linker.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).</li><li>Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+of+the+proofreading+subunit+controls+the+assembly+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+catalytic+core.">Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).</li><li>Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+selection,+proofreading,+and+mismatch+repair+during+DNA+replication+in+Escherichia+coli.">Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).</li><li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms.">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li><li>Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+activates+the+cryptic+bgl+operon+in+E.+coli+K12.">Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12.</a> Nature. 293, 625-629 (1981).</li><li>Schaeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+system+for+the+utilization+of+&#946;-glucosides+in+Escherichia+coli.+I.+Active+transport+and+utilization+of+&#946;-glucosides.">Inducible system for the utilization of &#946;-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of &#946;-glucosides.</a> J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).</li><li>Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+mutators+in+Escherichia+coli.">Direct selection for mutators in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).</li><li>Dunker, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unfoldomics+decade:+an+update+of+intrinsically+disordered+proteins.">The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins.</a> BMC Genomics. 9, (2008).</li><li>Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminal+domain+of+DnaQ+contains+the+polymerase+binding+site.">The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site.</a> J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).</li><li>Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+functional+domains+of+the+&#949;+subunit+of+DNA+polymerase+III.">Two functional domains of the &#949; subunit of DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).</li><li>Kim, D. R., McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assembly+of+overproduced+DNA+polymerase+III.+Overproduction,+purification,+and+characterization+of+the+&#945;,+&#945;-&#949;,+and+&#945;-&#949;-&#952;+subunits.">In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the &#945;, &#945;-&#949;, and &#945;-&#949;-&#952; subunits.</a> J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).</li><li>Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+to+the+&#946;-sliding+clamp.">Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the &#946;-sliding clamp.</a> Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).</li><li>Greener, A., Callahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XL1-red:+highly+efficient+random+mutagenesis+strain.">XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain.</a> Strategies. 7, 32-34 (1994).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+and+maturation+of+an+NADP-dependent+[NiFe]-hydrogenase:+a+key+enzyme+in+biofuel+production.">Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production.</a> PloS One. 5 (5), (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يمكن أن تكون البروتينات المختلين جوهريا، ويضم المناطق التي لا تقتصر على عدد محدود من التشكل 25 الهيكل العالي. هذه البروتينات المختلين وعادة ما تكون عرضة لتجميع 25، وعزلتهم وتوصيف قد تمثل مهمة صعبة. الوحيدات ε من E. القولونية DNA بوليميريز III ملامح اثنين م...

إدخال تكنولوجيات overexpression عزز إما الدراسات البيوكيميائية لل-نسخة منخفضة الانزيمات عدد والإنتاج الصناعي من البروتينات الصيدلانية الفعالة (مثل الأنسولين). منذ ظهور هذه التقنيات، وقد تم تحقيق تقدم كبير لزيادة الغلة ونوعية البروتينات المؤتلف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير بدائية النواة 1،2 و حقيقية النواة 3 أنظمة overexpression على مر السنين، وتقديم بدائل مفيدة ل&quot;حصان العمل&quot; للتكنولوجيا الحيوية من البروتين، أي كولاي. على وجه الخصوص، وتوافر منصات بديلة لE. أدى القولونية إلى إنتاج الببتيدات المؤتلف أو البروتينات التي تحمل التعديلات بعد متعدية. ومع ذلك، فإنه يجب ذكره أن E. القولونية لا يزال يمثل كائن الاختيار لإنتاج البروتين المؤتلف. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، من بينها الأكثر صلة يمكن أن تكونتعتبر: أ) توافر عدد كبير من أنظمة overexpression (ناقلات التعبير وسلالات) لE. القولونية 1،2. ب) مرات الجيل القصير، وغلة الكتلة الحيوية العالية، من E. القولونية في مجموعة متنوعة من الوسائط الغنية والاصطناعية. ج) للتلاعب سطحي إما في الكيمياء الحيوية وعلى المستوى الجيني لهذه الكائنات الحية الدقيقة. د) عزل سلالات قادرة على إنتاج البروتينات السامة 4؛ ت) بناء سلالات تتميز تحريض متجانسة على مستوى السكان 5،6. وبالإضافة إلى ذلك، تبين في الآونة الأخيرة أن الأنظمة التعبير مناسبة للإنتاج في E. القولونية من البروتينات بعد translationally تعديل يمكن وضعها والتي شيدت 2. في الوقت الحاضر، ويستخدم البروتين overexpression أساسا للحصول على البروتينات أحادى أو وطي بلازميدة قليلة القسيمات، الذي لا يمكن أن يؤديها مع جين واحد مستنسخ إلى البلازميد المناسب hypersynthesis. ومع ذلك، كان الاهتمام في الآونة الأخيرةالمدفوعة لبناء E. أنظمة البروتين شاركت في التعبير القولونية، مما يشكل تحديا للإنتاج، في الجسم الحي، من مجمعات للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات 2. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في وقت مبكر من البروتين شاركت في التعبير كلمة أمام الجمعية بين الأنواع من مفارز كبيرة وصغيرة من كربوكسيلاز السيانوبكتيريا ريبولوز-1،5-bisphosphate / أوكسيجيناز 7،8، ورابطة أشكال اقتطاع وطول كامل من HIV-1 الناسخ 9 عكس. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي البروتين شاركت في التعبير يمثل بديلا قويا لالتقليدية في إعادة المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، والبروتين شارك في التعبير في E. وقد استخدم القولونية لإنتاج البروتينات المختلفة التي تحمل التعديلات بعد متعدية 2، للحصول على البروتينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير طبيعية 2، وزيادة العائد من بروتينات الغشاء overexpressed 2. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال من البروتين شاركت في التعبير كأداة لتمنح لE. القولونية المنافسةالامتحانات التنافسية الوطنية في إفراز البروتين هو قيد التحقيق النشط 2. اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية للبروتين شارك في التعبير في E. القولونية يمكن اتباعها: ط) استخدام البلازميد واحد لاستضافة جينات مختلفة إلى أن overexpressed. ب) استخدام البلازميدات متعددة في الخلايا واحد للمشاركة في التعبير عن البروتينات المستهدفة. في الحالة الأولى، ومعايير لاختيار البلازميد لا تختلف عن تلك التي واحدة من التجارب البروتين overexpression التقليدية، على الرغم من البلازميدات معينة تحتوي على العناصر جنبا إلى جنب المروج / المشغل شيدت للمشاركة في التعبير 10. ولذا فإن هذا النهج الأول هو بسيط جدا. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أن استخدام البلازميد واحد للمشاركة في التعبير عن مختلف البروتينات يواجه صعوبات كبيرة اثنين: أ) الكتلة الجزيئية للزيادات ناقلات مع عدد من الجينات استضافت، مما يحد من عدد من البروتينات وأعرب المشترك؛ ب) عندما يتم استنساخ جينات متعددة تحت سيطرة أحد المروجين واحد، يمكن قطبية decreasالبريد التعبير عن الجينات البعيدة من المروج. استخدام البلازميدات مزدوجة أو متعددة في واحد E. خلايا القولونية ديها لتحقيق التوافق بين ناقلات الاختيار، وبالتالي فرض القيود على تركيبات المؤهلة من البلازميدات. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية شاركت في التعبير الثانية يتميز بميزة التي تحتوي على الكتلة الجزيئية للناقلات، ويحد قطبية. نحن شيدت مؤخرا نظام المشاركة في التعبير البروتين مصممة لتسهيل مكوكية من الجينات بين البلازميدات شاركت في التعبير 11. على وجه الخصوص، ونحن شيدت سلسلة نواقل pGOOD، الميزات ذات الصلة والتي هي: أ) أصل p15A النسخ المتماثل، لتوفير التوافق من البلازميدات pGOOD مع ناقلات التجارية التي تحتوي على أصل ColE1 (على سبيل المثال، سلسلة pBAD 12)؛ ب) الكاسيت التتراسيكلين المقاومة. ج) وجود لاك -derived العناصر التنظيمية، أي المروج-المشغل (O 1) الزوجين واسي </eم&gt; س الجين. باستخدام زوجين pBAD-pGOOD المناسب، كنا قادرين على بإفراط عن جوهر الحفاز E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، تتكون من ثلاثة مفارز مختلفة، أي α (في &#39;البلمرة، ε (و3&#39;-5 5&#39;-3) &quot;نوكلياز خارجية) وθ (استقرار ε) 13. على وجه الخصوص، أثبتنا أن شارك في التعبير عن مجمع αεθ كان يعتمد بشكل صارم على بالإضافة إلى E. القولونية مستنبت كل من IPTG وأرابينوز، مما اثار overexpression من pGOOD وpBAD، على التوالي (الشكل 1A). في هذا التقرير، فإننا توضيح كيفية البروتين شاركت في التعبير يمكن أن تحل بكفاءة صعوبات مرتبطة الذوبان الفقراء من حدة فرعية البروتين المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف في بروتين الجسم الحي الاختبارات تكامل لا يمكن أن يؤديها، ونحن تقريرا أخيرا على استخدام البروتين شاركت في التعبير للتردد طفرة في تناغم E. مضيق بين قمتينأنا. لتحقيق هذا الهدف، وكنا الأزواج pGOOD-pBAD مناسبة لتوضيح الأمثلة ذات الصلة في كل دراسة حالة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INT</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PMSF</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNP-gluc</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pNP-TMP</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracyclin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">95039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:125px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acrylamide solution 30%</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0158</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persolphate</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0700</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0718</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0302</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TEMED</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0800</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0719</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cuvettes 0.1 cm</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652089</td>
			<td>For electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:125px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge Allegra 21R</td>
			<td style="width:125px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chromatography apparatus GradiFrac</td>
			<td style="width:125px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II electroporation</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microplate Reader 550</td>
			<td style="width:125px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MiniProtean 3 cell</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power Supply</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator 3000</td>
			<td style="width:125px;">Misonix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the multifaceted benefits of protein co-expression in escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

الوحيدات ε من E. يتكون القولونية DNA بوليميريز الثالث من 243 الأحماض الأمينية ويحتوي الفقراء الذوبان 17،18، ما لم يتم حذف مخلفات 187-243 17. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا 11 أن شارك في التعبير عن α كامل طول، ε، ومفارز θ غلة البلمرة DNA للذوبان III الأساسية ال?...

Watch this Scientific Journal Video about The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli at JoVE.com

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

the-multifaceted-benefits-of-protein-co-expression-in-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

11.8K Views.  University of Bologna. Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells. 

Video: The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.