Name: the multifaceted benefits of protein co-expression in escherichia coli
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
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E. 1. 분리 대장균 공동 형질 전환 <ol><li> 해당 E.의 전기 유능한 세포를 준비 대장균 균주를 변환 할 수 있습니다. LB 배지 1 ㎖ (트립 톤, 효모 추출물, (10)에서의 NaCl, 5, 10g / 각각 L,) 선택의 변형의 단일 식민지, 그리고로 전송 180 rpm으로 진탕 조건에서 37 ° C에서 배양한다. 사전 문화 (1) 희석 : 500 신선한 LB 배지 m​​l의 25에서 37 ° C에서 문화를 품다. </li><li> 로그 상 (0.6 OD)에서 20 분 동안 5,000 XG)에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 원래 문화 볼륨의 절반에 10 %, v / V를 얼음처럼 차가운 멸균 글리세롤 물에 펠렛을 재현 탁. 마다 부유 양을 절반으로,이 단계를 4 회 반복한다. 마지막으로, 글리세롤 / 물에 펠렛을 재현 탁하고 50 ㎕의 분취 액에 세포 현탁액을 나눈다. 6개월에 -80 ° C 최대의 분량을 저장합니다. </li><li> 0.5 mM의 EDTA 보충 멸균에서 원하는 플라스미드를 녹여. IC에 해동전자 전기 - 반응성 세포의 분취 량과 벡터의 적절한 양 (2.5-5 NG)와 혼합한다. 전기에 적합한 0.1 cm 큐벳에 혼합물을 분배하고, 1.8 kV의 적용. </li><li> 즉시 SOC 배지 1 ㎖로 일렉트로 세포를 트랜스퍼 (LB 배지 w 0.2 % / V 포도당 된 10 mM의 MgCl 2, 2.5 mM의 KCl을 보충), 진탕하에 1 시간 동안 배양하고, 마지막으로 함유하는 페트리 접시에 100 μL 씩 전송 적절한 항생제 LB 한천. 37 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 페트리 접시에 하나의 식민지를 질주하여 형질 전환 체를 정화. </li><li> 기본 형질 전환 체의 전기 유능한 세포를 준비하고 반복 더 플라스미드로 변환하는 1.1-1.5 단계를 반복합니다. </li><li> 공동 형질 전환 체의 글리세롤 주식을 준비합니다. 적절한 항생제로 보충 LB에서 하나의 식민지로 이동 진탕 37 ° C에서 배양하고, 로그 상 (0.6 OD) 원심 분리기 20 분 5,000 XG에 세포 현탁액에서. R중간 15 % v / V를 글리세롤을 포함하는 LB-항생제의 펠렛을 esuspend. 분량 씩 분배와에 저장 - 80 ° C. </li></ol> E.의 α와 ε 소단위 2. 공동 식 대장균 DNA 중합 효소 III <ol><li> 멸균 된 루프 적절한 변형 글리세롤 스톡 소량 전송 LB 배지 및 항생제를 함유하는 페트리 접시에 (예 TOP10 / PGOOD-ε243 및 TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160를,도 1 참조). 세포가 방울 세포 현탁액 페트리 접시 위에 건조하고, 행진하자. 37 ° CO / N에 품어. </li><li> 멸균 된 이쑤시개, LB-항생제 매체의 1 ml의 단일 콜로니를 사용하여 전송. 37 ° C에서 8 시간을 품어. 신선한 매체 (500)를 15 시간 동안 30 ° C에서 부화 : 사전 문화 (1) 희석. </li><li> IPTG, 아라비 노스, 또는 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각을 추가합니다. 2.5 시간 동안 30 ° C에서 품어. 세포를 수집하고, -20 ° C에서 알약을 저장합니다. </li><li> 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, 50 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 디티 오 트레이 톨, 1​​mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), pH가 8)에 재현 탁하고 얼음에 녹여 펠릿. 조심스럽게 차가운 유리 포터와 세포 현탁액을 균질화. </li><li> 15 초 냉각 간격 (4 사이클) 다음 15 초 15 W,에서 초음파 처리. </li><li> 가용성 획분을 회수하는 4 ° C에서 20 분 동안 10,000 XG에서 전체 단백질 추출물을 원심 분리기. </li><li> SDS-PAGE (아크릴 아미드 12.5 %) 각각의 가용성 단백질 추출물의 분액에 의해 분석한다. 이를 위해, H 2 O 60 ㎕의 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 각각 가용성 단백질 추출물 20 μL를 전송 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (w / v)의 SDS, 50 % (v / v) 글리세롤, 0.25 % 청색 (w / v)의 브로 모 페놀)과 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다. </li></ol> Deinococ의 α 서브 유닛 3. 공동 식기분이야 radiodurans DNA 중합 효소 III와 ε E. 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III <ol><li> E.의 사전 문화를 준비 대장균의 TOP10 / 박사를 pBAD-α / LB-암피실린 - 테트라 사이클린 배지 1 ㎖에 PGOOD-ε243 37 ° C에서 8 시간을 품어. 새로운 배지에서 1,000 37 ° C에서 O / N을 품어 : 1 희석. </li><li> 1 희석 : 신선한 매체의 100 (200)에 ㎖를, 다음 아라비 노스와 IPTG, 1 mM의 각각 3 시간 동안 유도, 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 세포를 수확하고, -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다. </li><li> 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 1mM의 PMSF에 펠렛을 재현 탁. 균질화 2.4 및 2.5에 기술 된 바와 같이 세포를 방해. </li><li> 즉시 세포를 20 분 동안 10,000 XG에 원심 해물. 펠렛을 폐기하십시오. 종이 필터의 3 층을 구비 한 흡인 여과기와 상청액을 필터. 부드러운 진공을 적용합니다. 과도한 거품을 방지하기 위해 여과 동안 얼음에 진공 삼각 플라스크를 유지합니다. </li><li> 브래드 포드 (14)에 따라 단백질 농도를 결정합니다. </li></ol> 4. 젤 여과 크로마토 그래피 <ol><li> 50 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, pH를 컬럼으로 8로드 가용성 단백질 추출물과 물 재킷 16x70 (200) 겔 여과 열 평형. 최적 해상도를 들어, 1 ml의 시료 루프를 사용합니다. / 분 0.6 ml의에서 크로마토 그래피를 수행합니다. 에 걸쳐 4 ° C에서 열 온도를 유지합니다. </li><li> 0.9 ml의 분수를 수집하고 SDS-PAGE에 의해을 분석 할 수 있습니다. 전송 H 2 O 60 μL 및 로딩 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % (/ V) SDS w, 50 %의 20 μl를 함유하는 에펜 도르프 튜브에 관련된 각 분획의 20 μL ( v / v)의 글리세롤, 0.25 % (파란색 w / v)의 브로 모 페놀) 및 5 분 동안 끓인다. 로드 각 샘플의 18 μl의 약 1.5 시간 동안 140 V의 전기를 수행합니다. </li><li> 3&#39;-5 &#39;엑소 뉴 클레아 제 및 각 분획의 DNA 중합 효소의 활성을 96 우리하여 결정LL 마이크로. 기판 (15)로 티미 딘 5&#39;- 모노 인산 (P) 니트로 에스테르 (p-TMP의 NP)을 이용하여 엑소 뉴 클레아 제 활성을 분석. PPX (Pyrophosphatase, 퓨린 뉴 클레오 사이드 포스 포 릴라 제, 크 산틴 옥시 다제), 효소 결합 분석 16을 사용하여 DNA 폴리머 라 아제 활성을 예측 2- (4- 요오도 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- 페닐 -2H-테트라 졸륨 클로라이드 (INT) 전자 수용체 16. </li></ol> 인구 E.의 야생 형 ε 서브 유닛을 공동 발현 5. 돌연변이 분석 대장균 DNA 중합 효소 III 및 변이원성 εD12A 변형 <ol><li> E.의 단일 식민지로 이동 pBAD-ε과 LB-항생제 배지 1 ㎖에 pGOOD1-εD12A 11 벡터를 포함하는 대장균 TOP10. 37 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> (아라비 노스, IPTG, 또는 아라비 노스 및 IPTG, 1 mM의 각각)을 적당한 유도제를 추가 한 새로운 배지 (10 ㎖)을 함유하는 플라스크에 250 3 37 ° C에서 배양한다 : 예비 배양 한 희석8 시간 동안. 병렬이 아닌 유도 문화에서 준비합니다. </li><li> 1 ml의 일정량을 수집 한 후 1 희석 : 신선한 매체 (10 ㎖)를 포함하는 새로운 플라스크에 500을 적절한 유도 보충 여부. 37 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 반복은 1 ml의 5.2 및 5.3 및 수집 분량 씩 단계를 반복합니다. </li><li> 세대의 수는 각 문화에서 발생 확인합니다. LB 플레이트, 접종 및 문화의 적절한 희석액 100 ㎕에 전송합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어. LB 플레이트상에서 콜로니를 카운트하고, 성장 (C 로그)의 단부에 존재 균액 (I 로그)와 배양 세포 수의 로그를 계산한다. 세대의 수를 확인하려면 수식을 사용하십시오 (C 로그 - I 로그인) /0.301을. </li><li> 20 분 동안 5,000 XG 원심 분리기 및 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 50 mM의 NaCl을 1 ml의 세포를 재현 탁. 세포를 Permeabilize 하시려면하려면 20 초 동안 클로로포름과 소용돌이 ~ 3 방울을 추가합니다. </li><li> β- 결정기판으로서 P 개의 -nitrophenyl-β-D 글루 코피 라노 사이드 (PNPGluc)를 사용하여 96- 웰 마이크로 플레이트의 각 분취 량 글루코시다 제 활성. 각 웰에 투과 가능 세포를 100 ㎕)과 기판 (100 ㎕ (16 ㎎ / H 2 O ㎖의 원액)를 추가합니다. 우물에 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 마이크로 플레이트 리더 및 적절한 필터를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 읽는다. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., Adams, M. W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+and+maturation+of+an+NADP-dependent+[NiFe]-hydrogenase:+a+key+enzyme+in+biofuel+production.">Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production.</a> PloS One. 5 (5), (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

단백질은 그 차 구조 배좌 (25)의 제한된 수의 제한되지 않은 영역을 갖춘, 무질서 본질적 일 수있다. 이들 무질서 화 된 단백질은 통상 25 응집 경향이며, 그들의 분리 및 특성 규명은 어려운 작업을 나타낼 수도있다. E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 두 가지 영역, 즉 (26, 27)를 특징 : I) N-터 도메인, θ 서브 유닛을 바인딩에 3&#39;-5 &#39;엑소 뉴 클레아 제 ...

과발현 기술의 도입은 낮은 카피 수 효소의 생화학 적 연구와 약리학 적 활성 단백질 (예를 들면, 인슐린)의 산업 생산를 부스팅. 이러한 기술의 출현 때문에 상당한 진보는 재조합 단백질의 수율 및 품질을 증가시키기 위해 달성되어왔다. 또한, 원핵 및 진핵 3 1,2- 과발현 시스템은 단백질 공학, 즉, 대장균 &quot;일꾼&quot;유용한 대안을 제공 년에 걸쳐 개발되었다. E. 대안 플랫폼 특히, 가용성 대장균 재조합 펩타이드 또는 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 제조되었다. 그러나, 언급되어야 E. 대장균은 여전히 재조합 단백질 생산을위한 선택의 유기체를 나타냅니다. 이 가장 관련성이있을 수있는 여러 요소 중에서,에 기인고려 : ⅰ) 과발현 시스템 (발현 벡터 및 균주 확실히 다수의 가능 여부)을위한 E. 대장균 1,2; E. II의) 짧은 생성 시간 및 높은 수율의 바이오 매스, 풍부하고 합성 다양한 미디어에서 대장균; ⅲ) 생화학에서이 미생물의 유전자 수준에서 어느 손쉬운 조작; ⅳ) 4 독성 단백질의 생산이 가능한 균주의 분리; V) 인구 레벨 5,6에 균일 유도를 갖춘 균주의 건설. 또한, 최근에 E. 그 생산에 적합한 발현 시스템을 도시 한 번역 후 변형은 단백질의 대장균이 고안을 구성 할 수있다. 현재, 단백질의 과발현은 주로 그의 hypersynthesis 적절한 플라스미드에 클로닝 한 유전자와 함께 수행 될 수 단량체 또는 호모 올리고머 단백질을 얻기 위해 사용된다. 그러나 관심은 최근에 있었다E. 건설에게 지급 콜라이 단백질의 공동 발현 시스템, 헤테로 올리고머 성 복합체 (2)의 생체 내, 생산 도전. 흥미롭게도, 단백질의 공동 표현의 초기 실험은 시아 노 박테리아 리불 로스 -1,5- 비스 포스페이트 카르 복실 / 시게나 제 7,8의 크고 작은 소단위의 간 종 조립 및 HIV-1의 절단 및 전체 길이 형태의 관계를 해결 효소 구 역. 이러한 선구적인 연구는 단백질의 공동 발현이 체외 재구성 전통에 대한 강력한 대안을 나타낸다는 것을 보여 주었다. E.에서 또한, 단백질의 공동 발현 대장균은 천연 아미노산이 함유 단백질을 얻기 위해, 번역 후 변형이 담지 다른 단백질을 생산하고, 과발현 된 막 단백질 (2)의 수율을 증가시키기 위해 사용되었다. 또한, 단백질과 같은 공구의 공동 발현의 전위를 부여하는 E. 대장균 경쟁단백질 분비 후부 활성 조사 2 중입니다. E. 단백질의 공동 표현의 두 가지 주요 전략 대장균 추구 할 수 있습니다 다른 유전자를 호스팅 할 하나의 플라스미드의 사용이 과발현되는 I); ⅱ) 단일 셀에서 여러 플라스미드를 사용하는 목적 단백질의 공동 발현한다. 탠덤 프로모터 / 운영자 특정 원소를 함유하는 플라스미드가 공동 - 식 (10)에 대해 구축되었다하더라도 첫 번째 경우, 플라스미드의 선택을위한 기준은, 전통적인 단일 단백질 과발현 실험의 것과 다르지 않다. 첫 번째 방법은 따라서 매우 간단합니다. 그러나, 다른 단백질을 공동 발현하는 하나의 플라스미드를 사용하는이 두 가지 문제에 직면 언급한다 : ⅰ) 공동 발현 된 단백질의 수를 제한 호스팅 유전자 수가 벡터 증가의 분자량; ⅱ) 다수의 단일 유전자 프로모터의 제어하에 복제 될 때, 극성을 수 decreas원위 프로모터 유전자 발현 전자. E. 이중에서 단일 또는 다수의 플라스미드를 사용 대장균 세포 따라서 플라스미드의 자격이 조합에 제약을 부과, 선택의 벡터의 호환성을 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 두 번째 공동 발현 전략은 벡터의 분자량을 포함하는 장점을 특징으로하고, 극성을 제한한다. 우리는 최근 공동 발현 플라스미드 (11) 유전자의 셔틀 링을 용이하게하기위한 단백질의 공동 발현 시스템을 구축 하였다. 특히, 우리 PGOOD 벡터 시리즈 지어진 중요한 특징은 어느이다 : ⅰ) 복제 p15A 오리진, 상업적 벡터 (예, pBAD 시리즈 12) ColE1 기원을 함유 함께 PGOOD 플라스미드의 호환성을 제공하는 단계; ⅱ) 테트라 사이클린 내성 카세트; ⅲ) 락의 존재는 규제 요소, 즉, 프로모터 연산자 (O 1) 부부와의 lacI을 - 유래 </em&gt; Q 유전자. 적절한 pBAD-PGOOD 커플을 사용하여, 우리는 E.의 촉매 코어를 과발현 할 수 있었다 세 개의 다른 소단위으로 구성 대장균 DNA 폴리머 라제 III, 즉, α (5&#39;-3 &#39;중합 효소), ε (3&#39;-5&#39;엑소 뉴 클레아 제) 및 (안정화 ε) 13 θ. 특히, αεθ 복합체의 공동 발현 E.에 더하여에 엄격히 의존 시연 IPTG와 아라비 모두 대장균 배양액 PGOOD 및 pBAD 각각 (도 1a)에서 트리거링 과발현. 본 보고서에서, 우리는 단백질의 공동 발현이 효율적으로 단백질 복잡한 서브 유닛의 가난한 용해도에 연결된 어려움을 해결할 수있는 방법을 보여줍니다. 또한, 어떻게 생체 단백질 보완 테스트에서 행할 수 보여, 우리는 마침내 E. 튜닝 주파수 변이 단백질로 공동 발현의 사용에 대한 보고서 안부내가. 이를 위해, 우리는 각각의 사례 연구의 관련 사례를 설명하기에 적합 PGOOD-pBAD 커플을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-gluc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide solution 30%</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Ammonium persolphate</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Cuvettes 0.1 cm</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>For electroporation</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Allegra 21R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromatography apparatus GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporation</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 cell</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the multifaceted benefits of protein co-expression in escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

E.의 ε 소단위 대장균 DNA 중합 효소 III는 243 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 잔류 187-243 (17)을 삭제하지 않는 한, 용성 (17, 18)을 갖추고 있습니다. 그러나, 우리는 이전에 전체 길이 α, ε, 및 θ 서브 유니트의 공동 발현이 수용성 DNA 폴리머 라제를 촉매 III 코어 (도 1)을 수득 11 것을 보여 주었다. ⅰ) α와 ε 소단위의 과발현은 독립적 아라비 노...

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The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

11.9K 조회수.  University of Bologna. Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells. 

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

연구

유전학

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

생체공학

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

화학

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

생화학

Escherichia coli dnaK756 세포를 사용한 Hsp70 Chaperone 활성 평가

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

저자 스포트라이트: 말라리아 및 결핵 감염에서 열 충격 단백질 탐구

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

면역학 및 감염병학

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

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