The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

<ol>
	<li>Walther, T. C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+in+cell+biology.">Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.</a> J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).</li><li>Lenz, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+methodology+to+improve+proteome+coverage+depth.">Separation methodology to improve proteome coverage depth.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).</li><li>Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+large-scale+analysis+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Jimenez, C. R., Verheul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics:+from+cancer+biology+to+protein+biomarkers,+drug+targets,+and+clinical+applications.">Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications.</a> Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).</li><li>Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+stem+cell+heterogeneity+and+plasticity.">Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity.</a> Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).</li><li>Evans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+iTRAQ:+where+do+we+stand+now.">An insight into iTRAQ: where do we stand now.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).</li><li>Malmstr&#246;m, J., Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+targeted+mass+spectrometry+for+protein+biomarker+verification.">Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification.</a> Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 41, (2010).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. 8, 309 (2007).</li><li>Liu, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+pipeline+for+biomarker+discovery+of+laser+capture+microdissected+breast+cancer+tissue.">Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).</li><li>Geiger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+as+a+spike-in+standard+in+quantitative+proteomics.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+sample+preparation+from+formalin+fixed+and+paraffin+embedded+tissue.">Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Sarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cancer+stem-like+cells+in+small+cell+lung+cancer+are+highly+tumorigenic+and+chemoresistant+but+sensitive+to+a+novel+neuropeptide+antagonist.">CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist.</a> Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).</li><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pre-leukaemic+haematopoietic+stem+cells+in+acute+leukaemia.">Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.</a> Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).</li><li>Schaab, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phosphoproteome+analysis+of+human+bone+marrow+reveals+predictive+phosphorylation+markers+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia+with+quizartinib.">Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib.</a> Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).</li><li>Burgess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers.">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح أو غيرها من القضايا في الكشف عنها.

وهناك حاجة التنميط الطيفي الشامل من proteomes سرطان الخلايا المشتقة من المريض لاكتشاف المؤشرات الحيوية التنبؤية / التشخيص الجديدة، وكذلك لإعطاء فهم أفضل للبيولوجيا الخلايا السرطانية، والتي قد تؤدي بدورها إلى تحديد أهداف أدوية جديدة محتملة. ومع ذلك، فإن مثل هذه التحليلات الطيفي الشامل تشكل تحديا للغاية، ولا سيما بسبب مختلف القضايا قبل التحليلية يجب أن تحل، إذا واحد هو الحصول على نتائج قوية وذات الصلة من الناحية البيولوجية. سير العمل التجريبي وصفها هنا يسمح لتوصيف بروتيوميك الكمي للproteomes المستمدة من القطعان الخلوية على حد سواء الأورام السائلة والصلبة. هناك حاجة لتخصيب الأولي من الخلايا السرطانية من قبل أي أساس FACS خلايا-sortingor تسليخ مجهري لتجنب التلوث بواسطة خلايا الورم المكروية. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه التقنيات واحدة لعزل مجموعات سكانية فرعية الخلوية في المصالح. دراسات الخلايا البيولوجية الأخيرة لها شيطانstrated أن بعض المجموعات السكانية الفرعية الخلوية لها خصائص بدء الورم وبالتالي فهي ذات أهمية كبيرة لسرطان المرضية 19،20. كما أصبح قياس الطيف الكتلي أكثر حساسية في السنوات الأخيرة، والتحليلات البروتين الكمية مجدية لكميات صغيرة من البروتين التي يمكن استخلاصها من بضعة آلاف من الخلايا، مما يجعل من الممكن للتركيز على السكان الخلية ذات الصلة وظيفيا. مجموعة المتابعة المقدمة هنا يمكن استخدامها لتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية التشخيصية الجديدة في عينات FFPE. وبالتالي، فمن عود لBEA أداة مفيدة لتحسين التشخيص السريري، وحتى الآن لا يزال هناك نقص في المؤشرات الحيوية الجزيئية في عدد كاف والجودة لكثير من أنواع السرطان. أمثلة هامة من تشخيصات تفريقية الصعبة، التي المؤشرات الحيوية غير موجودة، هي التمييز بين سرطان الرئة الأولية من الانبثاث في الرئة، وسرطان خلايا الأقنية الصفراوية داخل البنكرياس وغدية البنكرياس، وكذلك تختلفentiation من ورم ليفي عصبي حميدة من الأورام العصبية الطرفية غمد الخبيثة للغاية. وعلاوة على ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أن توضيح كمية من التوقيعات البروتين يمكن أن تكون مفيدة في دراسة بيولوجيا الخلايا السرطانية بشكل عام، وللكشف عن المؤشرات الحيوية التنبؤية للاستجابة العلاجية في علاج مرضى السرطان 21. اثنين من السلبيات الحالية للالطريقة المعروضة هنا هي شرط اليدوي للواسعة تجهيز العينات والطلب على nanoLC-MS / MS اكتساب الوقت. في حين أن الأول يمكن معالجتها عن طريق تحريك إعداد نموذج لمثل تنسيقات 96-جيدا واستخدام المعالجة الروبوتية، وهذا الأخير سوف يتطلب تغييرا في استراتيجية الاستحواذ الجماعية الطيفي. مرة واحدة وقد تم تحديد مجموعات فرعية من البروتينات المستهدفة التي يمكن أن تترافق مع مثل تصنيف الورم، ونحن نتصور تصميم أساليب مطياف الكتلة الهادفة والتي تقدم قراءات الكمية لهذه المجموعات الفرعية مع جهد فصل تقلص إلى حد كبير، ووبالتالي مع انخفاض في المقابل اكتساب الوقت. إذا كان اكتساب الوقت المطلوب ويمكن خفض من 24 المطلوبة - 36 ساعة (أورام السائلة) أو 3 ساعة (الأورام الصلبة) لسبيل المثال، 1 ساعة باستخدام استهدفت قياس الطيف الكتلي والفصل بسيط أحادي البعد من الببتيدات، ثم ينتج عنها من مكاسب في الإنتاجية يمكن استخدامها لزيادة كبيرة في أعداد مكررات البيولوجية والتقنية فحصها، مع تحسينات في المقابلة على أهمية النتائج الكمي. وقد تم بالفعل أثبت النهج الطيفي الجماعية المستهدفة ليكون أداة مناسبة للتحقق من السرطان المرتبط بالبروتين العلامات البيولوجية-22 مرشحا، وتم تطويرها لنقطة حيث أنها تظهر الوعد للمصادقة أو حتى كأداة محتملة للاستخدام السريري الروتيني 23 ، 24.

وقد برزت البروتيوميات القائم على مطياف الكتلة والآن الانضباط تستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية والبحوث الطبية الحيوية متعدية. جعلت التطورات التقنية في مجال من الممكن لدراسة العمليات الخلوية المعقدة في خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية، كما يمكن التعرف على آلاف البروتينات في واحدة جماعية التجربة الطيفي 1،2. وقد تم إحراز تقدم مماثل لتحليل العديد من التعديلات ما بعد النقل مثل الفسفرة أو ubiquitination، على الرغم من أن هذا يتطلب عادة سير العمل مفصل لتخصيب اليورانيوم وتحليل البيانات لكل نوع من التعديل 2،3. وعلاوة على ذلك، وإشراك استراتيجيات وضع العلامات الكيميائية والتمثيل الغذائي، بما في ذلك SILAC، تمكن الكمي النسبي دقيق من البروتينات وPTMs، مما يجعل هذه الطريقة جاذبية خاصة لاكتشاف العمليات الخلوية الأساسية، والمؤشرات الحيوية التشخيصية والأهداف المحتملة المخدرات في سرطان البشري 4. ومع ذلك،العديد من التحديات لا بد من التغلب عليها فيما يتعلق تحليل البروتين من السرطانات البشرية الابتدائية 5. أولا وقبل كل شيء، عينات سرطانية بشرية غالبا ما تظهر درجة عالية من التجانس الخلوية التي ويرجع ذلك إلى وجود مختلف أنواع الخلايا التي تنتمي إلى المكروية الورم، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا الليفية. ثانيا، تطور نسيلي يؤدي إلى التنوع الجيني داخل الأورام نفسها، مما أدى إلى وجود عدة مجموعات سكانية فرعية الخلوية مع خصائص وظيفية متميزة. وفقا لمفهوم الحالي لعدد قليل من الخلايا الجذعية السرطانية كونها القوى الدافعة وراء تطور مرض السرطان والتقدم، تحليل البروتين من هذه القطعان الخلوية (وظيفيا ذات الصلة للغاية) ومن المتوقع أن تكون ذات أهمية كبيرة لفهم أفضل لآليات أنكجنيك ذات الصلة لتطبيق السريرية 6. ثالثا، غالبا ما يتطلب كمية البروتين ملامح التعبير عن مجموعات كبيرة من العينات لتحديد BIOMAR السريرية قويةاستعادة الطاقة الحركية. هذا لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع العلامات الكيميائية مثل iTRAQ 7، في حين استراتيجيات وضع العلامات الأيضية - التي تعتمد، كما يفعلون، على انتشار الخلوي 4 - غير قابلة للتطبيق بالمثل. رابعا، معظم عينات الورم الصلبة المتوفرة هي الثابتة الفورمالين، مما يعقد الشامل التحليل الطيفي بروتيوم بسبب تشكيل crosslinks البروتين 8. وأخيرا، فإن معظم سير العمل البروتينات الموجودة تتطلب كميات كبيرة من تجهيز العينات والحصول على البيانات، مما يجعل تحليل أرقام عينة ذات الصلة للبحوث السريرية الصعب، والدعوة لسير العمل الجديد نماذج 9،10. لمعالجة هذه العقبات التي وضعت الإعداد التجريبية التي تجمع بين إما خلية تدفق cytometric فرز 11 أو الليزر التقاط تسليخ مجهري 12،13 لتخصيب الخليوي مع استراتيجية سوبر SILAC 14 إلى إدخال المعيار الداخلي العالمي للتحليل الطيفي الشامل الشامل. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، فمن الممكن لتحديد ما يصل إلى 8،000 البروتينات في واحدة عينات الورم الإنسان المستمدة من السرطانات إما سائلة أو صلبة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

في عمق تحليل proteomes الخلايا السرطانية وهناك حاجة لتوضيح pathomechanisms أنكجنيك، وكذلك لتحديد أهداف المخدرات المحتملة والمؤشرات الحيوية التشخيصية. ومع ذلك، أساليب لتوصيف بروتيوميك الكمي للأورام المستمدة من المريض وخاصة في القطعان الخلوية تفتقر إلى حد كبير. نحن هنا وصف تجريبي مجموعة المتابعة الذي يسمح التحليل الكمي للproteomes المجموعات السكانية الفرعية الخلايا السرطانية المشتقة من الأورام إما سائلة أو صلبة. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين استراتيجيات تخصيب الخلوية مع الكمي قياس الطيف الكتلي مقرها سوبر SILAC يليه تحليل البيانات بيوينفورمتيك. لإثراء مجموعات فرعية الخلوية محددة، وimmunophenotyped الأورام السائلة أول مرة من قبل التدفق الخلوي تليها FACS الفرز. لالأورام الصلبة، ويستخدم الليزر التقاط تسليخ مجهري لتنقية مجموعات سكانية فرعية الخلوية محددة. في الخطوة الثانية، يتم استخراج البروتينات من خلايا النقاء والجمع في وقت لاحق مع وجود ورم محددة،SILAC المسمى-ارتفاع في مستوى تمكن البروتين الكمي. يخضع الناتجة خليط من البروتين إما الكهربائي للهلام أو تصفية (فلترة) بمساعدة تحضير العينة (FASP)، يليه الهضم زيتية. وأخيرا، يتم تحليل الببتيدات زيتية باستخدام-رباعي orbitrap مطياف الكتلة الهجين، وتتم معالجة البيانات التي تم الحصول عليها مع مجموعات البرامج بيوينفورمتيك بما في ذلك MaxQuant. من خلال سير العمل المعروضة هنا، يصل إلى 8،000 البروتينات يمكن تحديدها كميا وفي عينات المستمدة من المريض، ويمكن مقارنة مما أدى لمحات البروتين التعبير بين المرضى لتحديد التوقيعات البروتين التشخيص أو الأهداف المحتملة المخدرات.

التنميط البروتين الأورام السائلة والصلبة من المرضى هو نهج واعد لاكتشاف المؤشرات الحيوية التشخيصية والتنبؤية جديدة. ومع ذلك، فإن الإجراء إعداد العينات والتحليل الطيفي الشامل وتحديا، نظرا لتعقيد العينات والحاجة إلى دقة القياس الكمي البروتين في مجموعات كبيرة من العينات. إجراء التجارب المذكورة أعلاه يبدأ مع عزل الخلايا من الفائدة، إما عن طريق مضان تنشيط الخلايا الفرز أو عن طريق الليزر التقاط تسليخ مجهري. لهذا الغرض، هي ملطخة الخلايا من نخاع العظام شفاطات المستمدة من المريض أو عينات من الدم مع الأجسام المضادة المسمى مضان ضد علامات سطح محددة من الفائدة قبل الفرز على أساس FACS وتحلل الخلية. لإثراء مجموعات فرعية الخلوية من أقسام الأنسجة، وهذه أول مرة يكون لتركيبها على الشرائح المناسبة للسماح ليزر التقاط تسليخ مجهري. لهذا الغرض جبل رانه أقسام الأنسجة على شرائح غشاء المناسبة واستخدام الليزر التقاط microdissector وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. اختيار أماكن وخلايا الفائدة يتطلب المعرفة المناسبة حول histomorphology من الأنسجة السليمة والأورام. ثم يتم نقل الخلايا المستخرجة إلى أنبوب جمع المناسب. يجب أن يتم تنفيذ التجارب الأولية من أجل تحديد كمية الأنسجة اللازمة لاستخراج كميات كافية من البروتين (الحد الأدنى البروتين الكلي 10 ميكروغرام) لكل أنسجة جديدة من الفائدة. يتم التعامل مع كل عينة microdissected مع 60 ميكرولتر من العازلة تحلل الأنسجة. للتحلل كفاءة الخلايا من عينات الأنسجة يجب أن sonicated لمدة 3 دقائق وبعد إضافة 15 ميكرولتر من عينات SDS يتم تحضين في thermomixer في 99 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإزالة crosslinks البروتين الناجم عن الفورمالين. سوف الطرد المركزي أخيرا تسهيل جمع المحللة الخلوي مسح. من كل داء من أنادفع الفوائد (السائل والأورام الصلبة) لمناسبة سوبر SILAC المعيار الكمي لابد من إنشاء 14. معيار المناسب يجب أن تمثل أكثر من 90٪ من البروتينات التي أعرب عنها في عينات من الفائدة. لإعداد معيار القياس الكمي، خطوط الخلايا المرتبطة ب نوع سرطان الفائدة ينبغي أولا تحليل بواسطة مطياف الكتلة لتحديد ملامح البروتين التعبير، وينبغي إجراء تحليل المكون الرئيسي في وقت لاحق. 4-6 خطوط مختلفة من الخلايا مع أنماط التعبير البروتين التفريقي يجب اختيار وSILAC المسمى مع أرجينين &quot;الثقيل&quot; ويسين. يجب فحص كفاءة وصفها من قبل nanoLC-MS / MS ويجب أن تكون أكبر من 98٪. بعد ذلك، ينبغي هي lysed خطوط الخلايا بنفس الطريقة كما العينة المستمدة من المريض منها، وبعد ذلك كميات البروتين متساوي المولية من كل عينة وSILAC-ارتفاع في مستوى ينبغي أن تكون مختلطة. خطوة حاسمة لدقيقة الكمي البروتين من العينات السريرية سالفائدة و هي خليط الدقيق لكميات البروتين متساوي المولية من العينات المستمدة من المريض وSILAC-ارتفاع في مستوى الكمي. لتحديد تركيز البروتين من لست] المستمدة من الخلايا فرزها، يمكن استخدام مختلف المقايسات البروتين الكمي. للست] الخلوية من الخلايا المشتقة من الأنسجة هناك حاجة إلى الفحص يمكن أن تتعامل مع تركيزات عالية من SDS وDTT في المحللة. تركيزات البروتين من العينات المستمدة من المريض وSILAC-ارتفاع في مستوى ينبغي قياس كل مرة قبل تركيبة مع العينات السريرية المعنية من أجل ضمان الخليط الصحيح، وهو أمر حاسم في اتخاذ حتى مئات من العينات للمقارنة. بعد خليط من كميات متساوية من ارتفاع في عينات قياسية والمحللة، تم الحصول عليها من تختلط مع LDS الأورام السائلة، تسخينها في thermomixer عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك تعرض ل1D-PAGE وفي جل الهضم للفصل البروتينات مع التربسين. عينات تم الحصول عليها منيتم الافراج عن الأنسجة من SDS ويتفاعل مع التربسين باستخدام نهج FASP كما حددها Wisniewski وآخرون 15 الببتيدات زيتية تم الحصول عليها يمكن قياسها كميا عن طريق قياس مضان التربتوفان، وهي ذات أهمية خاصة للعينات الأنسجة كما كمية من الببتيدات التي صدرت من مرشح يختلف ما بين 15٪ و 75٪ مقارنة مع كميات البروتين تحميلها في البداية على التصفية. لهذا الغرض نقيس مضان من التربتوفان. مقارنة مع سلسلة التخفيف التربتوفان مناسبة تسمح لتقدير حجم الببتيدات، و1.1 ميكروغرام من التربتوفان يتوافق مع ما يقرب من 100 ميكروغرام من الببتيد. إذا لزم الأمر، وعينات المستمدة خاصة من معالجة FASP يمكن قبل تنقيته إما تجارية أو محلية الصنع نصائح المرحلة محملة معكوسة (RP-C18) مادة مراحل C18 قبل تحميل على النظام nanoLC / MS / MS 18. يتم تنفيذ تحليل الكتلة الطيفي على ارتفاع، قرار، ذات حساسية عالية نظام مطياف الكتلة. وباختصار، فإن المحلاة عينات الببتيد وpreconcentrated على precolumn RP-C18، وفصلها على العمود التحليلي RP-C18 إلى جانب مباشرة إلى مطياف الكتلة. لتحقيق عمق كاف من التحليل، ونحن توظيف إما مزيج من SDS-PAGE البروتين prefractionation مع 40 دقيقة التدرجات RP-C18 (للأورام السائلة) أو حقن واحدة مع طويلة 2 - 3 في ساعة التدرجات RP-C18 (للأورام الصلبة التي تتم معالجتها بواسطة FASP ). يتم الحصول MS الأطياف بدرجة وضوح 70،000 FWHM أو أفضل، للسماح الكمي الدقيق للأزواج SILAC التي كتبها التكامل لمحات الذروة الكروماتوغرافي. لتحديد البروتين، يتم استخدام طريقة الشراء التي تعتمد على البيانات Top15 لتوليد عدد كبير من الببتيد MS / MS الأطياف لالببتيد وتحديد البروتين. من البيانات الخام الناتجة عن ذلك، وتتحقق تحديد البروتين وتقدير من قبل قاعدة بيانات البحث مع برنامج MaxQuant ضد UniProt Knowledgebasبروتيوم كاملة تسلسل قاعدة بيانات البريد الإنسان 17. في مجال البرمجيات MaxQuant (الإصدار الحالي 1.5.0.25) يتم تحديد الببتيدات من المكتسبة MS / MS الأطياف التي كتبها الببتيد شظية مطابقة ضد أطياف مستمدة في سيليكون من قاعدة البيانات تسلسل البروتين. وفي الوقت نفسه، يتم استخراج السلائف أيون لمحات النظائر في جميع أنحاء مرات الاحتفاظ الكروماتوغرافي بهم، وتستخدم المناطق الذروة متكاملة من أجل الكمي النسبي للضوء: أزواج الببتيد الثقيلة الناتجة عن وضع العلامات SILAC. ثم يتم تعيين هويات الببتيد وكثافة نسبية على خصائص البروتين المقابلة. ثم يتم استخدام البرمجيات فرساوس (الإصدار الحالي 1.5.0.15) لإجراء مزيد من التقييم الإحصائي المصب من نتائج المعالجة MaxQuant، بما في ذلك عينة إلى عينة المقارنات، PCA والتجميع الهرمي. باستخدام وصف الإعداد التجريبية التي حددناها وكميا يصل إلى 8،000 البروتينات من اقل من 30 ميكروغرام من البروتين الكليالمستمدة من الأورام السائلة. ويمكن تحديد ما يصل إلى 2،500 البروتينات من عينات الأورام الصلبة وكميا في نهج بروتيوميك بندقية مع التدرج LC فقط 2 ساعة، والسماح للتحليل مئات العينات السريرية في وقت قصير نسبيا. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> الشكل 1. سير العمل التجريبي. الخطوات الرئيسية لتخصيب الخلوية فرعية، والبروتين العزلة، وسلب في المعيار الكمي والتحليل الطيفي كتلة تظهر للأورام السائلة والصلبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> الشكل 2. strategi تخصيب الخلويوفاق. FACS الفرز وLCM. (A) استراتيجية النابضة المثالية التي تصور النابضة على السكان خلية ابيضاض الدم ملطخة CD117 التي حصل عليها فارز الخلية. (B) ملقط ليزر من نسيج الورم الصلبة. وقد شنت 10 ميكرون سمك على المغطاة فيلم الشرائح الغشاء قبل تلطيخ - أقسام الأنسجة من 5. وقد تم اختيار منطقة مصالح يدويا لملقط ليزر. المعروضة هي أقسام قبل تسليخ مجهري مع المنطقة من اهتمام ملحوظ الصفراء وبعد تسليخ مجهري. يتم تضمين شريط حجم 50 ميكرون في الشكل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> الشكل 3. تحليل الكتلة proteomes سرطان خلايا الإنسان. التحليل العنقودي بدون إشراف من العلاقات العامةتم إجراء ملامح التعبير otein الأورام السائلة والصلبة باستخدام منصة الحسابية رأس الغول. AC - غدية، SCC - سرطان الخلايا الحرشفية، SCC-MET - الحرشفية الانبثاث سرطان الخلايا من سرطان الرأس والرقبة، R - تكرار التقني.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors at JoVE.com

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

الكمي قداس الطيفية من التنميط Proteomes خلايا السرطان المستمدة من السائل والأورام الصلبة

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Views.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Video: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

تعيين تباين التعبير البروتين في الأورام باستخدام المناعي الكمي

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

تحديد<em&gt; الجمال النائم</em&gt; الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

في فيفو التصوير الضوئي من أورام الدماغ والتهاب المفاصل عن طريق نيون SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

طريقة الحصول على خلايا سرطان المبيض الابتدائية من العينات الصلبة

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.