The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

인체 조직 또는 혈액 샘플에 모든 실험은 윤리 투표에 나와있는 지침에 따라 윤리위원회의 승인을 수행해야합니다. 1. 휴대 심화 <ol><li> 액체 종양 / 형광 활성화 된 셀 정렬. <ol><li> 염화 암모늄을 사용하여 적혈구를 용해 또는 피콜 수행하여 밀도 구배 원심 분리하여 골수 또는 혈액 샘플로부터 단핵 세포를 분리. <ol><li> 적혈구 용해를 들어, 염화 암모늄 수용액 4 ㎖로 1 ㎖의 시료를 결합한다. 10 분 - 5 얼음에 솔루션을 품어. 400 XG에 5 분, 4 ° C의 인산염 완충 식염수 (PBS) + 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 원심 분리기 40 ML을 추가합니다. </li><li> 피콜 구배 원심 분리, 층이 별개의 층을 형성하는 피콜-Hypaque 15 ml의에 샘플 10ml를 들어 (레이어를 방해하지 않도록주의). 실온에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기 -주의 (15 ~ 25 ° C의)와 단핵 수확계면에서 수집 세포. </li><li> 세포를 스핀 다운 및 PBS + 2 % FCS에서 그들을 차지합니다. 5 분 400 XG에 원심 분리기 1 ml의 PBS + 2 % FCS에서 차지합니다. 음성 대조군으로 한 나누어지는 최종 얼룩에 사용 된 각 형광 염료에 대한 하나 나누어보세요. </li></ol></li><li> 30 분 동안 얼음에 제조업체의 지시에 따라 희석 백혈병 세포 집단을 분리하는 데 유용 형광 표지 된 항체로 인큐베이션. 또한 개별적 항체 보상에 사용 분취 얼룩. PBS + 2 % FCS로 두 번 씻으십시오. 참고 : 사용 된 항체는 CD117-PE (복제 95C3), CD34-FITC (클론 8G12) 및 CD33-PE (복제 P67.6)에 대한 마우스 항 - 인간이었다. </li><li> 35 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포는 셀 스트레이너에 이상적으로 사용하는 튜브 캡에 통합. </li><li> (예를 들어, 7-AAD) 세포 생존 능력 얼룩을 추가합니다. 적절한 셀 소터 (11) (그림 2)를 사용하여 정렬 세포. 단락 전류의 세포를 수집<html> 10 % FCS를 포함 비켜의 수정 된 둘 베코의 중간 (IMDM). </li></ol></li><li> 고형 종양 / 레이저 캡처 미세 절제. <ol><li> 기재된 실험을 위해, 폐암 FFPE 시료에서 샘플을 사용 하였다. 이 목적 폐암 조직 즉시 수술 적 절제 약 3 × 2 × 1cm의 조각 후 4 % 포르말린에 고정을 위해 추가 분석을 위해 파라핀에 포함한다. </li><li> 마이크로톰와 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 샘플에서 10 μm의 두께 - 5의 섹션을 잘라. 필름 피복 막 슬라이드와 1 시간 동안 37 ° C에서 건조에 마운트 섹션. Deparaffinize과 1 분 동안, 자일 렌의 연속 배양, 무수 에탄올 70 %와 물을 각각 장착 섹션을 재수. </li><li> 20 초 동안 헤 마톡 실린으로 섹션을 얼룩 후 수돗물로 씻어냅니다. 레이저 미세 절제 캡처 시스템을 사용하여 관심있는 세포 집단을 수집 (도 12 참조). </li></ol></li></ol>제목 &quot;&gt; 2. 단백질 추출 <ol><li> 액체 종양. <ol><li> 400 XG, 4 분 4 ° C에서 단계 1.1.5에서 세포 현탁액을 원심 분리기 상층 액을 버린다. 400 XG에서 5 분 동안 500 차가운 PBS의 μL 원심 분리로 두 번 세척하고 4 ° C </li><li> 10 6 세포 당 40 μL 용해 버퍼를 추가하고 (최소 세포 수를해야 10 5 세포 (약. 10 μg의 총 단백질)) 얼음에 15 분 동안 품어. 14,000 XG, 10 분 동안 39 ° C에서 용 해물을 원심 분리 새로운 반응 튜브에 상청 (클리어 세포 용 해물)를 옮긴다. 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 고형 종양. <ol><li> microdissected 조직에 조직 용해 버퍼의 60 μl를 추가하고 얼음에 15 분 동안 품어, 짧은 원심 분리하여 유체를 수집하고 새로운 반응 관에 정지를 전송합니다. 3 분 동안 얼음에 해물 초음파 처리. </li><li> 최종 SDS 공동 도달에 20 % 황산 도데 실 나트륨 (SDS)의 15 μL를 추가4 %의 ncentration. 1 시간 동안 가열 블럭에서 99 ° C에서 microdissected 조직을 인큐베이션하고 600 rpm으로 교반. 16,000 XG, 10 분 동안 18 ° C에서 해물을 원심 분리기 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li></ol></li></ol> SILAC 스파이크의 정량 표준 3. 설립 (슈퍼 SILAC 표준) 주 : 정량 표준은 4로부터 유도 SILAC 표지 된 단백질이 섞여 - 관심 종양 유형과 일치 6 세포주. SILAC 표지 된 기준 프로테옴 및 종양 유래 프로테옴 사이의 최대 오버랩을 달성하기 위하여, 주성분 분석은 세포주 정량 표준 14 선정되기 전에 수행 될 필요가있다. <ol><li> 주성분 분석 (PCA). <ol><li> 세포주의 단백질 발현 양상을 확인하기 위해, 적절한 세포 배양 배지에 약 10 가지 세포주를 배양. 로 용해 세포 기술로단계 2.1. 단계 6.1에 설명 된대로 질량 분석을위한 세포 용 해물을 준비합니다. </li><li> 고해상도 각 세포주의 단백질 발현 패턴을 분석하고, 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 장치에 결합 (nanoLC-MS / MS). </li><li> 무료 도자기 MaxQuant를 사용하여 생성 된 원시 데이터를 분석하고 페르세우스 16, 17 등의 관련 소프트웨어를 사용하여 주요 구성 요소 분석을 수행합니다. </li><li> 자신의 단백질 발현 양상의 가장 큰 다양성을 보여주고 슈퍼 SILAC 스파이크 표준을 생성하는 데 사용할 6 세포주 - 4를 선택합니다. </li></ol></li><li> SILAC 표지 및 라벨 검사. <ol><li> 아르기닌과 리신은 탄소 및 질소 (SILAC 매체) (4)의 안정적인 동위 원소로 표지 된 적합한 SILAC 세포 배양 배지에서 적어도 다섯 세포주기에 대한 선택된 세포주를 배양. </li><li> 로 용해 단계 6.1에 설명 된대로 3.1 단계에 설명 및 질량 분석을위한 세포 용 해물을 준비하는 세포.nanoLC-MS / MS에 의한 SILAC 라벨의 결합 효율을 측정한다. MaxQuant와 결과 원시 MS 데이터를 분석하고 SILAC 라벨링의 효율성을 결정합니다. 이것은 그들의 표지 (중량)에서 식별 된 펩티드 및 그의 내인성 폼 (광)의 개수를 카운트하고, 비율 (중량) / (+ 무거운 광)을 계산함으로써 달성된다. 라벨 효율은 98 %를 초과해야한다. </li></ol></li><li> SILAC의 프로테옴 및 검증의 조합입니다. <ol><li> 배양 및 적절한 SILAC 매체에 지침을 제조에 따라 선택 세포주를 확장합니다. 를 Lyse 고형 종양에 대해 단계 3.2에 기재된 각 세포 용 해물에 대한 단백질 농도를 결정 액상 종양 2.1 과정 또는 세포. </li><li> 각 세포주의 동일한 몰 양의 단백질을 분취 량으로 혼합하고, 혼합물을 나눈다. 측정 할 때까지 -80 ° C에서 분주 저장을 스냅 동결. 슈퍼 SILAC 표준의 50 μg의 - 한 실험의 경우는 20이 필요합니다. 스탠를 준비하는주의일련의 실험에서 표준 변경 등 초과 준 피해야한다. </li></ol></li></ol> 단백질 농도와 스파이크에서 4. 측정 <ol><li> 액체 종양. <ol><li> 단백질 정량 분석​​법을 이용하면, 각 세포 용 해물과 슈퍼 SILAC 표준의 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 클리어 세포 용 해물과 슈퍼 SILAC 표준 동량 혼합하고이어서 도데 실 황산 리튬 (LDS) 완충액 (샘플 량의 25 %) 및 ​​환원제 (샘플 량의 10 %)을 추가한다. </li><li> 10 분 동안 72 ℃에서 가열 블록에서 생성 된 용액을 가열한다. 선택적으로, -80 ° C에서의 결과 변성 단백질을 저장합니다. </li></ol></li><li> 고형 종양. <ol><li> 플레이트 판독기에 단백질 농도 측정을 위해, (BSA) 희석액 시리즈, 파쇄물 및 시판 단백질과 적절한 슈퍼 SILAC 표준 표준 소 혈청 알부민을 섞어96 웰 플레이트에 ssay, 1 분 동안 흔들어 지정된 시간 동안 배양 및 제조 업체에 의해 지시 된 바와 같이 흡광도를 측정한다. 참고 : 해물의 높은 SDS의 농도와 디티 오 트레이 톨 (DTT)는 단백질 농도 결정에 가장 사용할 수 분석에 대한 문제입니다. </li><li> 명확히 해물 및 20 ° C에서 30 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기 우레아 200 μL와 슈퍼 SILAC 표준의 동일한 양을 혼합한다. 50 개 이상의 명확히 해물 μL와 슈퍼 SILAC 표준을 사용하지 마십시오. 그 요소가 결정화되지 않도록, 15 ° C 이하의 온도를 피하십시오. </li></ol></li></ol> 5. 샘플 분리 및 단백질 다이제스트 <ol><li> 액체 종양. <ol><li> 12 % 그라데이션 SDS-PAGE 젤 - 별도의 30 - 4 레인 당 100 μg의 총 단백질. 코마시 블루 O / N으로 얼룩 단백질. 물이 이후의 세척에 의해 초과 쿠마 얼룩을 제거합니다. </li><li> 겔에서 각 레인을 차단하고 분할에 관계없이 젤 염색 패턴의 23 동일한 크기의 조각으로. 0.6 ml의 폴리 프로필렌 바이알에서, 개별적으로 각각의 젤 슬라이스를 처리한다. </li><li> 물과 메탄올 / 물 (50:50, V는 / V), 56 ° C에서 30 분 동안 배양하여 10 mM의 DTT로 줄이기로 겔 조각을 씻으십시오. 어둠 속에서 실온에서 60 분에서 배양하여 요오도 아세트 아미드 55 mM의 (IAA)와 겔 조각을 킬레이트. </li><li> 시료 처리 단계들 사이, 과량의 용매를 제거하고, 시약 용액의 흡수를 향상시키기를 Speedvac에서 15 분 동안 건조 아세토 니트릴로 슬라이스를 세척 하였다. </li><li> 37 ° C에서 16 시간 동안 (0.025 M 수성 중탄산 암모늄 12.5 NG / μL) 돼지 트립신 용액 최소량으로 건조 겔 슬라이스를 재수 프로테아제에 의해 절단을 수행한다. </li><li> 젤 조각에 10 μl의 물을 추가하고 37 ° C에서 15 분 동안 품어. 80 μL 아세토 니트릴을 추가하고 37 ° C에서 15 분 동안 품어. 1 분 동안 15,800 XG에 원심 분리기. 별도의 0.6 ㎖에 뜨는 및 저장소를 수집튜브. </li><li> 5 % 포름산 용액, 소용돌이의 65 μl를 추가하고 37 ° C에서 15 분 동안 품어. 65 μL 아세토 니트릴을 추가하고 37 ° C에서 15 분 동안 품어. 1 분 동안 15,800 XG에 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 이전 단계의 상층 액에 추가합니다. 진공 농축기에서 건조에 결합 된 상층 액을 증발. </li></ol></li><li> 고형 종양. <ol><li> 조직 파쇄물 SDS를 제거하기 위해도 기준 15으로 설명 된 다음 FASP 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 단계 5.2.3에서 설명한 제 원심 분리 후 20 ° C에서 20 분 동안 14,000 XG에서 필터 8 M 우레아를 추가로 200 μL, 또한 원심 분리기를 추가한다. 흐름을 통해 여과 액을 버린다. </li><li> 100 μL IAA를 추가하고 1 분 동안 600 rpm에서 써모에 섞는다. 어둠 속에서 20 ° C에서 20 분 동안 필터를 품어. 20 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 필터를 원심 분리기. </li><li> 필터 및 CEN에 요소의 100 μl를 추가20 ℃에서 15 분 동안 14,000 XG에 trifuge. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 20 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에서 필터와 원심 분리기에 NH 4 HCO 3의 100 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 40 μL NH 4 HCO 3 + 1 μL (= 0.4 μg의) 트립신을 추가하고 600 rpm으로 1 분 동안 20 ° C에서 써모 믹스. 37 ℃에서 습윤 챔버에서 필터 O / N 부화. 새 컬렉션 튜브 필터를 전송합니다. </li><li> 20 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 필터를 원심 분리기. 20 ° C에서 10 분 동안 14,000g에서 NH 4 HCO 3, 원심 분리기 50 μL 필터를 추가합니다. 질량 분광 측정 할 때까지 -20 ° C에서 생성 된 펩티드를 저장합니다. </li><li> 펩티드 농도 측정을 위해 96 웰 플레이트에 얻어진 관류 깔끔한 트립토판의 적절한 희석액의 시리즈 중 50 μL 분주. 트립토판 형광을 측정합니다. 의 결과 농도 변환트립토판 0.1 μg의 같은 펩타이드 농도 트립토판, 9 μg의 단백질에 해당합니다. </li></ol></li></ol> 6. 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석 <ol><li> 초음파 욕조에서 5 분 동안 30 μL 로딩 버퍼의 펩티드를 재용. 1 분 동안 15,800 XG에서 원심 분리기에 스핀 다운과 MS 오토 샘플러 유리 병에 맑은 용액을 피펫. </li><li> nanoLC-MS / MS 시스템의 자동 시료 주입기를 사용하여 분석 당 샘플의 5 μl를 주입한다. C18 사전 칼럼 (5 μm의 기공 크기 C18 재료로 0.15 mm의 ID X 20mm)이 배출 한 열 설정이나 프리 컬럼 전환 설정에 설치할 역상에 온라인으로 집중과 탈염 펩티드. </li><li> 역상 C18의 마이크로 칼럼에서 분리 된 펩티드 (0.075 mm ID X 200mm 자체 충전 5&gt; 35 % 아세토 니트릴의 90 분 구배 대를 사용하여, 예컨대 PicoFrit 같은 자기 팩의 nanospray 열에 3 ㎛ 이하의 기공 크기 C18 재료 300에서 NL., 0.1 % 수성 포름산 /분. 의 nanospray 이온 소스를 통해 혼성 사중 극 / orbitrap 질량 분광계로 전송 용리액. </li><li> Top15 데이터에 의존 취득 법 (MS의 M / Z 범위 (350) 사용 펩티드 분석 -. 1600, 해상도 대상 70.000 FWHM, AGC 대상 1 × 6, 최대 충전 시간이 60 밀리 초 MS / MS 질량 100 시작, 해상도 대상 17.500 FWHM, AGC ., MS / MS 임계 값 3 × 10 4 2 × 10 (5), 최대 충전 시간이 60 밀리 초를 대상으로 충전 상태 2 등 - 5, 표준화 충돌 에너지 NCE 25 %, 동적 제외 15 초). </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 데이터 분석을 위해 무료로 사용할 수 MaxQuant 16 소프트웨어를 사용합니다. 생물 정보학적인 분석에 대한 데이터 (16, 17)은 상세한 프로토콜 설명한다. 분석을 위해, 17 번의 실험으로 SDS-PAGE 차선에서 모든 슬라이스 원시 데이터 파일을 결합한다. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers.">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li></ol>

저자는 공개 할 관심이나 다른 문제의 충돌이 없습니다.

환자 유래의 암 세포 프로테옴의 질량 분석 프로파일은 새로운 진단 / 예측 바이오 마커 발견에 필요할뿐만 아니라 암세포 생물학의 더 나은 이해를 제공 할 수도 새로운 잠재적 인 약물 타겟들의 식별에 차례 리드. 다양한 사전 분석 문제 하나가 견고하고 생물학적으로 중요한 결과를 얻을 경우, 해결되어야 할 필요가 있기 때문에, 이러한 질량 분광 분석은 특히, 매우 도전적이다. 여기에 설명 된 실험적인 작업 흐름은 액체 및 고체 종양 모두의 세포 개체군에서 파생 된 프로테옴의 정량 프로테오믹스 특성화 수 있습니다. 어느 FACS 기반 셀 sortingor의 미세 절제함으로써 종양 세포의 농축은 초기 종양 미세 환경의 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 필요하다. 또한, 이들 기술은 하나의 세포가 관심 개체군을 분리 할 수​​있다. 최근 세포 생물학적 연구는 악마가특정 세포 개체군이 종양을 시작하는 특성을 가지고있어 암 발병 (19, 20)에 대한 관련성이 높은 것을 strated. 질량 분석은 최근 몇 년 동안 더 민감하게되면서, 양적 프로테옴 분석은, 몇 천 세포로부터 유도 될 수있다 단백질의 소량을위한 실현 가능한 것이 가능 기능적으로 관련 세포 집단에 초점을 할 수있다. 여기에 제시된 셋업은 FFPE 시료에서 신규 진단 바이오 마커를 식별하고 검증하는 데 사용될 수있다. 따라서, 여전히 많은 유형의 암 및 적절한 수의 품질 분자 바이오 마커의 부족으로 현재까지 임상 진단의 개선을위한 유용한 도구 BEA 약속. 바이오 마커가 부족하는 어려운 차동 진단의 중요한 예는 폐에 전이, intrapancreatic cholangiocellular 암 및 췌장 선암에서 원발성 폐암 사이의 차별이다,뿐만 아니라 다른고도의 악성 말초 신경 칼집 종양에서 양성 신경 섬유종의 entiation. 또한, 우리는 다른 사람의 서명 단백질체 정량 해명은 일반적으로 암 세포 생물학 연구 및 암 환자에서 치료 적 응답 (21)의 예측을위한 바이오 마커를 드러내는 유용 할 수 있음을 보여 주었다. 여기에 제시된 방법의 단점은 두 개의 전류 광범위한 설명서 시료 처리에 대한 요구 및 nanoLC-MS / MS 획득 시간에 대한 요구이다. 전자는 예를 들어, 96 웰 형식으로 시료 전처리를 이동 로봇 및 프로세싱을 사용하여 해결 될 수 있지만, 후자는 질량 분석 인수 전략의 변경을 요구할 것이다. 표적 단백질의 서브 세트는 예를 들면, 종양의 분류와 연관 될 수있는 식별되고 나면, 우리는 매우 감소 분리 노력이 서브 세트에 대한 판독 값을 제공하는 정량 대상 질량 분석 방법의 설계를 직시 한따라서 대응하여 획득 시간 감소와. (24)로부터 감소 될 수있다 요구되는 필요한 수집 시간 경우 - 36 시간 (액체 종양) 또는 3 시간 (고형 종양)을 예 :하기 1 시간 후 질량 분석 및 펩티드의 단순한 일차원 분리, 처리량 얻어진 이득을 타겟팅 사용 하 정량 결과의 유의성 개선 대응하는, 생물학적 검사 기술 복제물 유의 숫자를 증가하는데 사용될 수있다. 타겟 질량 분석 방법은 이미 암 관련 단백질 바이오 마커 - 후보 (22)의 검증을위한 적절한 도구로 입증되었다, 그들은 검증 또는 심지어 루틴 임상 23 전위 도구로 약속 표시 점 개발되어왔다 24.

질량 분석 기반 단백질 체학 (proteomics)가 등장했다 및 세포 생물학 및 병진 생물 의학 연구에 널리 사용되는 분야는 지금이다. 단백질 수천 번의 질량 분석 실험 1,2-에서 식별 될 수있는 기술 분야에서의 진보는 세포주 및 동물 모델에서 복잡한 세포 과정을 연구하는 것이 가능했다. 이것은 일반적으로 변성 2,3- 유형별 농축 및 데이터 분석을 위해 주문 된 워크 플로우가 필요하지만 유사하게 진행, 예컨대 인산화 또는 유비퀴틴 많은 번역 후 변형의 분석을했다. 또한, SILAC를 포함하여 화학 및 신진 대사 라벨링 전략의 참여는 인간의 암 4의 기본 세포 과정, 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 약물 표적의 발견이 방법은 특히 매력적인 만드는 단백질과 PTMS의 정확한 상대 정량화 할 수 있습니다. 그러나,여러 과제 일차 인간 암 (5)의 프로테옴 해석에 관해서 극복되어야한다. 첫째, 인간의 암 샘플은 종종 면역 세포와 섬유 아세포를 포함한 종양 미세 환경에 속하는 다양한 유형의 세포의 존재로 인해 세포 이질성 고도를 나타낸다. 둘째, 클론 진화는 별개의 기능적 특성과 여러 세포 개체군의 존재의 결과로, 자신 종양 내에서 유전 적 다양성에 연결됩니다. 암 발생 및 진행, 예컨대 (기능적 관련성) 세포 개체군의 프로테옴 분석 뒤에 구동력 인 몇 암 줄기 세포의 현재의 개념에 따르면, 임상 적 적용에 대한 중요한 발암 기전의 더 나은 이해를 위해 매우 중요 할 것으로 예상된다 6. 셋째, 많은 양의 샘플 세트들의 정량적 단백질 발현 프로파일은 종종 강력한 임상 BIOMAR의 식별에 필요한KERS; 의존 그들이 같은 세포 증식 4에서, - - 마찬가지로 대상 외 대사 표지 전략이 동안, 예컨대 7 iTRAQ 화학적 라벨링함으로써 달성 될 수 없다. 넷째, 가장 가능한 고형 종양 샘플은 포르말린 고정 의한 가교 단백질 (8)의 형성에 질량 분석 프로테옴 해석을 복잡하게한다. 마지막으로, 대부분의 기존 프로테오믹스 흐름이 곤란 임상 연구에 대한 중요한 시료 번호의 렌더링 분석 시료 처리 및 데이터 수집의 상당한 양을 요구하고, 새로운 워크 플로우를 요구하면 9,10 패러다임. 이러한 장애를 해결하기 위해 우리는 포괄적 인 질량 분석에 대한 글로벌 내부 표준을 소개하는 슈퍼 SILAC (14) 전략과 세포 농축을 위해 11 레이저 캡처 미세 절제 12, 13 정렬 중 하나 유세포 셀을 결합하는 실험 장치를 개발. 여기에 기술 된 방법을 사용함으로써, 액체 또는 고체의 암 중 하나로부터 유도 된 인간 종양 샘플에서 8000까지 단백질 정량화 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

심층 암세포 프로테옴 분석은 종양 pathomechanisms 해명뿐만 아니라 잠재적 인 약물 표적 및 진단 바이오 마커를 식별하는 데 필요하다. 그러나, 환자 유래의 종양, 특히 자신의 세포 개체군에서 정량 프로테오믹스 특성화하기위한 방법은 크게 부족하다. 여기에서 우리는 액체 또는 고체 종양 중 하나에서 파생 된 암 세포 개체군의 프로테옴의 정량 분석​​을 허용하는 실험 장치에 대해 설명합니다. 이는 생물 정보학적인 데이터 분석 하였다 정량적 슈퍼 SILAC 계 질량 분석법으로 세포 농축 전략을 조합함으로써 달성된다. FACS - 정렬 한 다음 세포 계측법 특정 세포 하위 집합을 풍부하게하기 위해, 액체 종양은 제 1 유동에 의해 immunophenotyped된다 고형 종양에 대해, 레이저 캡처 미세 절제는 특정 세포 개체군을 정화하는 데 사용됩니다. 제 2 단계에서, 정제 된 단백질이 세포로부터 추출되고이어서 암 특이 적 결합,단백질 정량을 가능하게 스파이크 표준을 SILAC 표지. 생성 된 단백질 혼합물을 겔 전기 영동 또는 트립신 분해를 돕는 뒤에 필터 시료 준비 (FASP) 중 실시된다. 마지막으로, 트립신 펩티드 하이브리드 orbitrap 극자 질량 분광계를 이용하여 분석하고, 얻어진 데이터는 MaxQuant 포함한 생물 정보학 소프트웨어 군으로 처리된다. 8,000 단백질까지, 여기에 제시된 방법의 흐름에 의해 식별 될 수 있고, 환자 유래의 시료의 정량하고, 얻어진 단백질 발현 프로파일 진단 단백체 서명 또는 잠재적 약물 표적을 식별하는 환자 중 비교 될 수있다.

환자의 액체 및 고체 종양의 프로테옴 프로파일 링은 새로운 진단 및 예측 바이오 마커의 발견을위한 유망한 접근법이다. 그러나, 샘플 제조 절차 및 질량 분석은 샘플의 복잡성과 샘플의 큰 집합의 정확한 단백질 정량에 대한 필요성으로 인해, 도전이다. 위에서 설명한 실험 절차는 형광 활성화 셀 정렬 또는 레이저 캡처 미세 절제에 의해 하나, 관심의 세포의 분리와 함께 시작합니다. 이를 위해 환자 유래 골수 흡인 또는 혈액 샘플에서 세포를 FACS 기반의 정렬 및 세포 용해 전에 관심의 정의 표면 마커에 대한 형광 표지 항체로 염색된다. 조직 섹션에서 세포의 부분 집합을 풍부하게하려면 다음 먼저 레이저 캡처 미세 절제 수 있도록 적절한 슬라이드에 장착해야합니다. 이를 위해 t 마운트그는 적절한 막 슬라이드에 조직 절편과는 제조업체의 지침에 레이저 캡처 microdissector 따라 사용합니다. 지역과 관심의 셀을 선택하면 건강하고 종양 조직의 histomorphology에 대한 적절한 지식이 필요합니다. 추출 된 세포는 적절한 수집 튜브로 전송됩니다. 초기 실험은 관심있는 모든 새로운 조직에 대한 충분한 양의 단백질 (최소 10 μg의 총 단백질)의 추출에 필요한 조직의 양을 정의하기 위해 수행되어야한다. 각 시료 microdissected 조직 용해 완충액 60 μL로 처리된다. 효율적인 용해를 들어 조직 샘플로부터의 세포를 포르말린 - 유도 된 가교 결합 된 단백질을 제거하기 위해 1 시간 동안 99 ° C에서 써모 인큐베이션 3 분 동안 샘플을 SDS 15 μL를 첨가 한 후 초음파 처리되어야한다. 원심 분리 마침내 지워 세포 용 해물의 수집을 용이하게합니다. 나는 모든 질병에 대한nterest (액체 및 고체 종양)에 적합한 슈퍼 SILAC 정량 표준이있다 (14)를 설립한다. 적절한 표준은 관심 샘플에서 발현 된 단백질의 90 % 이상을 나타낼 것이다. 정량 표준의 준비를위한 관심의 암 유형에 관련된 세포주 제 그들의 단백질 발현 프로필을 결정하기 위해 질량 분석기로 분석한다이어서 주성분 분석이 수행되어야한다. 4 - 차동 단백질 발현 패턴을 가진 6 개의 세포주를 선택하고 &quot;무거운&quot;아르기닌과 라이신과 SILAC은 표지되어야한다. 라벨 효율은 nanoLC-MS / MS에 의해 확인되어야하고, 98 %보다 커야합니다. 이후, 세포주이어서, 각 샘플 및 SILAC 스파이크 표준 몰량의 단백질 양이 혼합되어야 각 환자 유래의 시료와 같은 동일한 방식으로 용해되어야한다. 오 임상 샘플의 정확한 단백질 정량 중요한 단계F의 관심은 환자 유래 샘플 및 SILAC 스파이크의 정량 표준의 몰 단백질 양의 정확한 혼합물이다. 정렬 세포 유래의 용 해물의 단백질 농도를 결정하기 위해, 다양한 단백질의 정량 분석​​이 사용될 수있다. 조직 유래 세포에서 세포 용 해물에 대한 분석은 해물 SDS와 DTT의 높은 농도를 해결할 수있는이 필요하다. 환자 유래의 시료와 SILAC 스파이크 된 표준 단백질 농도에도 필적 수백 개의 샘플 제작에 중요 올바른 혼합물을 보장하기 위해 각각의 임상 샘플 전에 조합마다 측정되어야한다. 분리의 1D-PAGE로 10 분 동안 72 ° C에서 써모 LDS 가열과 혼합 액체 종양으로부터 수득하고이어서 실시하고, 표준 샘플과 파쇄물에서 스파이크 및 겔에서 소화 등량 혼합물의 후 트립신 단백질. 샘플에서 얻은조직 위스 니 스키 등에 의해 제정 된대로 FASP 방식을 사용하여 SDS에서 해방하고 트립신 분해된다. 15 수득 된 트립신 펩티드는 필터로부터 방출 펩티드의 양이 초기 필터 상에 로딩 된 단백질 량에 비해 15 %와 75 % 사이의 차이로 조직 샘플에 대한 특별한 관심의 트립토판 형광을 측정함으로써 정량화 될 수있다. 이를 위해 우리는 트립토판의 형광을 측정한다. 트립토판의 1.1 μg의 약 100 μg의 펩타이드에 해당 같은 적절한 트립토판 희석 시리즈와 비교, 펩티드의 정량 수 있습니다. 필요한 경우 FASP 처리에서 특히 유래 시료 nanoLC / MS / MS 시스템 (18) 상에로드하기 전에 역상-C18 (RP-C18) 물질로 충전 상업적 또는 집에서 만든 스테이지 팁 하나에 미리 정제 할 수있다. 대량 분광 분석은 높은 수행됩니다지키미, 고감도 질량 분석 시스템입니다. 즉, 펩티드 샘플은 탈염 및 RP-C18의 프리 컬럼에 통과시켜 농축하고, 질량 분석 장치에 직접 결합 RP-C18 분석 컬럼상에서 분리. FASP에 의해 처리 고형 종양에 대해 (3 시간 RP-C18 구배 - 분석의 충분한 깊이를 달성하기 위해, 우리는 긴 2 40 분 RP-C18의 (액체 종양) 그라디언트 또는 단일 주사와 SDS-PAGE 단백질 예비 분별의 조합 중 하나를 사용 ). MS 스펙트럼은 피크의 크로마토 그래피 프로필을 통합하여 SILAC 쌍의 정확한 정량을 허용하도록, 70,000 이상 FWHM의 해상도에서 획득된다. 식별을위한 단백질, Top15 데이터 의존 취득 방법은 펩티드 및 단백질 식별 펩티드 MS / MS 스펙트럼의 다수를 생성하는데 사용된다. 결과 원시 데이터에서, 단백질 식별 및 정량화 UniProt Knowledgebas에 대한 MaxQuant 소프트웨어와 데이터베이스 검색에 의해 달성된다즉 완전한 인간 프로테옴 서열 데이터베이스 (17). MaxQuant 소프트웨어 (현재 버전 1.5.0.25)에서 펩타이드는 단백질 서열 데이터베이스에서 실리에서 파생 된 스펙트럼에 펩티드 단편 일치에 의해 획득 한 MS / MS 스펙트럼에서 식별됩니다. 동시에, 동위 프로필 이온 전구체는 크로마토 그래피 체류 시간 주위를 추출하고, 그 통합 된 피크 면적은 광의 상대적인 정량을 위해 사용된다 : SILAC 라벨링에 의해 생성 된 펩티드 무거운 쌍. 펩타이드 정체성과 상대 강도는 다음 해당 단백질의 특성에 할당됩니다. 페르세우스 소프트웨어 (현재 버젼 1.5.0.15) 그런 샘플 간 비교, PCA 및 계층 적 클러스터링을 포함 MaxQuant 처리 결과 하류 통계적 평가를 수행하는데 사용된다. 실험 장치는 우리가 식별 한 설명과 같은 작은 총 단백질의 μg의 30에서 8,000 단백질까지 정량 사용액체 종양에서 유래. 고체 종양 샘플에서 최대 2,500 단백질 식별 및 비교적 짧은 시간에 임상 수백 개의 샘플의 분석을 허용하는, 단지 2 시간의 LC 구배 산탄 프로테오믹스 방법으로 정량화 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> 그림 1. 실험 워크 플로우. 셀룰러 일부 농축, 단백질 분리의 주요 단계는, 스파이크에 액체 및 고체 종양 표시된 정량 표준 및 질량 분광 분석을. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> 그림 2. 세포 농축 strategi에스. FACS 정렬 및 LCM. (A) 실시 게이팅 전략은 셀 소터에 의해 취득 CD117 염색 백혈병 세포 집단 상에 게이팅 묘사. 고형 종양 조직의 (B) 레이저 캡처 미세 절제. (5)의 조직 절편 - 10 μm의 두께는 염색 전의 필름 피복 막 슬라이드 상에 장착 하였다. 관심 지역은 레이저 캡처 미세 절제에 대해 수동으로 선택되었다. 관심 영역과 미세 절제 노란색과 미세 절제 후 표시하기 전에 섹션있는 바와 같다. 50 ㎛의 스케일 바는 그림에 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> 인간의 암 세포 프로테옴 그림 3. 클러스터 분석. 홍보의 자율 군집 분석액체 및 고체 종양 otein 발현 프로파일 페르세우스 연산 플랫폼을 이용하여 수행 하였다. AC - 선암, SCC - 편평 세포 암, SCC-메트로 - 기술 복제 - 머리와 목 암, R에서 편평 세포 암 전이.

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Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K 조회수.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

연구

의학

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

의 식별<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em링커로 인한 PCR을 사용하여 고체 종양의&gt; Transposon의 삽입

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

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