We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and M&#233;lissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to St&#233;phane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.

ويهتم جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة لوالتعامل معها وفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. 1. إنتاج المؤتلف AAV (rAAV) بواسطة عابر ترنسفكأيشن من كلوة-293 خلايا 17،18 ملاحظة: انظر مكلور C، إن الرب (2011) 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية مستحضر على نطاق واسع بلازميد (على الأقل 1 ملغ / مل) من البلازميدات ناقلات AAV. استخدام 3 البلازميدات. البلازميد AAV المساعد تحمل تكرار وقفيصة الجينات دون AAV مقلوب محطة يكرر وائح الاتصالات الدولية، والكاسيت التعبير التحوير تحمل أحالت AAV ITR باسم البلازميد نقل، والبلازميد توريد الجينات اتش المساعد E2، E4، والجينات VA RNA المشار باسم pHELPER. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293 بالنقل الخلايا مع هذه البلازميدات 3 باستخدام polyethyleneimine (أو غيرها من كاشف ترنسفكأيشن). فوق 80٪ من كفاءة ترنسفكأيشن هو ضروري لالسادس جيدعائدات راؤول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية AAV المؤتلف من 293 لست] خلية على التدرج iodixanol. ويستخدم 15٪، 25٪، 40٪، و 60٪ iodixanol للحصول على التدرج. جمع 40٪ iodixanol جزء التي تحتوي على جزيئات AAV، والتركيز على جزء بعد تنبيذ فائق ب 500،000 x ج لمدة 1 ساعة وعازلة الصرف مقابل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 0.001٪ Pluronic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الفيروسي عيار 20 الجيني، إجراء الدناز ProteinaseK هضم تليها QPCR. الاشعال إلى الأمام وعكس تضخيم المنطقة 62 بي بي تقع في AAV2 ITR. لمعيار البلازميد، هو المسمى التحقيق مع FAM، ولها ثقب أسود فاكهه تقضي (BHQ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ QPCR (الكمي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل) في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر باستخدام 340 نانومتر عكس ITR التمهيدي، 100 نانومتر ITR إلى الأمام التمهيدي، 100 نانومتر AAV2 ITR التحقيق، 0.4 ملي dNTPs، 2 مم MgCl2، 1X البلاتين طق العازلة، 1U البلاتين طق و 5 قالب ميكرولتر (قياسي، عينة وأي سيطرة قالب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلىالمعيار، واستخدام البلازميد لترنسفكأيشن في 7 × 10 أضعاف التخفيفات المتسلسلة (5 ميكرولتر من كل 2 × 09-02 أكتوبر × 10 3 الجينوم / مل مما أدى إلى تركيز النهائي من 10 أكتوبر - 10 أبريل الجينوم / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البرنامج خطوة تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 40 دورة من تمسخ في في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة والصلب / تمديد في 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير أو في -20 ° C لفترات التخزين الطويلة. </li></ol> 2. Intravitreal حقن AAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران C57BL6J مع الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) والتحقق من فقدان المنعكس التقويمي، منعكس الانسحاب وذيل قرصة استجابة مما يدل على أن التخدير المناسب. تمدد التلاميذ من خلال تطبيق القرنية من neosynephrine 5٪ و 0.5٪ mydriaticum قطرات العين. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير G disposab متناهية الصغر 30لو الإبرة من خلال خط الاستواء وبجانب حوف، في تجويف الجسم الزجاجي (انظر تشيو K، إن الرب (2007) 21). حقن 1 ميكرولتر الأسهم التي تحتوي على 1-4 × 10 11 نائب الرئيس للShH10-GFP أو AAV5-GFP مع الملاحظة المباشرة من الإبرة في وسط تجويف الجسم الزجاجي (الشكل 1). استخدام عين واحدة كعنصر تحكم للتجارب ILM. حقن كلتا العينين للتجارب BRB. تطبيق العلاج الموضعي المضادة للالتهابات ومضادة للجراثيم في عيون حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمدد التلاميذ مع neosynephrine وقطرات العين mydriaticum للتصوير. أداء الامتحانات قاع مع كاميرا قاع العين لمتابعة GFP (البروتين الأخضر نيون) التعبير 1 أسبوع، 2 أسابيع، 1 شهر، و2 أشهر بعد الحقن intravitreal (الشكل 1). التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 1-2 أشهر بعد الحقن. </li></ol> 3. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لcryosections شبكية العين (الشكل 1)، تشريح عيون منزوعة النواة لإزالة لENS والقرنية، والغمر الإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 1 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect عيون ثابتة سابقا في 10٪ سكروز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، و 20٪ السكروز لساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. Cryoprotect في 30٪ من محلول السكروز، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تجميد وتضمين eyecups في تضمين الراتنج مثل البرد المصفوفة. جعل 10 ميكرون cryosections وجبل على الشرائح معاملة خاصة لأقسام الأنسجة المجمدة والتي تعمل على تحسين الالتزام الأنسجة خلال تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize أقسام مع 0.1٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة لمدة 5 دقائق. غسل 2X في برنامج تلفزيوني وكتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA، 0.1٪ توين 20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لflatmounts الشبكية (الشكل 1)، وتحديد العيون منزوعة النواة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة لتسهيل تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 15-30 دقيقة، وتشريح العين لإزالة القرنية والعدسة. فصل الشبكية من الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) والصلبة عن طريق خفض حول مشرشر أورا والعصب البصري. تزج في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة أخرى لإصلاح الشبكية وبروتين فلوري في خلايا الشبكية transduced (يجب ألا يتجاوز تثبيت 24 ساعة). يغسل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني العقيمة، ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير PBS إلى عرقلة العازلة (PBS مع 1٪ BSA، 2٪ الماعز العادي أو مصل حمار، 0.5٪ تريتون X-100)، واحتضان في عرقلة العازلة إما 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة إما 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية خلال الليل. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني. ملاحظة: الأجسام المضادة المستخدمة هي كما يلي: مكافحة laminin (1 / 1،000) وصفها ILM، استنساخ مكافحة رودوبسين 4D2 (1/500) قضبان وضع العلامات، ومكافحة الجلوتامين مخلقة استنساخ GS-6 (1 / 1،500) وضع العلامات الخلايا مولر ، السلطة الوطنية الفلسطينية كتين (1/40) المخاريط وضع العلامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة مع 1: 500 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلور اليكسا في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة (cryosections) أو 2 ساعة (flatmounts) في غرفة تيمبيrature ومحمية من الضوء. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تخفيف تخفيضات لشبكية العين وflatmount وضعها على شريحة زجاجية مع إما مستقبلة للضوء في شبكية العين أو الخلايا العقدية (RGC) الجانب متجهة لأعلى. إضافة mountingmedium مائي، وتطبيق ساترة وتخزينها في 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المجهري متحد البؤر على الليزر المسح المجهر متحد البؤر. الحصول على صور بالتتابع، سطرا سطرا، للحد من الإثارة والحديث المتبادل الانبعاثات. تحديد حجم الخطوة وفقا لنظرية أخذ العينات نيكويست-شانون. استخدام الإعدادات التي تقلل من التعرض بكسل مشبعة في الصور النهائية. عملية صور 12 بت مع فيجي، ومشروع Z-أقسام على متن طائرة واحدة باستخدام الحد الأقصى لكثافة تحت وظيفة Z-المشروع وأخيرا تحويل إلى 8 بت وضع الألوان RGB. </li></ol> 4. تحليل PCR من ماوس عينات الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 100 ميكرولتر الأسهم التي تحتوي على 1-4 × 10 11 الجسيمات من AAV-GFP في الوريد القضيب من الفئران C57BL6J تخدير (5٪ من الأيزوفلورينلتحريض في غرفة وثيقة و 2.5٪ من الأيزوفلورين من خلال مخروط الأنف أثناء الجراحة) باستخدام حقنة الأنسولين مع غاية في الدقة 6 مم إبرة. وهذا الحيوان بمثابة مراقبة إيجابية تعميم جزيئات AAV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدم عينة من ذيل فأر قبل الحقن و3 ساعة و 24 ساعة، 2 أيام، و 3 أيام بعد ShH10 حقن intravitreal أو بعد حقن intrapenile (الشكل 1). ويتم جمع حوالي 10-20 ميكرولتر في أنابيب الهيبارين. التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 بعد الانتهاء من هذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الجيني من عينات الدم باستخدام عدة استخراج اختيارك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء PCR التضخيم من الحمض النووي الجيني. لهذا البروتوكول استخدام الزوج التمهيدي التالية: GFP، بمعنى 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &quot;، العقاقير 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&quot;. تم تنفيذ برنامج PCR التالية: 95 ° C 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 ° C و 45 ثانية، 55 ° C 1 دقيقة، 72 ° C و 45 ثانية (30 دورات)؛ 72 ° C 5 دقائق (1 دورة)؛4 ° C الانتظار. </li></ol> 5. اختياري ايفانز الطريقة الأزرق ملاحظة: تحديد نفاذية الأوعية الدموية عن طريق قياس تسرب الزلال من الأوعية الدموية في شبكية العين باستخدام طريقة ايفانز الأزرق 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ايفانز الأزرق صبغ خلال انحلال في حل العادي المالحة (6 ملغ / مل)، صوتنة لمدة 5 دقائق في نظافة بالموجات فوق الصوتية، والترشيح من خلال 5 ميكرون التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران C57BL6J (الأيزوفلورين استنشاق، راجع الخطوة 4.1)، والتحقق من فقدان المنعكس التقويمي، منعكس الانسحاب واستجابة ذيل قرصة يشير إلى التخدير السليم، وحقن ايفانز الأزرق (45 ملغ / كلغ) عن طريق الوريد القضيب (الشكل 1). تأكد من أن الكفوف، كمامة، وآذان الفئران تصبح زرقاء بوضوح التالية ايفانز حقن الأزرق، مؤكدا امتصاص وتوزيع الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران C57BL6J 3 ساعة بعد حقن الصبغة مع الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) والتحقق من فقدان rightinز منعكس يشير إلى التخدير المناسب. عينة intracardially حوالي 500 ميكرولتر من الدم في أنابيب الهيبارين ويروي الفئران لمدة 2 دقيقة عبر البطين الأيسر مع العازلة سيترات (0.05 M، ودرجة الحموضة 3.5؛ حل 7.8 غرام من حمض الستريك و 3.8 غرام من سيترات الصوديوم في 1 لتر من الماء المقطر) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمنع تضيق الأوعية. وضحى الفئران عن طريق نضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نضح، استأصل وبعناية تشريح كلتا العينين تحت مجهر التشغيل لجمع شبكية العين (انظر القسم 3.2). شبكية العين الجافة في المبخر الطرد المركزي ليلة وضحاها، تزن، واستخراج صبغة زرقاء ايفانز التي يحتضنها شبكية العين مع 100 ميكرولتر من الفورماميد لمدة 18 ساعة على 65 درجة مئوية مع اهتزاز (100 x ج). عينات الطرد المركزي شبكية العين في 30K أنابيب مرشح أوميغا في 20،798.5 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية، وعينات الدم أجهزة الطرد المركزي في 20،798.5 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كل supernatants لقياس الامتصاصية. تحديد الامتصاصية من كل عينة عن طريق طرح أقصى الامتصاصية FOص ايفانز الأزرق في 620 نانومتر إلى الحد الأدنى الامتصاصية في 740 نانومتر. حساب ايفانز تركيز الأزرق في البلازما وشبكية العين من منحنى مستوى ايفانز الأزرق في الفورماميد. التعبير عن نفاذية BRB في ميكروليتر من ايفانز الأزرق في كل غرام من شبكية العين الجافة في الساعة (ميكرولتر بلازما / ز الشبكية بالوزن الجاف / ساعة). </li></ol> 6. اختياري فلوريسئين تصوير الأوعية الدموية ملاحظة: التسرب من الأوعية الدموية في شبكية العين في الفئران يمكن تصور عن طريق الحقن داخل الصفاق من فلوريسئين الصوديوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران C57BL6J (الأيزوفلورين استنشاق، راجع الخطوة 4.1) وتمدد التلاميذ مع قطرات العين (neosynephrine وmydriaticum). استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن داخل الصفاق 0.01-0.02 مل من 10٪ فلوريسئين الصوديوم في 0.1 مل ملحي معقم لتصوير الأوعية فلوريسئين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور من كلتا العينين بعد الحقن باستخدام كاميرا قاع العين. التضحية الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 بعد المواليالتعريف الشخصي إجراءات. ملاحظة: 20 ثانية ضرورية للسفن الشبكية لتصبح مرئية على الأوعية. الصور يجب أن يتم القبض بين 3-10 دقيقة كحد أقصى بعد حقن فلوريسئين. بقع التسرب (إذا كان موجودا) يمكن ملاحظتها بعد 2.5 دقيقة. في نقطة زمنية لاحقة يتم فقدان جودة الصورة بسبب فلوريسئين الصوديوم نزع فتيله في الصور زجاجي، وبالتالي الوحيدة التي تم الحصول عليها بعد فترة قصيرة تستخدم للتحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet,+an+increased+number+of+ganglion+cells,+and+aberrant+axonal+outgrowth.">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis.">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li><li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells.">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li><li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery.">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous.">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply.">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li><li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions:+basic+concepts,+clinical+features+and+management.">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li><li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina.">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li><li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue.">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li><li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus:+effects+of+viral+capsid+and+genome+size.">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye.">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li><li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery.">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li><li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells.">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).</li><li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers.">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313 (2007).</li><li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration.">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li><li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina.">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).</li><li>Benard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Quantifiable+Blood+Retinal+Barrier+Breakdown+Model+In+Mice.">A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice.</a> ARVO Annual Meeting. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وBRB ينظم تبادل الجزيئات بين الدم وشبكية العين. ويرتبط انهيارها يعانون من أمراض مختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). أظهرنا مؤخرا أنه في الدستروفين خروج المغلوب الماوس، والذي يعرض نفاذية BRB، تصبح الشبكية أكثر تساهلا لتوصيل الجينات بوس...

خلايا مولر هي العنصر الدبقية الرئيسي للشبكية العين. شكليا، فإنها تمتد شبكية العين شعاعيا وendfeet بهم، في اتصال مع الجسم الزجاجي، مواجهة ILM والمكونات السرية لهذه الأخيرة. وILM هو الغشاء القاعدي تتكون من حوالي عشرة مختلفة البروتينات المصفوفة خارج الخلية (laminin، أجرين AGRIN، perlecan، nidogen، والكولاجين والعديد من البروتيوغليكان كبريتات الهيبارين). خلال التنمية، وجودها لا غنى عنه لتكون الأنسجة الشبكية، والملاحة من المحاور البصرية، وبقاء خلايا العقدة 1-3. ومع ذلك، ILM هو غير اساسي في شبكية العين الكبار، ويمكن إزالتها جراحيا في بعض الأمراض دون التسبب في اضرار في شبكية العين 4. في العلاج الجيني، ويصبح هذا الغشاء حاجز مادي لالتنبيغ كفاءة شبكية العين باستخدام AAVs عن طريق الحقن intravitreal 5. من خلال تشجر واسعة من العمليات، وخلايا مولر توفر سوبو الغذائية والتنظيميRT إلى كل من الخلايا العصبية للشبكية وخلايا الأوعية الدموية. وتشارك خلايا مولر أيضا في تنظيم التوازن في شبكية العين، في تشكيل وصيانة BRB 6. منعطفات ضيقة بين الخلايا البطانية الشعرية الشبكية، مولر الخلايا، الخلايا النجمية وpericytes تشكل BRB. BRB يمنع بعض المواد من دخول retina.In أمراض كثيرة مثل اعتلال الشبكية السكري، وانسداد الوريد الشبكي وأمراض الجهاز التنفسي، ونقص الأكسجين لشبكية العين يسبب تسرب من خلال BRB 7-9. ويرتبط هذا التمزق مع زيادة في نفاذية الأوعية الدموية مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ، انفصال الشبكية وتلف شبكية العين. وترتبط خلايا مولر بإحكام مع الأوعية الدموية والغشاء القاعدي، ولعب دورا هاما في كل من BRB وILM النزاهة. ونتيجة لذلك، واصفة الخلايا الدبقية مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية لهذه الحواجز الشبكية. كلاسيكيحليف، ويقاس BRB النفاذية باستخدام الفحص الأزرق ايفانز تتكون من حقن النظامية ايفانز صبغة زرقاء، الذي يربط غير تساهميا لألبومين البلازما. ويقيس هذا الاختبار تسرب الزلال (البروتين من حجم متوسط، ~ 66 كيلو دالتون) من الأوعية الدموية في شبكية العين (انظر بروتوكولات القسم 5) 10. بدلا من ذلك، تسرب الأوعية الدموية يمكن تصور من قبل تصوير الأوعية مضان شبكية العين مما يدل على تسرب فلوريسئين (جزيء صغير، ~ 359 دا؛ انظر بروتوكولات القسم 6) 11. ومع ذلك، على حد سواء أساليب تسمح تقييم نفاذية BRB إلى جزيئات صغيرة والبروتينات لكنها لا توفر المعلومات حول سلامة ILM. وبالتالي، لدراسة BRB النفاذية، واستخدمنا طريقة مقرها AAV أن يعطي معلومات عن نفاذية BRB لجزيئات أكبر (على سبيل المثال، والجسيمات AAV، 25 قطرها نانومتر). في الواقع، يمكن أن أسلوبنا كشف عن وجود AAV التحوير في الدم، الأمر الذي من شأنه أن يوحي بأن ~ الجسيمات 25 نانومتر قطر من شأنهتكون قادرة على التسلل إلى مجرى الدم. يوفر هذا الأسلوب أيضا معلومات عن هيكل ILM والبروتينات المصفوفة خارج الخلية في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. حقن Subretinally، AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين والظهارة الصبغية 12 ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي في البرية من نوع شبكية العين مع ILM سليمة 5،13. ShH10 هو البديل AAV التي تم تصميمها خصيصا لاستهداف الخلايا الدبقية على الخلايا العصبية 14،15. ShH10 التسميات بشكل انتقائي خلايا مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة مع زيادة الكفاءة في شبكية العين مع الحواجز المعرضة للخطر (16). هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب immuhistochemistry وتحليل DNA الدم توفر معلومات عن حالة الحواجز الشبكية ومشاركتها في مرض (الشكل 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">C57BL6J mice strain</td>
			<td style="width:107px;">JANVIER LABS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:107px;">Virbac France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Xylazine Rompun 2%</td>
			<td style="width:107px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neosynephrine 5% Faure</td>
			<td style="width:107px;">Europhta</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Mydriaticum 0,5%</td>
			<td style="width:107px;">Thea</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sterdex</td>
			<td style="width:107px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Cryomatrix embedding resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Superfrost Plus Adhesion Slides</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-laminin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9393</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-rhodopsin clone 4D2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MABN15</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">anti-glutamine synthetase clone GS-6&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB302</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td>
			<td style="width:107px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">334</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">PNA Lectin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L32459</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Alexa fluor conjugated secondary antibodies&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorsave reagent</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">QIAmp DNA Micro Kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GoTaq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Evans Blue dye&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E2129&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">5 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sodium Citrate&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1909-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Formamide spectrophotometric&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">295876-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2456&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:225px;">Micron III</td>
			<td style="width:107px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:193px;">Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Insulin Syringes</td>
			<td style="width:107px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS30M3109&#160;</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe 10 &#181;l Hamilton</td>
			<td style="width:107px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">74487</td>
			<td>Seringue 1701</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Needle RN G33, 25 mm, PST 2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11530332</td>
			<td>Intravitreal Injection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">UltraMicroPump UMP3</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3</td>
			<td style="width:193px;">Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-1</td>
			<td>Digital controller</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">Binocular magnifier SZ76</td>
			<td style="width:107px;">ADVILAB</td>
			<td style="width:119px;">ADV-76B2</td>
			<td style="width:193px;">Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spring scissors straight - 8,5cm</td>
			<td rowspan="3" style="width:107px;">Bionic France S.a.r.l</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td rowspan="3" style="width:193px;">Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Micro-ciseaux de Vannas courbe</td>
			<td style="width:119px;">15004-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Pince Dumont 5</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Ultrasonic cleaner&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">G1125P1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Nanosep 30k omega tubes&#160;</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Speedvac</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SC 110 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spectrofluorometer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">TECAN&#160;</td>
			<td style="width:119px;">infinite M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using adeno-associated virus as a tool to study retinal barriers in disease

خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الرئيسية للشبكية العين. من نهاية أقدام تشكل حدود شبكية العين في الأغشية الحد الخارجي والداخلي (ILM)، وبالتزامن مع الخلايا النجمية، pericytes والخلايا البطانية التي وضع حاجز الدم في شبكية العين (BRB). BRB يحد من نقل المواد بين الدم وشبكية العين في حين يتصرف ILM باعتباره الغشاء القاعدي الذي يحدد تشريحيا الحدود بين شبكية العين وتجويف الجسم الزجاجي. وصفها خلايا مولر غير ذات أهمية خاصة لدراسة الحالة المادية للحواجز شبكية العين، وهذه الخلايا هي جزء لا يتجزأ من BRB وILM. وكثيرا ما غيرت كل من BRB وILM في مرض شبكية العين، وهي المسؤولة عن أعراض المرض. هناك عدة طرق راسخة لدراسة سلامة BRB، مثل فحص الأزرق ايفانز أو تصوير الأوعية فلوريسئين. لكن هذه الأساليب لا تقدم معلومات على مدى BRB نفاذية رس جزيئات أكبر، في نطاق نانومتر. وعلاوة على ذلك، فإنها لا تقدم معلومات عن حالة الحواجز الشبكية الأخرى مثل ILM. لدراسة BRB نفاذية جنبا إلى جنب مع شبكية العين ILM، استخدمنا طريقة مقرها AAV أن يقدم معلومات عن نفاذية BRB إلى الجزيئات الكبيرة في حين تشير إلى حالة ILM والمصفوفة خارج الخلية البروتينات في الحالات المرضية. الخيارين AAV مفيدة لهذه الدراسة: AAV5 وShH10. AAV5 لديه انتحاء الطبيعي لخلايا مستقبلة للضوء ولكن لا يمكن أن يحصل عبر لشبكية العين الخارجية عندما تدار في الجسم الزجاجي عندما ILM غير سليمة (أي في البرية من نوع شبكية العين). ShH10 لديه انتحاء قوي نحو الخلايا الدبقية، وسوف تسمية انتقائي الدبقية مولر في كل من شبكية العين السليمة والمريضة. ShH10 يوفر توصيل الجينات أكثر كفاءة في شبكية العين حيث تم اختراق ILM. تسلط هذه الأدوات الفيروسية إلى جانب المناعية و-DNA الدم تحليل الضوء على حالة الحواجز الشبكية في المرض.

ونحن نتوقع زيادة التنبيغ شبكية العين من مولر الخلايا الدبقية باستخدام ShH10 إذا يظهر نموذج حيواني الاضطرابات في هيكل ILM (الشكل 2A - B). على سبيل المثال، لقد أظهرنا أنه في غياب Dp71 والأهداف ShH10 وجه التحديد ولكن بشكل أكثر كفاءة الخلايا الدبقية مولر عن طريق ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease at JoVE.com

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

14.9K Views.  Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968. To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Video: Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

الطيفية Karyotyping إلى دراسة حالة شذوذ الكروموسومات في البشر والفئران مع مرض الكلى المتعدد الكيسات

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

العظام مناور العلاج كأداة مفيدة لمرافقة الالتهاب الرئوي

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

تصوير قاع العين كأداة ملائمة لدراسة الردود الأوعية الدموية الدقيقة في عوامل الخطر مرض القلب والأوعية الدموية في الدراسات الوبائية

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

التكيف Videofluoroscopic طرق دراسة السنونو الإنسان لكشف وتوصيف عسر البلع في نماذج الفئران الأمراض

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

باستخدام تصوير الشبكية لدراسة الخرف

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

مرتبطة بالغدة التسليم الفيروس بوساطة من كريسبر للجينات القلب التحرير في الفئران

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

The Dyspepsia Educational Tool As a Novel Aid in Dyspepsia Management

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from this development, as it enables patient engagement in self-management. Dyspepsia is a condition thought to arise from gastric and duodenal perturbations, brain-gut axis disturbances, and dietary factors. Behavioral interventions are a major part of dyspepsia treatment, hence patient engagement and motivation through education is essential. Protocols that describe the development process of such educational tools are scarce. We provide a methodology describing development of a dyspepsia educational tool. Assessment of users' needs is the first step, followed by a literature search. The content is developed based on the main themes and entered into a content management system, to build the program. Final adjustments are made after a pilot test of the tool. The presented protocol can be used as a guide for development of a digital dyspepsia educational tool or as a tool for similar situations.

This protocol describes the development process of a digital dyspepsia educational tool. Assessment of unmet needs and literature, content development, and building of the tool are presented. The methodology can be used as a guide for future development of digital educational tools.

أداة عسر الهضم التعليمية كمساعدة جديدة في إدارة عسر الهضم

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

الإعطاء تحت الملتحمة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة في نماذج الحيوانات الصغيرة

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...