مطلوب وضع العلامات على خلية واحدة وتصور العرش الشجيري أو المحوري لدراسة التشكل العصبي. من خلال وضع العلامات على العرش النامية بطريقة طفيفة التوغل ، تظل أنسجة الشبكية صحية ومناسبة للتصوير الحي البؤري لفترات طويلة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تصور العرش الفردي مع البروتينات الفلورية متعددة الألوان في غضون أربعة أيام بعد الحقن.
وهذا يجعل دراسة مورفولوجيا الشجرة الوليدية ممكنة. يمكن استخدام بروتوكول التصوير والتحليل بالحقن هذا لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية عبر الجهاز العصبي المركزي. يجب تحديد اختيار Cre المناسب وموقع الحقن لاستهداف مجموعة الخلايا ذات الاهتمام.
ابدأ باختيار خط ماوس Cre لتسمية مجموعات خلايا الشبكية ذات الاهتمام. الحصول على فيروس AAV المعتمد على المؤتلف ترميز البروتينات الفلورية. للحصول على أفضل وسم للعمليات الدقيقة ، حدد المتجهات التي تعبر عن البروتينات الفلورية المعدلة التي تستهدف غشاء البلازما.
ل AAV aliquot على الجليد ، وإعداد واحد إلى أربعة تخفيف AAV باستخدام محلول ملحي معقم أو PBS. لتصور الحقن ، لون المحلول باللون الأزرق عن طريق إضافة ميكرولتر واحد تقريبا من محلول صبغة FCF الأخضر السريع بنسبة 0.02٪ لكل 15 ميكرولتر من تخفيف AAV. تعقيم منطقة الحقن مع 70 ٪ من الإيثانول.
ردم الماصة الدقيقة بتخفيف AAV باستخدام حقنة دقيقة. تحت مجهر ستيريو ، قم بكسر طرف الماصة الدقيقة بإبرة قياس 30 لفك الحافة. بعد تخدير الفئران حديثي الولادة ، قم بوشم منصات مخالبها بحبر الوشم باستخدام إبرة قياس 30 لتحديد الحيوانات.
جمع قصاصات الذيل لعزل الحمض النووي والتنميط الجيني. مسحة الجلد فوق العينين مع 70٪ من الإيثانول. استخدم إبرة قياس 30 لفتح الجفن المنصهر أثناء تطبيق ضغط خفيف بالأصابع لفتح العين.
كز ثقب صغير من خلال القرنية عند تقاطع القرنية الصلبة. أدخل الماصة الزجاجية الدقيقة في الفتحة واضغط على دواسة قدم الحاقن الصغير مرتين إلى أربع مرات لحقن AAV في الفضاء داخل الجسم الزجاجي. قم بإزالة الماصة الدقيقة ببطء وتأكد من حقن AAV عن طريق تصور الصبغة الزرقاء في التلميذ.
بعد تحضير aCSF الشبكية كما هو موضح في مخطوطة النص ، قم بأكسجة aCSF الشبكية عن طريق الفقاعات مع الكاربوجين لمدة لا تقل عن 15 دقيقة ، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. قم بتضمين طبق بتري قطره 60 ملم في صينية ثلج واملأه ب aCSF الشبكية المؤكسج. ضع طبق بتري المملوء تحت مجهر ستيريو.
بعد ذلك ، قم بقطع رفرف الجفن للفأر الرحيم لفضح العين. استخدم ملقط حاد لاستئصال العينين ونقلهما إلى السائل الدماغي الشوكي البارد الموضوع تحت المجهر الاستريو. تحت المجهر الاستريو ، قم بتثبيت العين عن طريق ربط العصب البصري باستخدام ملقط Dumont رقم خمسة وكزة ثقب في وسط القرنية بإبرة قياس 30 ، ثم أدخل طرف واحد من المقص الدقيق في الثقب لإجراء شق من الثقب إلى نهاية القرنية.
كرر ذلك لعمل أربع شرائح في الاتجاهات الأساسية ، مما يؤدي إلى إنشاء أربع لوحات. أمسك واسحب اللفافتين المجاورتين بعيدا عن بعضهما البعض ، وقم بتقشير الصلبة بلطف من شبكية العين لجميع لوحات القرنية. ثم قم بإزالة العدسة من كوب الشبكية باستخدام الملقط.
أخيرا ، استخدم المقص الدقيق لإجراء أربعة شقوق شعاعية من حافة الشبكية باتجاه العصب البصري ، مما يخلق أربع بتلات متساوية. في حالة استخدام مرشحات غشاء MCE رمادية كبيرة القطر للتركيب ، فقم بقطع القرص إلى أرباع بعرض سنتيمتر واحد تقريبا ، ثم ضع قرص MCE في وسط ورقة ترشيح بيضاء أكبر. باستخدام فرشتي طلاء مقاس ثلاثة × صفر، اقلب كوبا واحدا من الشبكية على فرشاة طلاء مع وجود خلية العقدة الشبكية لأسفل.
ارفع شبكية العين بلطف من السائل الدماغي الشوكي ، مع التأكد من أن توتر الماء لا يمزق الشبكية. أثناء الاستمرار في إمساك فرشاة الطلاء بشبكية العين، حرك طبق بتري الذي يحتوي على aCSF بعيدا عن الطريق وضع ورقة الترشيح البيضاء مع غشاء MCE تحت المنظار. باستخدام ماصة نقل ، ضع قطرة من aCSF في وسط ورقة ترشيح MCE.
قم بتعويم شبكية العين في قطرة aCSF الناتجة عن التوتر السطحي وغشاء MCE المشحون. استخدم فرش الطلاء لوضع شبكية العين داخل القطرة مع جانب خلية العقدة الشبكية لأعلى، ثم افتح بتلات الأربعة. بمجرد وضعه ، قم بإنشاء جسر مائي بين فرشاة الطلاء وورق الترشيح الأبيض لكسر التوتر السطحي للقطرة.
قم بتجميع غرفة حضانة التصوير الحي واملأها ب aCSF المؤكسج. قم بتشغيل المضخة ووحدة التحكم في درجة الحرارة ، مع التأكد من أن درجة الحرارة لا ترتفع عن 34 درجة مئوية. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى ساعة حتى تستقر درجة حرارة الغرفة.
يوصى بإعداد غرفة الحضانة قبل البدء في تشريح الشبكية. تساعد درجة حرارة الغرفة المستقرة على تقليل انحراف العينة. لنقل تل الشبكية المسطح إلى غرفة التروية، أوقف المضخة وأزل السائل الدماغي الشوكي الموجود في الغرفة.
ثم ضع قرص MCE مع حامل الشبكية المسطح في غرفة الحضانة. قم بترطيب وزن العينة مسبقا لكسر التوتر السطحي ، ثم ضعه على الحامل المسطح لضمان وضع وزن العينة على ورق MCE لتقليل انحراف العينة. أعد ملء الغرفة ب aCSF الدافئ وقم بتدوير aCSF بسرعة ملليلتر واحد تقريبا في الدقيقة.
ضع قطعة الأنف مع هدف غمس الماء 25 مرة في غرفة التصوير. قم بفحص الخلايا المصنفة ذات الأهمية باستخدام الضوء epifluorescent ، واضبط حجم التصوير لالتقاط الميزات المتغصنة ذات الاهتمام. باستخدام جدول بحث يحدد كلا من البيكسلات المشبعة وغير المشبعة، اضبط طاقة الليزر بحيث لا تكون البيكسلات مشبعة.
الحصول على حجم التصوير 3D وتكرار الاستحواذ بمعدل الإطار المطلوب. يمكن ضبط حجم التصوير بين كل نقطة زمنية للتعويض عن انحراف العينة. استيراد سلسلة الصور، وتقسيم الصور حسب الوقت.
احفظ جميع النقاط الزمنية يدويا أو عن طريق تشغيل مكون إضافي ماكرو. قم بإنشاء دالة انتشار نقطة نظرية باستخدام المكون الإضافي ImageJ بالنقر فوق Defraction PSF 3D ، وفتحة العددية للعدسة ، والطول الموجي لانبعاث الفلوروفور ، وحجم البكسل ، وتباعد Z مطلوبة لإنشاء PSF دقيق. حدد المكونات الإضافية ووحدات الماكرو وقم بالتشغيل لإجراء إزالة الالتفاف التكراري المتوازي للدفعة لجميع النقاط الزمنية باستخدام الماكرو المقدم.
قم باستيراد جميع النقاط الزمنية غير المعقدة كمكدس بالنقر فوق ملف أو استيراد أو تسلسل صورة. قم بتحويل المكدس إلى مكدس تشعبي بالنقر فوق صورة، مكدسات تشعبية، ثم مكدسات إلى مكدس تشعبي. أضف عدد شرائح Z والأطر الزمنية ، ثم صحح الانجراف 3D باستخدام المكون الإضافي الصحيح 3D drift.
احفظ المكدس التشعبي المصحح للانجراف 3D وقم بتحويل الصورة مرة أخرى إلى مكدس عادي بالنقر فوق الصورة ، و hyperstacks ، و hyperstack إلى مكدس ، ثم تقسيم النقاط الزمنية بالنقر فوق الصورة ، المكدسات ، الأدوات ، و مكدسات الخائن. بالنسبة لعدد المكدسات الفرعية المراد تقسيمها، أدخل عدد النقاط الزمنية. استخدم معالجة الدفعات لإنشاء عرض أقصى لجميع النقاط الزمنية.
قم باستيراد تسلسل صور الفاصل الزمني بالنقر فوق ملف، استيراد، ثم تسلسل صورة. واستخدام أدوات ImageJ التقليدية للتحليل المطلوب للفيديو ثنائي الأبعاد غير المعقد والمعالج بعد المعالجة ، تم الحصول على فيديو ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لتطوير تشعبات خلايا الانفجار النجمي ، وتفكيكها ، وتصحيحها للانجراف 3D. تم إنتاج إسقاطات قصوى على مستوى Z لإنشاء مقاطع فيديو 2D للتحليل ، تظهر منطقة من الصقل الشجيري ومنطقة من النمو الشجيري.
3D deconvolution من كل نقطة زمنية زادت من دقة توقعات filopodia الدقيقة من خلية أماكرين P6 Starburst واحدة قبل وبعد إزالة الالتفاف مع ImageJ. فترات العدوى AAV المطولة لا تؤدي بالضرورة إلى زيادة إشارة الفلورسنت كما هو موضح في مستويات مماثلة من التعبير عن البروتين في خمسة و 11 يوما بعد الحقن. يعد تقليل انحراف العينة أثناء التصوير أمرا مهما.
يتم تقليل الانجراف إلى الحد الأدنى من خلال الحفاظ على درجة حرارة تصوير ثابتة وتحديد موقع الوزن على العينة بشكل مناسب. في حالة حدوث انحراف ، يسمح الاكتساب اليدوي للسلسلة الزمنية بضبط حجم التصوير بين الإطارات. وهذا يضمن بقاء ميزات الاهتمام في الإطار.
ينتج هذا البروتوكول مقاطع فيديو 3D عالية الدقة وخالية من التعقيد وتصحيح الانجراف لتطوير الخلايا العصبية. تؤدي مقاطع الفيديو هذه إلى فهم أفضل لأسلاك الخلايا العصبية وهي مطلوبة لتطوير طرق التحليل الحسابي للتشكل 3D. هناك حاجة إلى برامج تتبع وتتبع تلقائية أفضل لتحقيق تحليل عالي الإنتاجية لتطوير الخلايا العصبية.
