We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and M&#233;lissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to St&#233;phane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.

כל בעלי החיים ששמשו במחקר זה טופלו ויטופלו בהתאם להצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון. 1. הפקת רקומביננטי AAV (rAAV) על ידי חלוף Transfection של HEK-293 תאים 17,18 הערה: ראה מקלור C, יופיטר (2011) 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר הכנת פלסמיד בקנה מידה גדולה (מ&quot;ג לפחות 1 / מיליליטר) של פלסמידים וקטור AAV. השתמש 3 פלסמידים. פלסמיד עוזר AAV נושא את הגנים השכפול וקפסיד ללא המסוף ההפוך AAV חוזר ITRS, קלטת ביטוי transgene ביצוע ITR AAV מכונה פלסמיד ההעברה, ופלסמיד אספקת גני עוזר אדנווירוס E2, E4, וגני VA RNA מצוינים כלpHELPER. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 293 תאים עם 3 פלסמידים אלה באמצעות polyethyleneimine (או מגיב transfection אחר). מעל 80% מיעילות transfection הוא הכרחי לvi הטובתשואות RAL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר AAV רקומביננטי מ293 lysates תא בשיפוע iodixanol. 15%, 25%, 40%, וiodixanol 60% משמש להשגת השיפוע. לאסוף 40% חלק iodixanol המכיל חלקיקי AAV, לרכז את החלק לאחר ultracentrifugation ב500,000 XG במשך שעה וחיץ תמורת 1 נגד PBS (נאגר מלוח פוספט) עם 0.001% pluronic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע כייל הגנומי נגיפי 20, לבצע ProteinaseK לעכל DNAse אחרי QPCR. פריימרים קדימה הפוך להגביר את אזור 62 נ&quot;ב ממוקם בITR AAV2. לסטנדרטי פלסמיד, החללית שכותרתו עם FAM ויש לו חור שחור מרווה (BHQ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע qPCR (תגובת השרשרת של פולימראז כמותי) בנפח סופי של 25 μl באמצעות 340 ננומטר לאחור תחל ITR, פריימר ITR קדימה 100 ננומטר, 100 ננומטר בדיקה AAV2 ITR, 0.4 מ&quot;מ dNTPs, 2 מ&quot;מ MgCl2, 1x פלטינום תקי מאגר, 1U פלטינום תבנית תקי ו -5 μl (סטנדרטי, מדגם ואין שליטת תבנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסטנדרטי, השתמש בפלסמיד לtransfection ב7 x 10-לקפל דילולים סדרתי (5 μl כל אחד מ2 x 10 x 9 עד 2 10 3 הגנום מיליליטר / וכתוצאה מכך ריכוז סופי מאוקטובר 10-אפריל 10 הגנום מיליליטר /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את התכנית על ידי צעד denaturation ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואחריו 40 מחזורים של denaturation בב 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות וחישול / סיומת ב 60 ° C 1 דקות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח קצר או ב -20 ° C לתקופות ארוכות אחסון. </li></ol> 2. הזרקת תוך של AAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J עם קטמין (50 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן ליישר רפלקס, תגובת רפלקס הנסיגה וקמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה. להתרחב תלמידים על ידי יישום של קרנית של 5% neosynephrine וmydriaticum 0.5% בטיפי עיניים. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור disposab G ultrafine 30מחט le דרך הקו המשווה ובסמוך לימבוס, לתוך חלל הזגוגית (ראה צ&#39;יו K, יופיטר (2007) 21). הזרק מניות μl 1 מכילות 1 עד 4 x 10 11 סמנכ&quot;ל ShH10-GFP או AAV5-GFP עם תצפית ישירה של המחט במרכז חלל הזגוגית (איור 1). השתמש בעין אחת כביקורת על ניסויי ILM. להזריק את שני העיניים לניסויי BRB. החל טיפול מקומי נוגד דלקת ואנטי-בקטריאלי על עיניים מוזרקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחב תלמידים עם neosynephrine וטיפות עיני mydriaticum להדמיה. לבצע בדיקות קרקעית עין עם מצלמה קרקעית העין לעקוב GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) ביטוי שבוע 1, 2 שבועות, 1 חודש, ו -2 חודשים לאחר הזרקת תוך (איור 1). להקריב את עכברי משאיפת CO 2 1-2 חודשים לאחר הזרקה. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcryosections רשתית (איור 1), לנתח את עיני enucleated להסיר lתיקון ENS וקרנית, והטבילה בparaformaldehyde 4% עבור שעה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect עיניים קבועות בעבר בסוכרוז 10% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, סוכרוז 20% עבור שעות נוספות בטמפרטורת חדר. Cryoprotect בתמיסת סוכרוז 30%, הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. להקפיא ולהטביע eyecups בהטבעת שרף כגון קריו מטריצה. הפוך 10 מיקרומטר cryosections והר בשקופיות טיפול מיוחד לקטעי רקמה קפוא ושתשפר את דבקות רקמות במהלך צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize חלקים עם 0.1% X100 טריטון בPBS pH 7.4 למשך 5 דקות. לשטוף 2x בPBS ולחסום עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר בPBS עם BSA 1%, 0.1% Tween 20. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לflatmounts רשתית (איור 1), לתקן את עיני enucleated בparaformaldehyde 4% במשך 15 דקות כדי להקל על הנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב15-30 דקות, לנתח את העיניים כדי להסיר את הקרנית ועדשה. הפרד את הרשתית מאפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) ולובן העין על ידי חיתוך סביב serrata אורה ועצב הראייה. לטבול בparaformaldehyde 4% למשך 30 דקות נוספות כדי לתקן את הרשתית וחלבון פלואורסצנטי בתאי רשתית transduced (קיבעון לא יעלה על 24 שעות). לשטוף 5 דקות בPBS סטרילי, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את PBS לחיץ חסימה (PBS עם BSA 1%, 2% עזים נורמלי או חמור בדם, 0.5% Triton X-100), ודגירה בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות עם נוגדנים עיקריים בחסימת מאגר לאו 4 שעות בטמפרטורת חדר או 4 ° C למשך הלילה. 3x לשטוף עם PBS. הערה: הנוגדנים המשמשים הם כדלקמן: אנטי laminin (1/1000), 4D2 (1/500) מוטות תיוג, שיבוט synthetase אנטי-גלוטמין GS-6 (1/1500) תאי תיוג ILM שיבוט אנטי-רודופסין תיוג Müller , PNA קטינים (1/40) תיוג קונוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות עם 1: 500 דילול של נוגדנים משני מצומדות פלואוריד Alexa חסימת חיץ במשך שעה 1 (cryosections) או 2 שעות (flatmounts) בטמפה החדרrature ומוגן מפני אור. 3x לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתכים להקלה לרשתית וflatmount זה על גבי זכוכית עם שני קולטי האור או צד תא הגנגליון ברשתית (RGC) יפנו כלפי מעלה. להוסיף mountingmedium המימי, להחיל coverslip ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיקרוסקופיה confocal על מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה. לרכוש ברצף תמונות, שורה אחרת שורה, כדי להפחית את העירור והפליטה crosstalk. להגדיר את גודל צעד על פי תורת הדגימה. השתמש בהגדרות חשיפה שלמזער פיקסלים oversaturated בתמונות הסופיות. תמונות תהליך 12-bit עם פיג&#39;י, Z-סעיפי פרויקט על מטוס בודד באמצעות עוצמה מקסימלית תחת Z-פרויקט פונקציה ולבסוף להמיר 8 סיביות מצב צבע RGB. </li></ol> 4. ניתוח PCR של דגימות דם עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 מניות μl המכילות 1 עד 4 x 10 11 חלקיקים של AAV-GFP לוריד הפין של עכברים מורדמים C57BL6J (5% מisofluraneלזירוז בתא קרוב ו -2.5% מisoflurane באמצעות חרטומו במהלך ניתוח) באמצעות מזרק אינסולין עם מחט 6 מ&quot;מ עדין במיוחד. בעלי חיים זה ישמשו כביקורת חיובית של מחזורי חלקיקי AAV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם מדגם מזנב עכבר לפני ההזרקה ו -3 שעות, 24 שעות, 2 ימים, ו -3 ימים לאחר הזרקת תוך ShH10 או לאחר הזרקת intrapenile (איור 1). על 10-20 μl נאסף בצינורות הפרין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר השלמת ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מדגימות דם באמצעות ערכת החילוץ על פי בחירתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הגברה PCR של DNA גנומי. לפרוטוקול זה משתמש בזוג פריימר הבא: GFP, לחוש 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &quot;, antisense 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&quot;. תכנית ה- PCR הבאה בוצעה: 95 ° C 2 דקות (מחזור 1); 95 ° C 45 שניות, 1 דקות 55 ° C, 72 ° C שניות 45 (30 מחזורים); 72 ° C 5 דקות (מחזור 1);4 ° C אחיזה. </li></ol> 5. אופציונאלי אוונס הכחול שיטה הערה: לכמת חדירות כלי דם על ידי מדידת דליפת אלבומין מכלי דם לרשתית בשיטה הכחולה אוונס 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צבע הכחול אוונס על ידי פירוק בפתרון נורמלי מלוח (6 מ&quot;ג / מיליליטר), sonication במשך 5 דקות בשואב קולי, וסינון באמצעות מסנן 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1), לבדוק את אובדן ליישר רפלקס, רפלקס הנסיגה ותגובת קמצוץ הזנב מצביעה הרדמה מתאימה, ולהזריק אוונס כחול (45 מ&quot;ג / קילוגרם) דרך וריד הפין (איור 1). בדוק שכפות, לוע, ואוזניים של העכברים להיות ברור כחולות לאחר הזרקה כחולה אוונס, המאשרים את הספיגה והפצה של הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J 3 שעות לאחר ההזרקה של הצבע עם קטמין (50 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאמת את אובדן righting רפלקס המצביע על הרדמה מתאימה. לדוגמא intracardially כ -500 μl דם בצינורות הפרין ותנקב עכברים למשך 2 דקות באמצעות החדר השמאלי עם חיץ ציטרט (0.05 M, pH 3.5; לפזר 7.8 גרם של חומצת לימון ו -3.8 גרם של נתרן ציטרט בL 1 של מים מזוקקים) טרום חימם עד 37 ° C כדי למנוע התכווצות כלי דם. עכברים הקריבו באמצעות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף, enucleate ובזהירות לנתח את שני העיניים תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לאסוף את הרשתית (ראה סעיף 3.2). רשתית יבש במאייד צנטריפוגלי הלילה, לשקול, ולחלץ את הצבע הכחול אוונס ידי דוגרים רשתית עם של פוראמיד 100 μl במשך 18 שעות על 65 מעלות צלזיוס עם הרועד (100 XG). דגימות רשתית צנטריפוגה ב30K צינורות מסנן אומגה ב20,798.5 XG לשעה 2 ב 4 ° C ודגימות דם צנטריפוגות ב20,798.5 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשתי supernatants למדוד הספיגה. לקבוע הספיגה של כל דגימה על ידי הפחתת הספיגה המקסימלי for אוונס הכחול ב620 nm למינימום הספיגה ב 740 ננומטר. חישוב ריכוז הכחול אוונס בפלזמה ורשתית מעקומה סטנדרטית של אוונס הכחול בפוראמיד. הגעה חדירות BRB בmicroliter של אוונס כחול לגרם של רשתית יבשה לשעה (μl hr / פלזמה / g רשתית wt היבש). </li></ol> 6. אופציונאלי ההעמסה אנגיוגרפיה הערה: דליפה מכלי דם ברשתית בעכברים ניתן דמיינה ידי הזרקת intraperitoneal של והעמסת נתרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי C57BL6J (שאיפת isoflurane, ראה שלב 4.1) ולהתרחב תלמידים עם טיפות עיניים (neosynephrine וmydriaticum). השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally .01-0.02 מיליליטר של 10% והעמסת נתרן בתמיסת מלח סטרילית 0.1 מיליליטר לאנגיוגרפיה והעמסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של שני העיניים לאחר הזרקה באמצעות מצלמה קרקעית העין. להקריב את עכברי משאיפת CO 2 לאחר פרוcedure. הערה: 20 שניות נחוצות לכלי הרשתית להיות גלויים על אנגיוגרפיה. תמונות צריכים להיות בשבי בין 3-10 דקות לכל היותר לאחר הזרקה והעמסת. כתמי הדליפה (אם קיימים) ניתנים לצפייה לאחר 2.5 דקות. בנקודות זמן מאוחר יותר את איכות התמונה הולכת לאיבוד בשל העמסת נתרן לשדר לתמונות זגוגית, ובכך רק זמן קצר לאחר שהושגו משמשים לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet,+an+increased+number+of+ganglion+cells,+and+aberrant+axonal+outgrowth.">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis.">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li><li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells.">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li><li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery.">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li><li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous.">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li><li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li><li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply.">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li><li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions:+basic+concepts,+clinical+features+and+management.">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li><li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina.">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li><li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue.">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li><li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus:+effects+of+viral+capsid+and+genome+size.">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye.">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li><li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery.">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li><li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells.">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).</li><li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers.">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li><li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use.">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313 (2007).</li><li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration.">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li><li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina.">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).</li><li>Benard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Quantifiable+Blood+Retinal+Barrier+Breakdown+Model+In+Mice.">A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice.</a> ARVO Annual Meeting. , (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BRB מסדיר את חילופי מולקולות בין הדם לרשתית. התמוטטותה קשורה למחלות שונות כגון רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD). לאחרונה הראו כי בעכבר דיסטרופין נוק-אאוט, אשר מציג BRB החדיר, הרשתית הופכת להיות יותר מתירנית למסירת הגן בתיווכו של וקטורי adeno הקשורים ויראל?...

תאי מולר הם המרכיב העיקרי גליה של הרשתית. מורפולוגית, הם משתרעים על פני רשתית רדיאלית וendfeet, במגע עם הזגוגית, להתמודד ILM ורכיבים סודיים של זה האחרון. ILM הוא קרום במרתף מורכב מעשרה חלבונים שונים תאיים מטריצה ​​(laminin, Agrin, perlecan, nidogen, קולגן וכמה proteoglycans סולפט הפרין). במהלך פיתוח, הנוכחות שלה היא הכרחית עבור histogenesis רשתית, ניווט של אקסונים האופטיים, והישרדות של תאי הגנגליון 1-3. עם זאת, ILM הוא בלתי חיוני ברשתית מבוגרת וניתן להסיר בניתוח בפתולוגיות מסוימות מבלי לגרום לניזק לרשתית 4. בריפוי גנטי, קרום זה הופך להיות מכשול פיזי לתמרה יעילה של הרשתית באמצעות AAVs על ידי הזרקת תוך 5. דרך arborization הנרחב של התהליכים שלהם, תאי מולר לספק suppo התזונתי והרגולציהrt לשני נוירונים ברשתית ותאי כלי דם. תאי מולר מעורבים גם בוויסות של הומאוסטזיס ברשתית, בהקמה והתחזוקה של BRB 6. צמתים הדוקים בין תאי האנדותל נימי רשתית, תאי מולר, האסטרוציטים וpericytes יוצרים BRB. BRB מונע מחומרים מסוימים מלהיכנס למחלות רבות כמו retina.In רטינופתיה סוכרתית, חסימת וריד רשתית ומחלות בדרכי הנשימה, חוסר חמצן של הרשתית גורם לדליפה באמצעות 7-9 BRB. קרע זה קשור לעלייה בחדירות כלי דם שמובילה לבצקת vasogenic, היפרדות רשתית ופגיעה ברשתית. תאי מולר קשורים באופן הדוק עם כלי דם והקרום במרתף, ששיחקו תפקיד חשוב בשתי יושרת BRB וILM. כתוצאה מכך, תיוג תאי גליה מולר הוא רלוונטי במיוחד למחקר של המצב הפיזי של מחסומי רשתית אלה. קלאסיברית, חדירות BRB נמדדות באמצעות assay הכחול אוונס המורכב מהזרקה המערכתית של צבע הכחול אוונס, אשר נקשר אינה קוולנטית לאלבומין פלזמה. assay זה מודד את דליפת אלבומין (חלבון בגודל ביניים, ~ 66 KDA) מכלי דם לתוך הרשתית (ראה פרוטוקולי סעיף 5) 10. לחלופין, הדליפה של כלי הדם ניתן דמיינה ידי אנגיוגרפיה הקרינה רשתית המעידה על דליפה של העמסה (מולקולה קטנה, ~ 359 Da; ראה סעיף פרוטוקולים 6) 11. עם זאת, בשתי השיטות מאפשרות הערכה של חדירות BRB למולקולות קטנות וחלבונים אבל הם לא מספקים מידע על יושר ILM. לפיכך, ללמוד חדירות BRB, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שנותנת מידע על חדירות BRB למולקולות גדולות יותר (חלקיקי AAV למשל,, 25 בקוטר ננומטר). ואכן, השיטה שלנו יכולה לזהות נוכחות של transgene AAV בדם, שהייתי מציעה ש~ חלקיקי 25 ננומטר קוטר הייתתוכל לחדור לזרם הדם. שיטה זו גם מספקת מידע על המבנה של ILM וחלבוני מטריצה ​​תאיים במצבים פתולוגיים. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. הזריק Subretinally, יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטניים אור ואפיתל הפיגמנט ברשתית 12 אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהלים לתוך הזגוגית ברשתית wild-type עם ILM שלם 5,13. ShH10 היא גרסת AAV שתוכנן במיוחד כדי למקד את תאי גלייה על נוירונים 14,15. ShH10 סלקטיבי תוויות בתאי מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה עם התייעלות ברשתית עם מחסומים נפרצו 16. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם immuhistochemistry ובדיקות הדם-DNA לספק מידע על מצבם של חסמי רשתית ומעורבותם במחלה (איור 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">C57BL6J mice strain</td>
			<td style="width:107px;">JANVIER LABS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:107px;">Virbac France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Xylazine Rompun 2%</td>
			<td style="width:107px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neosynephrine 5% Faure</td>
			<td style="width:107px;">Europhta</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Mydriaticum 0,5%</td>
			<td style="width:107px;">Thea</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sterdex</td>
			<td style="width:107px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Cryomatrix embedding resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Superfrost Plus Adhesion Slides</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-laminin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9393</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-rhodopsin clone 4D2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MABN15</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">anti-glutamine synthetase clone GS-6&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB302</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td>
			<td style="width:107px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">334</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">PNA Lectin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L32459</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Alexa fluor conjugated secondary antibodies&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorsave reagent</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">QIAmp DNA Micro Kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GoTaq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Evans Blue dye&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E2129&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">5 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sodium Citrate&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1909-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Formamide spectrophotometric&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">295876-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2456&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:225px;">Micron III</td>
			<td style="width:107px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:193px;">Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Insulin Syringes</td>
			<td style="width:107px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS30M3109&#160;</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe 10 &#181;l Hamilton</td>
			<td style="width:107px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">74487</td>
			<td>Seringue 1701</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Needle RN G33, 25 mm, PST 2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11530332</td>
			<td>Intravitreal Injection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">UltraMicroPump UMP3</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3</td>
			<td style="width:193px;">Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-1</td>
			<td>Digital controller</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">Binocular magnifier SZ76</td>
			<td style="width:107px;">ADVILAB</td>
			<td style="width:119px;">ADV-76B2</td>
			<td style="width:193px;">Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spring scissors straight - 8,5cm</td>
			<td rowspan="3" style="width:107px;">Bionic France S.a.r.l</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td rowspan="3" style="width:193px;">Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Micro-ciseaux de Vannas courbe</td>
			<td style="width:119px;">15004-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Pince Dumont 5</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Ultrasonic cleaner&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">G1125P1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Nanosep 30k omega tubes&#160;</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Speedvac</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SC 110 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spectrofluorometer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">TECAN&#160;</td>
			<td style="width:119px;">infinite M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using adeno-associated virus as a tool to study retinal barriers in disease

תאי מולר הם תאי גליה העיקריים של הרשתית. קצה רגליהם יוצרות את הגבולות של הרשתית בקרומים החיצוניים ופנימיים הגבלה (ILM), ובשיתוף עם האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל הם מקימים את מחסום הדם-רשתית (BRB). BRB מגביל תחבורה מהותית בין זרם הדם והרשתית תוך ILM פועל כקרום במרתף שמגדיר בהיסטולוגיה גבול בין הרשתית וזגוגית החלל. תיוג תאי מולר הוא רלוונטי במיוחד כדי ללמוד את מצבו הפיזי של המחסומים ברשתית, תאים אלה הם חלק בלתי נפרד מBRB וILM. שני BRB וILM לעתים קרובות שינו במחלת רשתית ואחראי לתסמיני מחלה. ישנן מספר שיטות מבוססות היטב ללמוד על שלמות BRB, כגון assay הכחול אוונס או אנגיוגרפיה והעמסת. עם זאת שיטות אלה אינן מספקים מידע על המידה של t חדירות BRBo מולקולות גדולות יותר, בטווח ננומטר. יתר על כן, הם אינם מספקים מידע על מצבם של חסמים אחרים ברשתית כגון ILM. ללמוד חדירות BRB צד ILM רשתית, השתמשנו בשיטה המבוססת AAV שמספקת מידע על חדירות של BRB למולקולות גדולות יותר תוך ציון המצב של חלבוני ILM ומטריצת חוץ-תאית במצבי מחלה. שתי גרסאות AAV שימושיות למחקר כזה: AAV5 וShH10. יש AAV5 כמיהות טבעיות לקולטני אור, אבל זה לא יכול להעביר לרשתית החיצונית כאשר מנוהל לתוך הזגוגית כאשר ILM הוא שלם (כלומר, ברשתית wild-type). יש ShH10 כמיהות חזקות לתאי גלייה וסלקטיבי תווית גליה מולר בשתי רשתיות בריאים וחולה. ShH10 מספק מסירת גן יעילה יותר ברשתית שבו ILM נפגעת. כלים הנגיפיים אלה בשילוב עם ניתוח אימונוהיסטוכימיה והדם-DNA לשפוך אור על מצבם של חסמי רשתית במחלה.

אנו מצפים לתמרת רשתית של תאי גליה מולר באמצעות ShH10 אם מודל החיה מראה הפרעות במבנה של ILM (איור 2 א - ב). לדוגמא, הראינו כי בהעדר Dp71, מטרות ShH10 במיוחד אבל בצורה יעילה יותר Müller תאי גלייה ידי הזרקת תוך, המצביעים על חדירות מוגברות של ILM בקו העכבר הזה בהשוואה לע?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease at JoVE.com

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

14.9K Views.  Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968. To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Video: Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

מניפולטיבי טיפול אוסטיאופתי ככלי משלים שימושי עבור דלקת ריאות

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

צילום קרקעית העין ככלי נוח ללמוד תגובות כלי הדם לגורמי סיכון קרדיווסקולריים מחלות באפידמיולוגיים לימודים

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

התאמת שיטות סנונית Videofluoroscopic אדם מחקר כדי לזהות ולאפיין בליעה במודלי Murine מחלות

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

באמצעות הדמיה ברשתית ללמוד דמנציה

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

The Dyspepsia Educational Tool As a Novel Aid in Dyspepsia Management

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from this development, as it enables patient engagement in self-management. Dyspepsia is a condition thought to arise from gastric and duodenal perturbations, brain-gut axis disturbances, and dietary factors. Behavioral interventions are a major part of dyspepsia treatment, hence patient engagement and motivation through education is essential. Protocols that describe the development process of such educational tools are scarce. We provide a methodology describing development of a dyspepsia educational tool. Assessment of users' needs is the first step, followed by a literature search. The content is developed based on the main themes and entered into a content management system, to build the program. Final adjustments are made after a pilot test of the tool. The presented protocol can be used as a guide for development of a digital dyspepsia educational tool or as a tool for similar situations.

This protocol describes the development process of a digital dyspepsia educational tool. Assessment of unmet needs and literature, content development, and building of the tool are presented. The methodology can be used as a guide for future development of digital educational tools.

הכלי החינוכי לדיספיסיה כסיוע הרומן בניהול דיסספסיה

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

מתן תת-לחמית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו במודלים של בעלי חיים קטנים

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...