This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الاسم هو الفحص الذي يسمح لتقييم بسرعة تثبيط النشاط كوصي من البروتين قفيصة منواة من HIV-1، هدفا للاهتمام في البحث عن أدوية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. NC anneals سريع في درجة حرارة الغرفة والأحماض النووية التي لولاها لتمسخ الحراري في درجة حرارة عالية تليها الصلب الدقيق للطي مستقر. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع أي من كامل طول NC أو مع اقتطاع (12-55) NC: في كلتا الحالتين هي صلب اثنين من الأحماض النووية (RNA ونسخة من DNA التكميلية) بسرعة. وهذا يتفق مع الملاحظة الأدب مع NC الببتيد اقتطاع: يبدأ الصلب من قبل ذوبان كفاءة تنبع من cTAR تليها تفاعل حلقة قمية المكملة له، وهو ضعيف الموقع ملزمة NC، مع تسلسل تكميلية من TAR حلقة قمية، تنتهي خلال عدة سيطة غير مستقرة إلى هجين صلب الموسعة. 21 NC هو البروتوكول الاضافي مستقرة جداعين وبعض المشاكل أثناء أداء الاسم يمكن ان تحدث. من المهم جدا ولكن لإضافة SDS تقدم طازجة في تحميل جل المستخدمة العازلة لوقف رد الفعل: إذا كان هذا لم يتحقق، فإن جل لا تظهر عصابات الحمض النووي في المواضع الصحيحة. في الواقع، NC هو حمض ملزمة البروتين النووي، بحيث لتصور بشكل صحيح TAR / cTAR مضاعف متغاير من قبل الكهربائي للهلام SDS يجب أن تكون موجودة في جل للتحميل العازلة لتفسد البروتين والافراج عنها من مجمعها ضيق مع الأحماض النووية. وهذا هو أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة، أي تشكيل عصابات تحولت خلال الفترة السابقة هلام. هذا التأثير واضحا بشكل خاص عندما كان يعمل على كامل طول NC، كما في الشكل 2، ويرتبط وجود الذيل N-محطة الأساسي للغاية، وجود تأثير لتجميع قوي على الأحماض النووية. وجود الذيل الأساسي محطة يجعل رد الفعل الصلب أكثر صعوبة أن يكون مستعمل، كما تظهرن في الشكل (3) باستخدام مركب 1، خيوط intercalator التمثيلية، أي بزيادة intercalator درجة من الكفاءة خاصة في استقرار الهياكل الجذعية حلقة من القطران وcTAR. في الواقع، يفضل هذا النوع من التفاعل مع الأحماض النووية عندما الانتفاخات والحلقات يقطع استمرارية الحلزون المزدوج، مما يسمح للخيوط أسهل من بدائل ضخمة في أزواج قاعدة. استقرار TAR وcTAR من قبل هذه المجلدات الحمض النووي تم تحليلها من قبل تحديد الزيادة في درجة حرارة انصهار من [أليغنوكليوتيد اثنين (14). وعلاوة على ذلك، فإن الزيادة في درجة حرارة انصهار يرتبط مع تثبيط الصلب يحفزه HIV-1 NC، مما أدى إلى تشكيل المخفضة للTAR مضاعف متغاير / cTAR ومما يدل على أن intercalators خيوط هي فئة مثيرة للاهتمام من لدنة لهياكل ديناميكية من RNA مثل عنصر TAR 14 آلية عمل لجأت لهذه كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي يمكن التحقق من صحة أبعد عن طريق إجراء فحص الاسم في صيغ بديلة مختلفة، كما هو مبين في الشكل (4): في حالة intercalators تتعزز تثبيط مضاعف متغاير صلب عند المحتضنة المخدرات مع اثنين من oligos مطوية. المركبات التي تعمل مع آلية مختلفة للعمل، مثل المواد اللاصقة مباشرة من البروتين NC، ستكون أقل تأثرا وضع حضن مسبق مختلف. اسم الفحص التي أجريت في طريقتين بالتالي يمكن أن تستخدم لفحص المكتبات من المركبات لتحديد مثبطات NC، وكذلك لتقييم آلية المفترضة عمل يضرب إيجابية أثناء البحث عن العقاقير المضادة للفيروس نقص المناعة البشرية تستهدف NC. ومن الواضح أن استخدام هذه التقنيات وحدها عند المطالبة بالتعويض عن آلية عمل محددة من مثبطات NC حددت ليست كافية، وهناك حاجة أخرى فحوصات الكيمياء الحيوية المناسبة للحفاظ على فرضية العمل (14). وأخيرا، فإنه يجب التأكيد على أن الاسم يستخدم للغايةالانزيمات المنقى، إما المؤتلف أو الاصطناعية، وإعطاء المعلومات الثمينة على &quot;في المختبر&quot; تثبيط NC بواسطة مركبات اخضعت للاختبار. هذا هو &quot;القوة والضعف&quot; للمقايسة: الاسم يمكن أن تكمل أيضا فحص الظاهري ونهج النمذجة الجزيئية في الخطوات الأولية لبرامج اكتشاف الأدوية، مما يتيح لبناء بسرعة وتحليل العلاقات هيكل النشاط في نهاية المطاف إعادة توجيه التوليف والمخدرات التصميم. لكن، وكما فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى المستخدمة في مشاريع التنمية المخدرات في فيروس نقص المناعة البشرية، اسم لن تعطي معلومات عن آثار مثبطات المفترضة في الخلايا المصابة بالفيروسات.

البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) هو والبروتين الأساسي الصغير الذي يرتبط بشكل وثيق مع RNA الجيني في الفيروسات المعدية ناضجة، ولعب دورا محوريا في تكاثر الفيروس بمثابة العامل المساعد خلال النسخ العكسي والاعتراف الجينوم، والتعبئة والتغليف. 1-3 NC بمثابة كوصي الحمض النووي تحفيز زعزعة استقرار الهياكل الحمض النووي والصلب من تسلسل التكميلية. نشاطها الحمض النووي تجميع يقيم في المقام الأول في الأحماض الأمينية 11 نطاق N-المحطة في حين تم تعيين النشاط زعزعة استقرار دوبلكس للهياكل إصبع الزنك لها (12-55 الببتيد). 4 البروتين موجبة الشحنة يقلل من الحاجز الكهربائي من رد فعل الصلب و يزيد من المعدل الذي اثنين من سلاسل تكميلية منفصلة معا. الأحماض النووية مطوية في التشكل مستقرة وتتطلب أنشطة كوصي من NC إلى facilitatالبريد الصلب من 5 وهذا أمر مهم لا سيما في النسخ العكسي، حيث NC أمر بالغ الأهمية في نقل الأحداث حبلا: في نقل ناقص حبلا، وDNA توقف ناقص حبلا، retrotranscribed فقط، يجب أن يتم نقل وصلب لتسلسل مكمل في المنطقة R في &#39;نهاية 3 من الجينوم RNA القالب. 6 على الرغم من أن يفضل الديناميكا الحرارية، لا يحدث هذا التفاعل على نطاق واسع في غياب NC بسبب وجود هيكل مستقر في المنطقة استجابة تفعيل المتحولة (TAR) RNA في المناطق R، يجب أن تكون مرتبطة إلى نسخة الحمض النووي (DNA cTAR). 7 مناطق هي، في الواقع، منظم للغاية cTAR وTAR ذات صفة الجذعية حلقة التشكل. البروتين NC يبدل طبيعة هذه دبابيس الشعر، ويعزز نقل حبلا ناقص عن طريق زيادة معدل الصلب الجزيئات بين التكميلية جدائل الحمض النووي. وقد تم التحقيق آلية NC الصلب من تقرير التقييم الثالث وcTAR بدقة وديمكتوب كما فحص TAR الصلب في العديد من الأوراق البحثية ويصور الخطة المقترحة في الاستعراضات ممتازة. 8-11 التلخيص، NC يزعزع استقرار هيكل الثانوي من الحمض النووي الريبي مستقر مثل TAR-RNA، يزعزع استقرار هيكل الثانوي للتسلسل التكميلي، cTAR-الحمض النووي ، ويعزز رد الفعل الصلب من RNA / DNA مما يؤدي إلى TAR / cTAR تشكيل مضاعف متغاير. 10،11 ونتيجة لذلك، يفضل الخطوة حبلا نقل أثناء النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية. 12 NC غير هدفا جذابا لتطوير العوامل المضادة للفيروسات جديد منذ ان التداخل المحتمل الناجم عن جزيئات صغيرة نحو NC يؤدي إلى الحد من النسخ العكسي من الجينوم الفيروسي نتيجة لنشاط NC خطر. 2،13 يمكن هذا النهج تؤدي في النهاية إلى تطوير عوامل نجاح مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. في سياق عملية غربلة لNC مثبطات 14 ضعنا مقايسة الاعتماد على الخصائص المعروفةمن قفيصة منواة لزعزعة استقرار بكفاءة ويصلب [أليغنوكليوتيد التكميلية. نحن 10،11 يطلق عليه ucleocapsid N A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) فحص. يستخدم اسما وفحص NC للتوسط في الصلب بين نسخ منظم ثابت من الأحماض النووية التكميلية، في حالتنا من قليل النوكليوتيد الموافق الجزء القمي من سلسلة TAR-RNA مع تسلسل الحمض النووي لها التكميلي (cTAR) لانتاج الهجين TAR / cTAR مضاعف متغاير . ويمكن التحقيق في تحليل تقرير التقييم الثالث / cTAR الصلب رد الفعل في وجود NC التي كتبها الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE). ويظهر هذا البروتوكول كيفية إجراء الفحص الاسم ليصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة [أليغنوكليوتيد مطوية في الهياكل منعطف حاد مستقرة، وكيفية تحليل نتائج تفاعل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكنا من التجربة. لا يطلب وضع العلامات المشع للحامض النووي، وdetectiعلى العصابات قليل النوكليوتيد يمكن أن يقوم بها وسائل تلطيخ التقليدية. الفحص، التي توظف إما المؤتلف بروتين كامل طول أو نسخة تركيبية اقتطاع من NC، يسمح بتحديد intercalators خيوط تثبيط NC، وهو نشاط تبين أن ترتبط مع ملزمة قوية لRNA والحمض النووي (14).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="631">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:192px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:155px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock&#160; solution at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock aliquot at -80 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">(12-55)NC peptide</td>
			<td style="width:140px;">EspiKem srl</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 120 086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">0.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 121 023</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 0.1-10 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">701,130,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 2-20 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 200 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Syringe Filter 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">Biosigma srl</td>
			<td style="width:145px;">51,798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:145px;">414631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71725-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D8418-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71376-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">B0252-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Magnesium Perchlorate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">222283-100G</td>
			<td style="width:155px;">Store the 1M solution at&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">49770-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:145px;">17-1329-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T9281-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7460-500G</td>
			<td style="width:155px;">Prepare the 10% solution freshly before use</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">1006401000</td>
			<td style="width:155px;">Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Tris ultrapure</td>
			<td style="width:140px;">Applichem</td>
			<td style="width:145px;">A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">DEPC-treated water</td>
			<td style="width:140px;">Ambion</td>
			<td style="width:145px;">AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">22,621,408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">NanoDrop 1000 spectrometer</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">UV-VIS spectrometer Lambda 20</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Protean II xi Cell</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">165-1803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">SybrGreen II RNA Gel Staining</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">50523</td>
			<td style="width:155px;">Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4&#176;C for two weeks&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Geliance 600 Imaging System</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

RNA أو DNA مطوية في للطي ثلاثي الأبعاد مستقر أهدافا مثيرة للاهتمام في تطوير انتيتومور أو الأدوية المضادة للفيروسات. في حالة HIV-1، والبروتينات الفيروسية المشاركة في تنظيم نشاط الفيروس تعترف عدة الأحماض النووية. البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) هو بروتين أساسي ينظم عدة عمليات خلال تكاثر الفيروس. NC هو في الواقع كوصي زعزعة استقرار الهياكل الثانوية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي وتسهيل الصلب الخاصة بهم. وتثبيط NC هو نهج جديد وهدفا للاهتمام للعلاج لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. ucleocapsid على N A nnealing- M ediated E lectrophoresis تم تطوير (NAME) فحص لتحديد الجزيئات قادرة على منع ذوبان والصلب من الحمض النووي الريبي DNA ومطوية في التشكل ثلاثي الأبعاد مستقرة الديناميكا الحرارية، مثل الهياكل دبوس الشعر من القطران وعناصر cTAR من فيروس نقص المناعة البشرية، من خلال البروتين قفيصة منواة من HIV-1. فحص جديد يستخدم إما إعادةcombinant أو البروتين المركب، و[أليغنوكليوتيد دون الحاجة لوضع العلامات السابقة. ويتحقق تحليل النتائج وفقا لمعيار الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE) تليها التقليدي تلطيخ الحمض النووي. يصف بروتوكول ورد في هذا العمل كيفية إجراء الفحص الاسم مع بروتين كامل طول أو إصدار اقتطاع لها تفتقر المجال N-المحطة الأساسية، سواء المختصة كما الأحماض النووية المحرمين، وكيفية تقييم تثبيط NC النشاط كوصي من قبل خيوط intercalator. وعلاوة على ذلك، الاسم يمكن أن يؤديها في وضعين مختلفة، من المفيد الحصول على مؤشرات حول آلية المفترضة عمل مثبطات NC التي تم تحديدها.

ويبين الشكل 1 نتيجة تمثيلية من قفيصة منواة التليين وساطة الكهربائي (NAME) الفحص، يقوم ط) مع المؤتلف بروتين كامل طول، والثاني) من دون البروتين، أي خلط cTAR + TAR واحتضان ما يصل إلى 1 ساعة على RT، والثالث ) نفس الفحص يؤديها مع (12-55) NC، الببتيد الاصطناعية تفتقر إلى 11 الأحماض الأمينية المجال N-المحطة. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وتشكيل TAR مضاعف متغاير صلب / تم رصد cTAR بحضور كامل طول المؤتلف NC (الممرات تبقى من الشكل 1)، في حالة عدم وجود بروتين (الممرات المركزية في الشكل (1) )، وبحضور من اقتطاع (12-55) NC الببتيد (الممرات الصحيحة في الشكل 1). الضوابط هي: مطوية cTAR، مطوية TAR، وصلب هجين (TAR / cTAR)، التي تم الحصول عليها من خلال تمسخ الحراري للهياكل مطوية ثابت من تقرير التقييم الثالث للcTAR تليها annealin البطئز (14). قدرة NC لتفسد اثنين مستقرة تسلسل الحمض النووي في الحلزون مضاعف متغاير بمد هو واضح بشكل واضح: كامل طول البروتين NC يؤدي على الفور إلى تشكيل TAR / cTAR الهجين: 0 &#39;يشير إلى الحد الأدنى من الوقت يمر بين إضافة NC ل العينات وإضافة عازلة هلام التحميل، الذي يتوقف رد الفعل. ويتحقق تشكيل كامل بالفعل بعد 15 &#39;فترة حضانة. الزيادة في شدة مضاعف متغاير صلب يوازي الانخفاض في شدة مطوية cTAR وTAR أليغنوكليوتيد]. ويتحقق تشكيل مضاعف متغاير أيضا في وجود شكل اقتطاع، أي (12-55) NC، مؤكدا النشاط البيولوجي من الببتيد الاصطناعية. سوف في غياب البروتين أو الببتيد لا لوحظ تشكيل مضاعف متغاير، وتقرير التقييم الثالث و[أليغنوكليوتيد cTAR لا يصلب في درجة حرارة الغرفة في مضاعف متغاير (الشكل 1). فيكل التجارب، وتشكيل سريع وسيطة غير مستقرة (&quot;المجمعات وسيطة&quot; في الشكل رقم 1) التي تقلل مع مرور الوقت لوحظ، على الدوام مع الآلية المقترحة الصرف حبلا من خلال دبابيس الشعر من cTAR وTAR حتى الأحماض النووية الصحيحة للطي (17). واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة هو عدم وجود SDS في المخزن المؤقت جل تحميل. في غياب SDS في GLB يظهر نتيجة للتفاعل في الشكل 2 ومقارنة نتائج مع GLB + SDS. وكان تقرير التقييم الثالث مطوية مسبقا وcTAR المختلط وحضنت لمدة 3 ساعة على RT لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية مع كامل طول البروتين NC المؤتلف. بعد مرور فترة الحضانة تم تقسيم العينات في اثنين: واحد نصف هلام العازلة تحميل دون SDS (GLB) وأضافت، في حين أن النصف الآخر كان GLB مع SDS (GLB SDS). تم تحميل عينات على هلام، وتصور الموقف من الأحماض النووية العصابات بعد هلام تديرهاصبغ تلطيخ. عندما كان NC الحالي ولكن تم تحميلها العينات مع GLB، تم نقل جميع الأحماض النووية العصابات الأعلى: هذا ومن المتوقع ويشير إلى ملزمة قوية بين البروتين والأحماض النووية. وتظهر النتائج مع GLB SDS في اليمين المتطرف من هلام: إضافة SDS يبدل طبيعة البروتين والنشرات الأحماض النووية من مجمع مستقرة مع البروتين، والسماح للمقارنة مع الضوابط. يتم استخدام فحص الاسم لتقييم قدرة خيوط intercalators لتحقيق الاستقرار في الهياكل الحمض النووي ديناميكية وتمنع NC النشاط كوصي 14 intercalators خيوط هي جزيئات العطرية مستو الاستعاضة عن السلاسل الجانبية ضخمة تقع في مواقع نقيض من نظام عصابة، مثل أنثراكوينون هو مبين في الشكل 3A. 18 هذه intercalators قادرة على خيط من خلال الحلزون المزدوج من الأحماض النووية، وتحديد مكان أخيرا سلاسل جانبهم في كل أخدود من ضعفالحلزون. 19،20 ويبين الشكل 3B نتائج الفحص الاسم في وجود مركب 1، intercalator خيوط معروف، 18 بحضور كامل طول NC أو من الببتيد اقتطاع. في كلتا الحالتين، يتم تقليل تشكيل هجين TAR / cTAR التي كتبها NC عن طريق زيادة تركيز intercalator، بينما، في الوقت نفسه، ومقدار TAR الحرة وزيادة cTAR. شكل اقتطاع من البروتين تفتقر الذيل N-محطة (12-55NC) هو أكثر حساسية لتثبيط نشاطه: تم التحقق من هذا الاختلاف مع جميع مركبات اخضعت للاختبار حتى الآن. الفحص الاسم يمكن أن يؤديها بطريقتين، إما عن طريق ما قبل يحتضنها مجمع الاختبار مع NC، تليها إضافة [أليغنوكليوتيد مطوية (وضع NC-حضن مسبق)، أو عن طريق preincubating مجمع اختبار لمدة 15 دقيقة مع ركائز الحمض النووي مطوية ، تليها إضافة NC وحضانة أخرى لمدة 15 دقيقة (بنسبة ضئيلة من العلاقات العامةوضع eincubation). على الرغم من أن فترة حضانة العام هو نفسه في اثنين من وسائط مختلفة، وحضن مسبق مع [أليغنوكليوتيد مطوية قبل إضافة NC يسمح لمزيد من الوقت لخيوط من intercalators في الحمض النووي مطوية. وهذا يؤدي إلى استقرار أقوى من هياكلها ديناميكية وإلى تثبيط أسهل من الأنشطة كوصي NC. وبالتالي فإن تحليل الفحص الاسم في وضعي يعزز الاختلافات في آلية عمل مثبطات NC، كما هو مبين في الشكل (4): عندما تم تحليل مركب 1 حسب الاسم في وضع بنسبة ضئيلة من حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليسار) فإنه يدل تثبيط قوية من الصلب NC بوساطة، في حين لوحظ أقل بكثير تثبيط في وضع NC-حضن مسبق (الشكل 4، والممرات في اليمين). يرجى ملاحظة أن لتحديد تركيزات المثبطة بينما فحص مجموعات من المركبات ذات الصلة مع هذا الاختبار وفي هذه الظروف، كل جتربةمنة يجب أن يؤديها على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام تركيزات المتقاربة (خاصة حول قيمة IC 50) (14). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> الشكل 1: اسم الفحص مع كامل طول NC ومع اقتطاع (12-55) NC TAR مطوية وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت مع المؤتلف NC أو مع (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) ل0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة. استخدمت TAR وcTAR المحتضنة في غياب البروتين (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة و 1 ساعة) كما المراقبة السلبية. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR الهجين / cTAR تم الحصول عليها بعد تمسخ الحراري تليها كانت تستخدم في المختبر الصلب والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. <html><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> الشكل 2: تأثير SDS العازلة في هلام تحميل (GLB) عند تحليل TAR / cTAR الصلب التي كتبها NC TAR وcTAR، prefolded في TNMg 1X، وحضنت مع كامل طول المؤتلف NC (oligos / NC = 1/8) لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو في 37 ° C. GLB أو GLB SDS ثم تم إضافتها إلى عينات المحتضنة مع NC. الضوابط: TAR، cTAR وTAR الهجين صلب / cTAR (كل 1 ميكرومتر). تم إجراء الكهربائي باستخدام هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. تم تعديل هذا الرقم من الشكل S4 من: Sosic، A. وآخرون التصميم والتركيب والتقييم البيولوجي للTAR والمجلدات cTAR كما HIV-1 قفيصة منواة مثبطات MedChemComm 4، 1388-1393، دوى: 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> الشكل (3): (A) التركيبة الكيميائية للخيوط intercalator 1. (ب) تأثير خيوط intercalator 1 المقررة من قبل اسم الفحص. مطوية TAR وcTAR، كل 1 ميكرومتر، وحضنت في وجود تركيزات أشار المجمع 1 مع كامل طول NC أو مع (12-55) NC، كل 8 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وكان رد فعل ثم توقفت عن استخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> الشكل 4: بنسبة ضئيلة من حضن مسبق مقابل سائط NC-حضن مسبق: الآثار على اسم الفحص بنسبة ضئيلة من حضن مسبق وزارة الدفاع.البريد: TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر، تم preincubated مع تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود كامل طول NC (8 ميكرومتر) NC-حضن مسبق. الوضع: تركيزات المشار إليها من خيوط intercalator 1 تم preincubated مع كامل طول NC (8 ميكرومتر) لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك لمدة 15 دقيقة إضافية في وجود TAR مطوية ومطوية cTAR، كل 1 ميكرومتر. TAR مطوية، مطوية cTAR وTAR مضاعف متغاير الموسعة / استخدمت cTAR والضوابط. وجميع ردود الفعل توقفت أخيرا باستخدام GLB SDS. تم حل عينات على هلام بولي أكريلاميد 12٪ في TBE 1X. بعد الكهربائي الأحماض النووية على هلام كانت ملطخة والكشف على نقل transilluminator.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.8K Views.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Video: Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

تمييز خلايا محددة HIV - 1 الإيجابية باستخدام المتجهات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral وإذ تعرب عن البروتين الأخضر نيون

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

قياس ل<em&gt; في المختبر</em&gt; التكامل آخر من HIV-1 Preintegration مجمعات

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...