Name: nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

1. Preparazione del materiale, acidi nucleici e proteine <ol><li> Acidi nucleici <ol><li> Autoclave i tubi da 1,5 ml e memorizzarli in un contenitore sterile. Eseguire ogni passo con puntali con filtro sterili per eliminare gli agenti contaminanti cioè nucleasi dal consumo di laboratorio. </li><li> Preparare Tris-HCl 10 mM a pH 7,5 in acqua DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori. </li><li> NOTA: Il oligonucleotide chiamato &quot;TAR&quot; corrisponde alla sequenza RNA breve (29-mer) 5&#39;-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 &#39;15 mentre CTAR è la sua sequenza complementare DNA 5&#39;-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3&#39;. <ol><li> Solubilizzare sia TAR e CTAR nel buffer Tris di cui sopra (1.1.2.) Per fare 100 micron soluzioni stock. Conservare la soluzione di magazzino CTAR a -20 ° C (aliquote può essere conservato per mesi in queste condizioni). Per la conservazione a lungo termine di RNA, fare 20 aliquote microlitri del TARsoluzione madre, asciugare ciascuna aliquota mediante un concentratore centrifuga a vuoto e conservare a -80 ° C. Appena prima dell&#39;uso, risospendere ciascuna aliquota TAR in 20 acqua DEPC trattati microlitri. NOTA: aliquote TAR di lavoro può essere conservato a -20 ° C per due settimane. </li></ol></li></ol></li><li> Proteine ​​e NC (12-55) NC peptide <ol><li> Preparare il full-length proteina ricombinante NC come riportato. 16 Conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di proteine ​​esatta con uno spettrofotometro UV-Vis con un coefficiente di estinzione a 280 nm di 6.410 M -1 cm -1. </li><li> Risospendere il sintetico (12-55) NC peptide in Tris-HCl 10 mM pH 7.5 e conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di peptide corretta su uno spettrofotometro UV-Vis utilizzando un coefficiente di estinzione a 280 nm di 5.700 M -1 cm -1. NOTA: La (12-55) NC peptide è stato ottenuto HPLC purificato e lyophilized su una soluzione contenente due equivalenti di cloruro di zinco. </li></ol></li><li> Composto 1 <ol><li> Pesare circa 1 mg del composto liofilizzato 1 utilizzando una bilancia analitica e sciogliere in 100 ml di 100% DMSO, opportunamente pesati, per ottenere una concentrazione elevata (≈10 mM) soluzione madre. Determinare la concentrazione del composto esatto su un UV-Vis spettrofotometro con il suo coefficiente di estinzione (a 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Conservare la soluzione madre al buio a -20 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Creazione di Gel Apparecchi e Casting del Gel <ol><li> Per impostare il gel, lavare due piatti (uno lungo e uno corto) con il 70% di etanolo, lasciarli asciugare e quindi inserire due distanziali 1 mm lungo i bordi lunghi della piastra lungo; coprirlo con breve piatto, e assicuri allineare le due piastre a fondo. </li><li> Per lanciare il gel, seguire le istruzioni fornite dal suppLier (diversi fornitori, usare un apparato leggermente diverso; pinze a sandwich e pile sono forniti da ciascun apparato casting). In tutti i casi, essere sicuri che morsetti, faraglioni e le guarnizioni sono pulite, e rimuovere le tracce di acrilamide lasciati dagli utenti precedenti. </li><li> Posizionare il sandwich di gel assemblato nello stand casting e seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore. NOTA: Solitamente una guarnizione siliconica pulita nella parte inferiore della scanalatura colata garantisce una buona tenuta e aiuta a evitare perdite quando si versa il gel. </li><li> Per controllare le perdite, versare acqua distillata con una pipetta tra le lastre di vetro. Aggiungere acqua per riempire il panino e attendere qualche minuto per assicurarsi che non ci siano perdite. Se il sandwich è montato correttamente, rimuovere l&#39;acqua e inserire una carta da filtro tra i due bicchieri per asciugare i bicchieri. Rimuovere la carta e ora il panino è pronto per il gel casting. </li><li> Versare il gel a temperatura ambiente (RT, 25 ° C). Poiché poliacrilammide è altamente neurotossico, indossare guanti. Noie continui 12% gel di poliacrilammide in non-denaturazione condizioni (nativi) per eseguire test NAME. <ol><li> Preparare la soluzione di gel al 12%: mescolare 12 ml di 40% acrilammide / bisacrilammide soluzione (19/1), 4 ml TBE 10x tampone (10x: Tris-HCl 890 mm, 890 mm borato, EDTA 20 mm) ed acqua 24 ml MilliQ . Aggiungere 400 microlitri APS e 50 ml TEMED immediatamente prima dell&#39;uso. Mescolare la soluzione e rapidamente utilizzare una pipetta per versare la soluzione giù tra le lastre di vetro. Introdurre il pettine tra le lastre di vetro, evitando bolle. Aggiungere la soluzione di gel per riempire completamente il panino. </li></ol></li><li> Lasciate che il gel polimerizzare per 45 minuti a 1 ora. Immediatamente prima del caricamento del campione, rimuovere il pettine lentamente e sciacquare i pozzetti a fondo con acqua distillata. </li><li> Dopo le fasi di polimerizzazione e pozzi risciacquo, seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore per posizionare il sandwich di gel nell&#39;apparato per elettroforesi su gel verticale. Se un sistema di raffreddamento è presente, assicurarsi di collocare il sistema gel nel correct posizione del nucleo raffreddamento. </li><li> Se il sistema è progettato per gestire più di un gel, ma solo un gel deve essere eseguito, collegare un sandwich di gel come buffer di sbarramento al nucleo raffreddamento sul lato opposto per formare la camera di completa tampone superiore. NOTA: se la diga non è posizionato correttamente, il buffer superiore perderà probabilmente fermare la corsa del gel. </li><li> Preparare 2,5 L di TBE tampone di corsa (1x: Tris-HCl 89 mM, borato 89 mm, EDTA 2 mM) in acqua deionizzata. Distinguono circa 500 ml di tampone TBE per la camera tampone superiore e versare il resto nella camera polmone inferiore. Versare il restante tampone TBE 500 ml nella camera tampone superiore. </li><li> Posizionare il coperchio sulla parte superiore della camera polmone inferiore, in modo che l&#39;anodo e il catodo sono nella posizione appropriata. </li><li> Collegare il nucleo di raffreddamento, se presente, ad un rubinetto dell&#39;acqua utilizzando tubi. Riempire il nucleo con acqua di rubinetto, che fungerà da dissipatore di calore durante l&#39;elettroforesi, e lasciare che l&#39;acqua del rubinetto circolare attraverso il nucleo durante elettirophoresis. </li></ol> 3. nucleocapside Ricottura-mediata elettroforesi (NAME) Assay <ol><li> Preparazione del buffer <ol><li> Preparare tampone TNMG (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) acqua in DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori. NOTA: Tampone TNMG può essere conservato a 4 ° C fino a 7 giorni. Per ottenere i migliori pieghevoli e ricottura risultati, si consiglia l&#39;uso di buffer appena fatte. </li><li> Preparare il tampone contenente SDS gel Loading (GLB SDS: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v glicerolo, 2% w / v SDS, 0,05% w / v blu di bromofenolo) in acqua trattata con DEPC. NOTA: GLB aiuta a tenere traccia di quanto i campioni oligonucleotidi sono in esecuzione nel sistema gel e permette di affondare i campioni nel gel. L&#39;aggiunta di SDS al GLB è una fase critica per il successo ottimale di dosaggio NAME. Se questo passaggio non è seguita, non è possibile distinguere banda acidi nucleici nella gel Sistema (Figura 2). </li></ol></li><li> Controlla la preparazione <ol><li> Diluire serialmente gli oligonucleotidi soluzioni madre e utilizzando appena fatte 10 mM soluzioni per preparare 10 ml di una soluzione 1 mM di TAR. Preparare nello stesso modo, separatamente, 10 ml di una 1 mM in tampone CTAR TNMG 1x. Riscaldare ogni tubo a 95 ° C per 5 minuti e poi lasciare raffreddare a RT perché TAR e CTAR ad assumere le loro strutture stem-rigonfiamento-loop. </li><li> Preparare 1 micron soluzione TAR ibrida / CTAR come controllo. Mescolare 1 ml di 10 mM TAR con 1 ml di 10 mM CTAR in TNMG 1x, in un volume totale di 10 microlitri. Denaturare gli oligonucleotidi riscaldando il tubo a 95 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare lentamente a RT affinché TAR per ricottura alla sua sequenza complementare CTAR e per formare il doppio filamento ibrido TAR / CTAR. </li><li> Quando le soluzioni sono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione breve-spin. Aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta eacsoluzione h all&#39;interno del tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni di controllo costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. </li></ol></li><li> I campioni di preparazione per l&#39;analisi delle proteine ​​e NC (12-55) NC attività peptide <ol><li> Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegatura 32,5 ml di 4 mM soluzione TAR e, separatamente, di CTAR in TNMG 1x tampone come riportato per la preparazione controlli suddetto (passo 3.2.1.). </li><li> Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide a 80 micron soluzione con acqua MilliQ. </li><li> Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei tubi campioni. </li><li> Preparare 12 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 3 file di 4 tubi nel rack per campioni di laboratorio. Ogni riga indica rispettivamente i campioni da analizzare the full-length proteina NC, i campioni senza proteine ​​e campioni per analizzare il (12-55) NC attività di peptide. </li><li> Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso. </li><li> Aggiungere in ciascun tubo di 2,5 ml di TAR piegato e 2,5 ml di piegato CTAR. Aggiungere acqua trattata con DEPC 4 microlitri ai campioni per l&#39;analisi di NC e (12-55) NC. Aggiungere acqua DEPC trattati con 5 microlitri agli altri campioni. </li><li> Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC per i campioni per, rispettivamente, NC o (12-55) Analisi NC. </li><li> Aggiungere immediatamente 3 ml di GLB SDS al tempo 0 min campioni (segnalato come 0 &#39;nella figura 1), la soluzione pipettando all&#39;interno di ogni tubo 3 volte, e infine mettere la provetta in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. </li><li> Dopo 15 min, 30 min e 1 ora di incubazione a RT, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta la soluzione all&#39;interno each tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli, rispettivamente, e tenere in ghiaccio fino alla fase di carico. </li><li> Rimuovere il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Carico 13 microlitri di ciascun campione nei pozzetti formata come precedentemente descritto per fusione del gel con un pettine ben formatura. Caricare i campioni secondo l&#39;ordine riportato in Figura 1. </li><li> Sostituire il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell&#39;apparato gel all&#39;alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione. </li><li> Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. </li></ol></li><li> La preparazione del campione per analizzare l&#39;attività antrachinone su NC e (12-55) NC <ol><li> Diluire la soluzione stock compound 1. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, la diluizione 5 micron di composto &lt;strong&gt; 1 in acqua MilliQ. </li><li> Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.). </li><li> Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra menzionato (punto 3.2.1.). </li><li> Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua. </li><li> Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni. </li><li> Preparare 20 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 10 tubi ciascuno nel rack per campioni di laboratorio. </li><li> Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso. </li><li> Aggiungere ogni tubo della prima fila con 2,5 ml di TAR piegato. Aggiungere ogni tubo della seconda fila con 2,5 ml di piegato CTAR. </li><li&gt; Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR. Sostituire composto con acqua nei campioni per l&#39;analisi di NC e (12-55) NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, miscelare i campioni CTAR (tubi di seconda fila) con i campioni corrispondenti TAR (tubi di prima fila). </li><li> Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC ai campioni di NC o (12-55) analisi NC, rispettivamente. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio, rispettivamente, con i campioni di NC e (12-55) Analisi NC. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. </li><li> Rimuovere il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni con la sequenza indicata in FigUre 3B. </li><li> Sostituire il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell&#39;apparato gel all&#39;alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione. </li><li> Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. </li></ol></li><li> Preparazione del campione: la modalità Oligo-preincubazione vs modalità NC-preincubazione <ol><li> Diluire il composto 1 soluzione madre. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, 5 micron di diluizione del composto 1 in acqua MilliQ. </li><li> Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.). </li><li> Utilizzare 2,5 ml di soluzione di oligonucleotide 4 mM per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra accennato (punto 3.2.1.). </li><li> Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua. </li><li> Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni. </li><li> Sostituire sempre consigli ogni volta che i reagenti vengono modificate o se qualsiasi altro liquido o soluzione contenuta nella provetta di reazione viene toccato. </li><li> Da questo passo assicurarsi di etichettare in modo chiaro e separare i campioni per le due diverse procedure di pre-incubazione. <ol><li> Modalità Oligo-preincubazione <ol><li> Preparare 10 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 5 tubi nel rack per campioni di laboratorio. </li><li> Aggiungere in ciascun tubo della prima fila 2.5 ml di TAR piegato. Aggiungere in ciascun tubo della seconda fila 2.5 ml di piegato CTAR. </li><li> Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR.Sostituire composto con acqua nei campioni per l&#39;analisi di NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, prendere i campioni CTAR (seconda fila) e metterli con i campioni corrispondenti TAR (prima fila). </li><li> Aggiungere 1 ml di 80 mM NC a ciascun campione e incubare i campioni per 15 minuti a RT. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. </li></ol></li><li> NC-preincubazione mode <ol><li> Preparare 5 vuote 0,5 ml tubi autoclave e metterli nel rack per campioni di laboratorio. </li><li> Aggiungere in ciascun tubo 4 microlitri del composto 1 di diluizione appropriata (crescente concentrazione dal 5 mM alla diluizione 500 mM). Sostituire composto con acqua nei campioni per l&#39;analisi di NC in assenza del composto. </li><li> Aggiungere in ogni provetta 1 ml di 80 μ; M NC e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare 15 ml di TAR piegato con 15 ml di piegato CTAR in un tubo e utilizzare questa soluzione TAR + CTAR nella fase successiva. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, aggiungere a ciascun campione 5 ml della soluzione di miscela TAR + CTAR e incubare i campioni per 15 minuti a RT. </li><li> Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. NOTA: Dal punto 3.5.8 in poi, l&#39;analisi può essere eseguita con tutti i campioni (curriculum da 3.5.7). </li></ol></li></ol></li><li> Rimuovere il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni secondo l&#39;ordine riportato in Figura 4. </li><li> Sostituire il coperchio dell&#39;apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell&#39;apparato gel all&#39;alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette della suppl poterey. </li><li> Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. </li></ol></li></ol> 4. Rimozione Gel e Gel colorazione <ol><li> Dopo l&#39;elettroforesi, spegnere l&#39;alimentazione e scollegare i cavi elettrici. Chiudere il rubinetto dell&#39;acqua del sistema di raffreddamento e scollegare i tubi dal nucleo. </li><li> Rimuovere il coperchio, e, se il sistema è stato raffreddato, rimuovere il nucleo di raffreddamento e versare il tampone da entrambe le camere. </li><li> Disassemblare delicatamente il gel sandwich dall&#39;apparecchio e rimuovere tutti i morsetti dalle lastre di vetro. Per rimuovere il gel dalle piastre, premere uno dei distanziatori fuori al lato delle piastre e ruotarlo delicatamente per tirare e rimuove la lastra di vetro superiore. Afferrare due angoli del gel e sollevarlo delicatamente per rimuoverlo dal vetro. </li><li> Porre il gel in un contenitore adatto con la soluzione colorante per acidi nucleici desiderata30-45 min sotto agitazione. </li><li> Dopo la colorazione, mettere il gel su un transilluminatore sistema di imaging per rilevare acidi nucleici segnale di fluorescenza nel sistema gel. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

NAME è un metodo che consente di determinare velocemente la inibizione dell&#39;attività chaperone della proteina del nucleocapside di HIV-1, un target interessanti nella ricerca di nuovi farmaci anti-HIV. NC annealing veloce ea temperatura ambiente acidi nucleici cui pieghevole stabile altrimenti richiederebbero denaturazione termica ad alta temperatura seguito da un&#39;attenta ricottura. L&#39;analisi può essere eseguita sia con full-length NC o con l&#39;troncato (12-55) NC: in entrambi i casi i due acidi nucleici (RNA e la sua copia di DNA complementare) vengono ricotti rapidamente. Questo è coerente con l&#39;osservazione letteratura con il peptide troncato NC: ricottura viene avviata dallo scioglimento efficace dello stelo di CTAR seguita dalla interazione del suo ciclo apicale complementare, che è un sito di legame debole NC, con la sequenza complementare di TAR anello apicale, finendo attraverso diversi intermediari instabili ibrido ricotto esteso. 21 NC è un prot molto stabileein e pochi problemi mentre possono verificarsi l&#39;esecuzione di NAME. E &#39;molto importante comunque aggiungere SDS appena fatte nel caricamento Gel Buffer utilizzato per arrestare la reazione: se ciò non viene raggiunto, il gel non mostrerà le bande di acido nucleico nelle posizioni corrette. Infatti, NC è una proteina legante acido nucleico, in modo che per visualizzare correttamente TAR / CTAR heteroduplex mediante elettroforesi su gel SDS deve essere presente nel gel Loading Buffer per denaturare la proteina e rilasciarlo dal suo complesso stretto con gli acidi nucleici. Questo è anche una possibile risoluzione dell&#39;esperimento, cioè la formazione di bande spostato durante la corsa gel. Questo effetto è particolarmente evidente quando il full-length NC è stato impiegato, come in Figura 2, ed è collegato alla presenza della coda N-terminale fortemente basico, con un forte effetto aggregante sugli acidi nucleici. La presenza della coda terminale di base rende la reazione ricottura più difficile essere inibita, come esposizionen in figura 3 con compound 1, una filettatura intercalante rappresentante, vale a dire un intercalante particolarmente efficace a stabilizzare le strutture stem-loop di TAR e di CTAR. Infatti, questo tipo di interazione con gli acidi nucleici è favorita quando rigonfiamenti e loop interrompono la continuità doppia elica, consentendo un più facile filettatura dei sostituenti ingombranti nelle coppie di basi. Stabilizzazione del TAR e CTAR da questi legante di acidi nucleici è stato precedentemente analizzato dalla determinazione dell&#39;aumento della temperatura di fusione dei due oligonucleotidi. 14 Inoltre, l&#39;aumento della temperatura di fusione correla con l&#39;inibizione della ricottura catalizzata da HIV-1 NC, portando alla formazione ridotta del heteroduplex TAR / CTAR e indicando che intercalanti filettare sono un&#39;interessante classe di leganti per strutture dinamiche di RNA, come l&#39;elemento TAR. 14 Il meccanismo d&#39;azione invocato per queste compounds può essere ulteriormente convalidati eseguendo il test NAME in diversi formati alternativi, come mostrato in figura 4: in caso di intercalanti inibizione della heteroduplex ricotto è aumentata quando il farmaco viene incubato con le due oligo piegate. Composti che agiscono con diversi meccanismi d&#39;azione, quali leganti diretti della proteina NC, sarebbero meno colpiti dal modo preincubazione diverso. Test NAME eseguita in due metodi quindi potrebbe essere utilizzati per lo screening librerie di composti per l&#39;identificazione di inibitori NC, e anche per valutare il meccanismo putativo di azione dei risultati positivi durante la ricerca di farmaci anti-HIV mirati a NC. Chiaramente, l&#39;uso di queste tecniche solo quando rivendicate per uno specifico meccanismo di azione degli inibitori NC identificati non è sufficiente, e altri saggi biochimici idonei sono necessari per sostenere l&#39;ipotesi di lavoro. 14 Infine, va sottolineato che il NOME utilizza altamenteenzimi purificati, sia ricombinanti o sintetici, dando preziose informazioni sulla inibizione &quot;in vitro&quot; di NC dai composti testati. Questa è la &quot;forza e debolezza&quot; del test: nome può ben integrare screening virtuale e modellazione molecolare approcci nelle fasi preliminari di programmi di scoperta della droga, che consente di costruire rapidamente e analizzare le relazioni struttura-attività e, infine, riorientare la sintesi e droga design. Tuttavia, come altri saggi biochimici utilizzati in progetti di sviluppo di farmaci in HIV, NAME non darà informazioni sugli effetti degli inibitori putativi nelle cellule infettate da virus.

La proteina nucleocapsidica NCp7 (NC) del virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) è un piccolo, proteina basica che è strettamente associata a RNA genomico del virus infettivo maturo, giocando un ruolo fondamentale nella replicazione del virus come cofattore durante la trascrizione inversa , riconoscimento genoma, e l&#39;imballaggio. 1-3 NC funge da chaperon acido nucleico che catalizza la destabilizzazione strutture stabili acidi nucleici e la ricottura di sequenze complementari. La sua attività di acido nucleico aggregazione risiede principalmente nei 11 aminoacidi dominio N-terminale, mentre il duplex destabilizzare l&#39;attività è stato mappato le proprie strutture delle dita di zinco (12-55 peptide). 4 La proteina carica positiva abbassa la barriera elettrostatica della reazione di ricottura e aumenta la velocità con cui due sequenze complementari distinte si uniscono. Gli acidi nucleici piegato in conformazione stabile richiedono le attività chaperone di NC per agevolarnee loro ricottura 5 Ciò è particolarmente importante in trascrizione inversa, dove NC è critica in eventi di trasferimento filo:. nel trasferimento meno strand, fermata DNA strand meno, solo retrotrascritto, deve essere trasferito e ricotto ad una sequenza complementare nella regione R alla &#39;fine del genoma RNA 3 modello. 6 Sebbene termodinamicamente favorita, questa reazione non si verifica ampiamente in assenza di NC per la presenza della struttura stabile dell&#39;attivazione trans regione sensibile (TAR) RNA nelle regioni R, che deve essere associato alla sua copia di DNA (CTAR DNA). 7 regioni CTAR e TAR sono, infatti, altamente strutturato con una caratteristica conformazione stem-loop. Proteine ​​NC denatura questi tornanti, e promuove minus-strand trasferimento aumentando il tasso di ricottura intermolecolare tra i filamenti complementari di acidi nucleici. Il meccanismo di NC ricottura del TAR e CTAR è stato oggetto di studi approfonditi e dedescritto come TAR ricottura test in diversi articoli di ricerca e lo schema proposto è rappresentato in ottime recensioni. 8-11 Riassumendo, NC destabilizza la struttura secondaria di RNA stabile come TAR-RNA, destabilizza la struttura secondaria della sua sequenza complementare, CTAR-DNA , e promuove la reazione ricottura di RNA / DNA che porta al TAR / CTAR formazione heteroduplex. 10,11 Come risultato, il passo strand transfer durante la replicazione dell&#39;HIV è favorita. 12 NC è un bersaglio attraente per lo sviluppo di nuovi agenti antivirali in quanto l&#39;interferenza potenziale indotta da piccole molecole verso NC comporterebbe una riduzione della trascrizione inversa del genoma virale come conseguenza di un&#39;attività NC compromessa. 2,13 Questo approccio potrebbe in ultima analisi, portare allo sviluppo di farmaci anti-HIV di successo. Nel corso di uno screening per NC inibitori 14 abbiamo sviluppato un saggio basandosi sulle proprietà ben notedi nucleocapside di destabilizzare in modo efficiente e ricottura oligonucleotidi complementari. 10,11 abbiamo chiamato N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) test. Assay NAME utilizza NC per mediare la ricottura tra le copie stabilmente strutturati di acidi nucleici complementari, nel nostro caso del oligonucleotide corrispondente alla parte apicale di una sequenza TAR-RNA con la sua sequenza di DNA complementare (CTAR) a dare il TAR ibrida / CTAR heteroduplex . L&#39;analisi del TAR / CTAR reazione ricottura in presenza di NC può essere indagata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGE). Questo protocollo illustra come eseguire il saggio NAME per ricottura rapidamente a temperatura ambiente oligonucleotidi piegate in strutture stabili forcella, come analizzare i risultati della reazione e possibili guasti dell&#39;esperimento. Etichettatura radioattivo dell&#39;acido nucleico non è richiesto, e detectisu bande oligonucleotide può essere eseguita con metodi convenzionali di colorazione. Il dosaggio, che impiega sia il ricombinante proteina intera o una versione troncata sintetica di NC, permette di identificare intercalanti filettatura inibenti NC, un&#39;attività mostrato correlazione con forte legame al DNA e RNA. 14

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock&amp;nbsp; solution at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock aliquot at -80 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)NC peptide</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Store the stock solution at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>0.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 2-20 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Perchlorate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Store the 1&amp;nbsp;M solution at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Prepare the 10% solution freshly before use</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C for two weeks.</td></tr><tr><td>Geliance 600 Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

RNA o DNA piegato in stabile ripiegamento tridimensionale sono interessanti bersagli per lo sviluppo di antitumorali o antivirali. In caso di HIV-1, proteine ​​virali coinvolte nella regolazione dell&#39;attività virus riconoscono numerosi acidi nucleici. La proteina nucleocapsidica NCp7 (NC) è una proteina chiave che regola diversi processi durante la replicazione del virus. NC è infatti un chaperone destabilizzare le strutture secondarie di RNA e DNA e facilitando la loro ricottura. L&#39;inattivazione di NC è un nuovo approccio e un target interessante per la terapia anti-HIV. Il N ucleocapsid A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) test è stato sviluppato per identificare molecole in grado di inibire la fusione e ricottura di RNA e DNA ripiegato in conformazioni tridimensionali termodinamicamente stabili, come le strutture di tornanti TAR ed elementi CTAR di HIV, per la proteina del nucleocapside di HIV-1. Il nuovo test utilizza sia il rericombinante o la proteina sintetica, e oligonucleotidi senza la necessità della loro etichettatura precedente. L&#39;analisi dei risultati è ottenuta mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide standard (PAGE) seguita da convenzionale colorazione acido nucleico. Il protocollo riportato in questo lavoro descrive come eseguire il test NAME con la proteina full-length o la sua versione troncata privo del dominio N-terminale di base, sia competente come acidi nucleici accompagnatori, e come valutare l&#39;inibizione dell&#39;attività chaperone NC da un threading intercalante. Inoltre, NAME può essere eseguita in due modi differenti, utile per ottenere indicazioni sul meccanismo putativo di azione degli inibitori NC identificati.

La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del saggio nucleocapside Annealing Mediated Electrophoresis (NAME), eseguito i) con la proteina ricombinante intera lunghezza, ii) senza la proteina, cioè miscelazione CTAR + TAR e incubazione per 1 ora a RT, e iii ) stesso test eseguito con (12-55) NC, un peptide sintetico privo dei 11 amminoacidi di dominio N-terminale. Il TAR pre-piegato e CTAR sono stati miscelati e la formazione del TAR heteroduplex ricotto / CTAR è stato controllato nella presenza del full-length ricombinante NC (corsie sinistra di figura 1), in assenza di proteine ​​(corsie centrali a figura 1 ), e in presenza delle troncate (12-55) NC peptidici (corsie di destra in figura 1). I controlli sono: piegati CTAR, piegati TAR, e ricotto ibrido (TAR / CTAR), ottenuta attraverso denaturazione termica delle strutture stabilmente piegato di TAR per CTAR seguito dal loro annealin lentag. 14 La capacità di NC di denaturare due sequenze di acido nucleico stabili nella helix heteroduplex esteso è evidente: la proteina NC full-length porta immediatamente alla formazione del TAR / CTAR ibrido: 0 &#39;indica il tempo minimo passando tra aggiunta di NC i campioni e aggiunta di tampone di caricamento del gel, che ferma la reazione; formazione completa è già raggiunto dopo 15 &#39;tempo di incubazione. L&#39;aumento dell&#39;intensità del heteroduplex ricotto parallela alla diminuzione dell&#39;intensità dei CTAR e TAR oligonucleotidi piegate. La formazione heteroduplex si ottiene anche in presenza della forma troncata, cioè la (12-55) NC, confermando l&#39;attività biologica del peptide sintetico. In assenza della proteina o del peptide formazione eteroduplex non si osserva, e TAR e oligonucleotidi CTAR non ricottura a temperatura ambiente nel heteroduplex (Figura 1). Intutti gli esperimenti, la rapida formazione di intermedi instabili (&quot;complessi intermedi&quot; in Figura 1) che diminuiscono nel tempo si osserva, coerentemente con il meccanismo proposto di scambio del filo attraverso le forcelle di CTAR e TAR fino gli acidi nucleici corretto ripiegamento. 17 Una possibile risoluzione dei problemi di questo esperimento è la mancanza di SDS nel buffer Gel Caricamento. In assenza di SDS in GLB l&#39;esito della reazione è mostrato in figura 2 e confrontato con il risultato GLB + SDS. Il TAR pre-piegato e CTAR sono stati miscelati e incubati per 3 ore a temperatura ambiente di per 3 ore a 37 ° C con l&#39;intera lunghezza proteina NC ricombinante. Dopo l&#39;incubazione i campioni sono stati divisi in due: un tampone di caricamento metà gel senza SDS (GLB) è stato aggiunto, mentre per l&#39;altra metà GLB era con SDS (GLB SDS). I campioni sono stati caricati sul gel, e la posizione delle bande acidi nucleici è stata visualizzata dopo il gel gestito datintura colorazione. Quando NC era presente, ma i campioni sono stati caricato con GLB, tutte le bande acidi nucleici sono stati spostati up: questo è previsto e indica un forte legame tra la proteina e gli acidi nucleici. I risultati con GLB SDS sono mostrati in estrema destra del gel: l&#39;aggiunta di SDS denatura la proteina e rilascia gli acidi nucleici dal complesso stabile con la proteina, permettendo il confronto con i controlli. Il dosaggio NAME viene utilizzato per valutare la capacità di filettatura intercalanti stabilizzare strutture di acido nucleico dinamiche e di inibire l&#39;attività NC chaperone. 14 intercalanti filettatura sono molecole planari aromatici sostituiti da catene laterali voluminose situate nei siti opposti del sistema ad anello, come l&#39;antrachinone mostrati nella Figura 3A. 18 Questi intercalanti sono in grado di infilare attraverso la doppia elica di acidi nucleici, infine localizzare le loro catene laterali in ciascuna scanalatura del doppioelica. 19,20 Figura 3B mostra i risultati del test NAME in presenza del composto 1, intercalante una filettatura noto, 18 in presenza di full-length NC o del peptide troncato. In entrambi i casi, la formazione dell&#39;ibrido TAR / CTAR da NC viene ridotto aumentando la concentrazione del intercalante, mentre, allo stesso tempo, la quantità di catrame e aumenta CTAR. La forma troncata della proteina priva coda N-terminale (12-55NC) è più sensibile alla inibizione della sua attività: tale differenza è stata verificata con tutti i composti esaminati finora. Il dosaggio NAME può essere eseguita in due modi, o pre-incubando il composto in esame con NC, seguita da aggiunta di oligonucleotidi piegate (modalità NC-preincubazione), o preincubando il composto di prova per 15 min con i substrati piegate acido nucleico , seguita da aggiunta di NC e un&#39;ulteriore incubazione per 15 min (oligo-prModalità eincubation). Anche se il tempo totale di incubazione è la stessa nelle due diverse modalità, la preincubazione con gli oligonucleotidi piegate prima dell&#39;aggiunta del NC permette più tempo per la filettatura dei intercalanti nell&#39;acido nucleico piegato. Ciò si traduce in una stabilizzazione più forte delle loro strutture dinamiche e in un&#39;inibizione facile attività chaperone NC. L&#39;analisi del saggio NAME nelle due modalità migliora pertanto differenze nel meccanismo di azione degli inibitori NC, come mostrato in figura 4: quando il composto 1 è stato analizzato mediante NAME nel modo oligo-preincubazione (Figura 4, corsie a sinistra) mostra potente inibizione di ricottura NC-mediata, mentre l&#39;inibizione molto più basso si osserva in modalità NC-preincubazione (Figura 4, corsie a destra). Si prega di notare che, per la determinazione delle concentrazioni inibitorie, mentre lo screening serie di composti correlati con questo test e in queste condizioni, ciascuno rienzemento deve essere eseguita almeno in triplicato utilizzando concentrazioni ravvicinati (in particolare intorno al valore IC 50). 14 <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Figura 1:. NOME test con full-length NC e con il tronco (12-55) NC TAR Piegato e CTAR, ogni 1 micron, sono state incubate con ricombinante NC o con (12-55) NC (oligo / NC = 1 / 8) per 0 min, 15 min, 30 min e 1 ora. TAR e CTAR incubate in assenza di proteine ​​(0 min, 15 min, 30 min e 1 ora) sono stati utilizzati come controllo negativo. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR ibrido / CTAR ottenuti dopo denaturazione termica seguita da sono stati utilizzati in vitro ricottura come controlli. Le reazioni sono state poi smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore. <html><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Effetto della SDS in tampone di gel di carico (GLB) nell&#39;analisi TAR / CTAR ricottura da NC TAR e CTAR, già piegati in TNMG 1x, sono stati incubati con full-length ricombinanti NC (oligo / NC = 1/8) per 3 hr a temperatura ambiente oa 37 ° C. GLB o GLB SDS stati poi aggiunti ai campioni incubati con NC. Controlli: TAR, CTAR e il TAR ibrido ricotto / CTAR (ogni 1 micron). L&#39;elettroforesi è stata eseguita utilizzando un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore. Questo dato è stato modificato dalla figura S4 di:. Sosic, A. et al Progettazione, sintesi e valutazione biologica di TAR e leganti CTAR come HIV-1 nucleocapside inibitori MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10,1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Figura 3: (A) Struttura chimica della filettatura intercalante 1. (B) Effetto di filettatura intercalante 1 valutata mediante test NAME. Piegato TAR e CTAR, ogni 1 mM, sono state incubate in presenza di concentrazioni indicate del composto 1 con il full-length NC o con il (12-55) NC, ogni 8 mM. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR heteroduplex estesa / CTAR sono stati utilizzati come controlli. Le reazioni sono state poi smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Figura 4: Oligo-preincubazione modalità versus NC-preincubazione: effetti sui test NOME oligo-preincubazione mod.e: TAR piegata e piegata CTAR, ogni 1 mM, sono state preincubate con le concentrazioni indicate di intercalante filettatura 1 per 15 min, e poi per altri 15 min in presenza del full-length NC (8 mM) NC-preincubazione. modalità: le concentrazioni indicate di intercalante filettatura 1 sono state preincubate con il full-length NC (8 mM) per 15 minuti, e poi per altri 15 min in presenza di TAR piegata e piegata CTAR, ogni 1 pM. TAR piegato, piegato CTAR e il TAR heteroduplex estesa / CTAR sono stati utilizzati come controlli. Tutte le reazioni sono state finalmente smesso di usare GLB SDS. I campioni sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12% in TBE 1x; dopo elettroforesi acidi nucleici su gel erano macchiati e rilevato su un transilluminatore.

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.9K Views.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Genetica

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

Riepilogo

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Capitoli in questo video

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell'integrasi

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell'immunodeficienza umana

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l'uso in gene terapia farmacologica

Misurazione

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

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In uncoating vitro di HIV-1 Cores

Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate

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Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

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Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l'uso in gene terapia farmacologica

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Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio