هذه الطريقة الجديدة لتحليل النسخ العكسي يمكن أن تخبرنا أشياء جديدة حول مجال علم الفيروسات الرجعية. على سبيل المثال، يمكننا معرفة تفاصيل كيفية عمل عوامل القيود الخلوية أو كيف تمنع الأدوية المضادة للفيروسات العكوسة تخليق الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية 1. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن لا يوفر فقط معلومات حول تسلسل الوليدة عكس تران scrips، ولكنه يسمح برسم خرائط دقيقة لها 3-رئيس الدنا تيرميني في قرار ضيق النووية واحدة.
يتم إثراء الحمض النووي الناسلي لفيروس نقص المناعة البشرية 1 من الحمض النووي الجملة للخلايا المصابة HIV1 ، عن طريق التقاط هجين وينبغي تنفيذه في محطة عمل PCR. إعداد مزيج رئيسي من الخرز streptavidin المغناطيسي عن طريق توجيه الأنابيب مائة ميكرولترات من الخرز لكل عينة في أنبوب واحد جهاز طرد مركزي صغير وضع الأنبوب على المغناطيس مناسبة لأنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. بعد أن استقر الخرز نحو الجانب المغناطيسي من الأنبوب ، وإزالة المخزن العازلة ، وإزالة أنبوب من المغناطيس ، وإعادة تعليق الخرز في خمسمائة microliters من bindent غسل أو العازلة BW.
وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس، والانتظار للخرز إلى الهجرة إلى المغناطيس، وإزالة افر. إزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة خمسمائة ميكرولترات من محلول الساليين، إعادة تعليق الخرز، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد عشر دقائق، وغسل الخرز مع العازلة BW.
وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس، وإزالة عظمى وإعادة تعليق الخرز في خمسمائة ميكرولترات من العازلة BW. إضافة خمسين picomoles من كل القبض على أوليغنوكليد biotinylated في العينة الواحدة. احتضان في درجة حرارة الغرفة في حين هزاز في نهاية أكثر من خلاط نهاية لمدة ثلاثين دقيقة.
المقبل، والعودة الأنبوب إلى المغناطيس، وإزالة عظمى، وإزالة أنبوب من المغناطيس، إضافة خمسمائة ميكرولترات من 1x عشرة العازلة، وإعادة تعليق الخرز. بعد غسل الثانية تعليق الخرز مع oligonucleotides شل الحركة في 10 ميكرولتردات من 1x عشرة العازلة لكل عينة. لكل عينة، تسمية أنبوب ميكروستروروج واحد وإضافة عشرة ميكرولترات من تعليق حبة، مائة وسبعين microliters من الحمض النووي، وتسعين microliters من 3x عشرة العازلة.
احتضان في كتلة الحرارة الجافة في 92 درجة مئوية لمدة دقيقتين للطبيعة الحمض النووي. نقل الأنابيب إلى كتلة مختلفة الحرارة الجافة، والتي يتم تعيينها إلى 50 درجة مئوية، واحتضان لمدة ساعة واحدة. كل عشر دقائق خلال هذا الحضانة، عكس الأنابيب لخلط.
عندما يتم الحضانة ساعة واحدة، وغسل الخرز مرة واحدة مع خمسمائة ميكروليتر من 1x عشرة العازلة، وإعادة تعليق في خمس وثلاثين microliters من المياه الحرة النوى. ضمان حبات تسوية جيدا عن طريق ترك الأنابيب على المغناطيس لمدة ثلاث دقائق تقريبا قبل إزالة أي سائل. إلى elute، احتضان الأنابيب في 92 درجة مئوية في كتلة الحرارة الجافة لمدة دقيقتين.
ثم، بسرعة نقل الأنابيب على المغناطيس، أنبوب واحد في وقت واحد. بمجرد ربط الخرز إلى جانب الأنبوب ، قم بنقل المابير الذي يحتوي على الحمض النووي HIV1 إلى أنبوب جديد. لبدء هذا الإجراء، إعادة تعليق محول مسيل للشرب في 100 ميكرومولار في المياه الحرة النوكلاز ودوامة الأنبوب.
لكل عينة، بالإضافة إلى عينة تحكم واحدة، والجمع بين نقطة الصفر أربعة مصغرة خمسة من 10x T4 الحمض النووي العازلة، وأربعة ميكرولترات من محول، ونقطة صفر خمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوى. الحرارة إلى 92 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم ندعه يبرد ببطء إلى ستة عشر درجة مئوية في جهاز PCR. وهذا سيسمح للمحول لتشكيل هيكل دبوس الشعر.
الخطوة الرئيسية في هذا الإجراء هو ربط فعالة وغير منحازة من الجزيئات المكيفة لفتح 3-رئيس الدنا تيرميني. يتم ربط جزيئات cDNA الوليدة المنقية ذات الطول المتفاوت إلى محول حمض نووي واحد من دبوس الشعر الذي تقطعت به السبل باستخدام T4 DNA Ligase. محول يحمل عشوائية ستة تسلسل الباركود النيوكليوتيد، والذي يسمح لparing لتسهيل الربط، ويعمل في وقت واحد كمعرف لقرأات فريدة من نوعها.
محول تيرميني 3-رئيس يحمل فاصل لمنع الربط الذاتي. لإعداد ستين microliter تفاعلات الربط الحجم النهائي، إضافة ما يلي إلى كل أنبوب PCR: ستة microliters من 10x T4 الحمض النووي العازلة، وأربعة وعشرين microliters من أربعون في المئة PEG، وستة ميكروليترز من خمسة مولور بيتاين، وأربع نقاط خمس ميكرولترات من محول، نقطة واحدة اثنين من microliters من T4 الحمض النووي ligase، وثمانية عشر نقطة 3000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بعد خلط ردود الفعل بشكل جيد، احتضان في جهاز PCR في ستة عشر درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي لأربطة المحولات، في ثلاثين microliters من الفورماميد التي تحتوي على الحمض النووي هلام تحميل العازلة لكل تفاعل ربط ومزيج جيد عن طريق توجيه الأنابيب. الحرارة في جهاز PCR في 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم وضعت على الفور على الجليد. الخطوة التالية هي الاستعداد ل denaturing هلام الكهرباء.
وضع ما قبل المدلى بها ستة في المئة TBE denaturing اليوريا هلام بولياكريلاميد في خزان هلام المناسبة وإضافة 1x TBE تشغيل العازلة. تشغيل ما قبل هلام لمدة عشرين دقيقة. المقبل، واستخدام حقنة وإبرة قياس واحد وعشرين لغسل جيوب هلام مع تشغيل العازلة.
ثم تحميل ثلاثين microliters في بئر من نفس العينة في ثلاثة آبار. من المستحسن تشغيل عينة واحدة فقط لكل هلام لتجنب التلوث عبر. تشغيل لمدة عشرين دقيقة.
في حين أن هلام هو تشغيل، وإعداد ثلاثة نقطة صفر خمسة ملليلتر microcentrifuge أنابيب لكل عينة باستخدام إبرة حقنة قياس واحد وعشرين لكزة ثقوب في القاع. إدراج كل من أنابيب المعدة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر وتسمية لهم مع اسم العينة بالإضافة إلى منخفضة، أو متوسطة، أو عالية. عندما تكون جبهة الصبغة الزرقاء الداكنة في منتصف الطريق من خلال الجل ، أوقف الكهربائي وإزالة كاسيت الجل.
نقب فتح الكاسيت وقطع هلام عموديا مع razorblade. لمعالجة الشريط بسخاء مع ثلاثة آبار من العينات المحملة. إضافة شريط هلام إلى حاوية مع 1x TBE وخمسة ميكرولترات من وصمة عار حمض السيانين النووي واحتضان لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
ضمان تلطيخ كافية من أجل تحديد بسهولة الجزء العلوي من محول الحرة التي سيتم إزالتها في وقت لاحق. بعد ذلك، قم بتنظيف سطح الترانوميميناتور الضوء الأزرق بدقة مع المياه المقطرة دي المتأينة. ثم تأخذ قطعة هلام من حاوية تلطيخ ووضعها على مربع الضوء.
بدوره على مربع الضوء وفحص الأحماض النووية الملطخة من خلال مرشح البرتقال. عينة الحمض النووي التمثيلية على هلام ملون، يظهر هنا. المحول عادة ما يبدو مثقلا ويعمل كما النقطة الكبيرة مع الحمض النووي HIV1 الربط تعمل فوق كشرائط.
تشير الخطوط الحمراء إلى المواقع التي يجب قطع الجل فيها لإزالة المحول الحر ، وتقسيم العينة إلى ثلاث قطع زوجية. باستخدام razorblade جديدة، وقطع بعيدا الجانبين من هلام إذا كان هناك مناطق مع عدم وجود عينة محملة لا تزال موجودة. المقبل، وقطع فقط فوق محول لإزالة محول وانخفاض أجزاء هلام.
وأخيرا، قطع بعيدا الجزء العلوي جدا من هلام بما في ذلك حوالي ملليمتر واحد من جيوب هلام التي غالبا ما يكون إشارة حادة مكثفة من الحمض النووي الوزن الجزيئي أعلى. تقسيم قطعة هلام المتبقية التي تحتوي على عينة أفقيا إلى ثلاث قطع حتى. مناطق منخفضة ومتوسطة وعالية الوزن الجزيئي.
ثم، وقطع كل من شظايا هلام ثلاثة إلى اثنين من القطع مليمتر ونقلها إلى نقطة الصفر أعد خمسة أنابيب microcentuge ملليلتر. تدور في السرعة القصوى مع أغطية مفتوحة لمدة دقيقة واحدة. للضغط على القطع هلام من خلال ثقب في أنبوب ملليلتر اثنين لخلق طين هلام.
إذا بقيت أي جزيئات هلامية في الجزء السفلي من أنبوب 5 ملليلتر نقطة صفر، نقلها إلى أنبوب مليلتر يدويا باستخدام إبرة. ابدأ إجراء استخراج الحمض النووي عن طريق إضافة ملليلتر واحد من عازلة استخراج هلام اليوريا إلى طين الجل في كل أنبوب microcentrifuge. تدوير الأنابيب مع نهاية على نهاية خلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات.
إعداد أعمدة التصفية. استخدام مجموعة نظيفة من ملاقط لإضافة واحدة صغيرة جولة الألياف الزجاجية مرشح لكل عمود الطرد المركزي مع مرشحات غشاء خلات السليلوز، الذي يمنع انسداد الغشاء. وضع مرشح في مكان مع رأس أنبوب مقلوب تلميح.
تدور لفترة وجيزة أنابيب ملليلتر مع جل slush واستخراج العازلة في microcentrifuge، ونقل سبعمائة ميكرولترات من السوبر إلى أعمدة مرشح المعدة. الطرد المركزي أعمدة التصفية في ميكروسنتريفوج في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة. ثم نقل تدفق من خلال أنبوب جديد ملليلتر microcentrifuge.
إعادة تحميل الأعمدة مع عظمى المتبقية. في محاولة للحصول على أكبر قدر ممكن من السائل من الخدود استخراج ولا تكون قلقة إذا يتم تضمين قطع هلام. تدور مرة أخرى.
الجمع بين تدفق من خلال عينات الاستخراج نفسه والمضي قدما كما هو موضح في بروتوكول النص. وقد استخدم هذا البروتوكول في عينات من خلايا CEMS-ST المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في حالة عدم وجود أو وجود بروتين مضاد للفيروسات العكوسة البشرية A3G. وتشير قطعة من العدد الإجمالي للقراءات الفريدة التي تم الحصول عليها من كل عينة إلى أن زيادة مستويات A3G تقلل من إجمالي عدد القراءات.
تعكس تأثير المثبطة من A3G على النسخ العكسي توسطت cdna التوليف. في هذه المؤامرات الثلاثة التالية، يظهر جزء الجزيئات في كل طول ممكن في أول مائة وثمانين نيوكليوتيدات، في المدرجات اللونية الزرقاء. تكلفة إضافة A3G زيادة حادة من جزيئات cdna أقصر مبتورة في عدد قليل من المواقف القابلة للاستنساخ محددة جدا.
الخطوط الحمراء المتقطعة، تظهر النسب المئوية من القراءات التي تحمل طفرات C إلى T في الموقف المعني. ويمكن إنتاج سيطرة إيجابية عن طريق تجهيز مجموعة من أوليغونوكليوتيدات الاصطناعية من معرفة تسلسل، وطول وتركيز. يجب أن تظهر جميع الجزيئات في ما يقرب من وفرة متساوية مع اختلافات صغيرة فقط.
إذا كان تشغيل مكتبة ينتج تحيز طول طفيفة، في التسلسل، فإنه من المستحسن تطبيق عامل تطبيع الذي هو مشتق من المنحدر الذي يمثل التحيز حجم. يمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة مع أنظمة أخرى حيث من شأن تحديد الأطراف الرئيسية الثلاثة لجزيئات الحمض النووي أن يضيف رؤى رئيسية في ارطان استقلاب الحمض النووي. يرجى عدم نسيان أن التعامل مع فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي أن يتم تنفيذ بعض الإصابات فقط في مختبرات السلامة المعينة.
