We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

1. نمو خلايا الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم خلايا الخميرة في 30 مل من YPD (الجدول 1) في قارورة صغيرة. احتضان عند 30 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا إلى كثافة ضوئية من 0.2 في 600 نانومتر (OD 600 = 0.2) في 50 مل من YPD واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة إلى كثافة ضوئية من 1.0 في 600 نانومتر (OD 600 = 1.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 40 مل ماء معقم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج لغسل الخلايا. تجاهل طاف وتخزين بيليه خلية في -20 ° C. </li></ol> 2. استخراج البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 0.5 مل من الجليد الباردة غوانيدين العازلة (الجدول 1) لفحص المنسدلة باستخدام الخرز superflow ني NTA أو العازلة A (الجدول 1) لمناعي. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى 2 مترل سقف المسمار الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة نفس الحجم من الخرز الزجاجي (جدول المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حبة تغلب على الخلايا في حبة الخافق صغيرة (جدول المواد) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم ضع على الجليد لمدة 2-3 دقيقة. كرر ذلك ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة على سرعة عالية عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. تحقق الخلايا التي تصور تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي lysed. ملاحظة: الخلايا هي lysed ستظهر أشباح الظلام كما وتفتقر إلى الحدود أو شكل محدد. على النحو الأمثل ينبغي هي lysed لا يقل عن 80٪ من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب حفرة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام دبوس دفعة وضعها في مجموعة (يجب أن يكون سقف المسمار فضفاضة) 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع المحللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع البروتينات المستخرجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتينات المستخرجة باستخدام أسا البروتينذ مجموعة (جدول المواد) وتطبيع كل مقتطفات لتحتوي على نفس كمية البروتين. جلب الحجم الإجمالي إلى 1 مل مع العازلة المناسبة. ملاحظة: يتم الحصول على حوالي 5 ملغ من البروتين الكلي من 50 OD 600 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفر 50 ميكرولتر (250 ميكروغرام من البروتين إذا كان البروتين الكلي المستخرجة من الخطوة 2.10 هو 5 ملغ)، واستخراج خلية كاملة (WCE). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة (الجدول 1)، واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية). </li></ol> 3. تنقية HF-Smt3 تقارن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على حبات superflow ني NTA (جدول المواد) اللازمة للتجارب (100 ميكرولتر من الخرز لكل عينة) من خلال انخفاض سرعة الطرد المركزي (800-1،500 x ج) لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 5X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (جدول المواد): المقلوب أعلى التغلبأسفل حتى يتم معلق الخرز، وجمع حبات بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة، وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخرز في 1 مل من العازلة غوانيدين (الجدول 1) وقسامة لهم في عدد من أنابيب الموافق عينات لتتم معالجتها. جمع حبات بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة، وإزالة طاف. مزيج من الخرز بشكل جيد من قبل قلب أعلى الإفراط في القاع. ملاحظة: مزيج الخرز بشكل جيد من قبل قلب كبير على القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، إضافة 950 ميكرولتر من WCE المتبقية (من الخطوة 2.11: استخراج البروتينات) إلى 100 ميكرولتر من الخرز superflow ني NTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على منصة هزاز عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة أو طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 800-1،500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفر 50 ميكرولتر كما طاف (SUP). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. تحميل 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: الشرج لطخة غربيةيسيس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل من العازلة غوانيدين لمدة 5-10 دقيقة على منصة هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 5X مع 1 مل من كسر العازلة (الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة على منصة هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز resuspend في 90 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من 1 M إميدازول. ملاحظة: إيميدازول يساعد على فصل البروتين صاحب الموسومة من الخرز ني NTA بسبب التنافس التفاعل بين إميدازول والخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدوامة، ثم الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. طاف لنقل أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمل 10-20 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية). ملاحظة: 10-20 ميكرولتر يتوافق مع 0،5-1،0 ملغ من المدخلات، إذا تم استخدام 5 ملغ من WCE. </li></ol> 4. مناعي من Myc على الموسومة الحيز الحركي البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مكافحة ج. Myc على تقارب الاغاروز هلام لtibody (جدول المواد) الضروري لتجارب (25 ميكرولتر من الراتنج لكل عينة) من خلال انخفاض سرعة الطرد المركزي (800-1،500 x ج). إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5X الراتنج مع 1 مل من العازلة A: عكس كبار الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، وجمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الراتنج في 1 مل من العازلة ألف وقسامة لهم في عدد من أنابيب الموافق عينات لتتم معالجتها. جمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف. ملاحظة: مزيج من الراتنج بشكل جيد من قبل قلب كبير الإفراط في القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 950 ميكرولتر من WCE المتبقية (من الخطوة 2.11: استخراج البروتينات) إلى 25 ميكرولتر من الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على منصة هزاز عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 800-1،500 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفر 50 ميكرولتر كما طاف (SUP). إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة واحتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. لوإعلان 10 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5X الراتنج مع 1 مل من العازلة A: عكس كبار الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، وجمع الراتنج التي كتبها انخفاض سرعة الطرد المركزي، وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والراتنج في 100 ميكرولتر من عينة العازلة SUMEB (الجدول 1). ملاحظة: يحتوي عينة العازلة SUMEB 8 M اليوريا و 1٪ SDS (حالة تغيير طبيعة قوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 3-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدوامة، ثم الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. طاف لنقل أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمل 10-20 ميكرولتر من كل عينة في جل SDS-PAGE لتحليل البقعة الغربية (القسم 5: تحليل لطخة غربية). ملاحظة: 10-20 ميكرولتر يتوافق مع 0،5-1،0 ملغ من المدخلات، إذا تم استخدام 5 ملغ من WCE. </li></ol> 5. ويسترن تحليل وصمة عار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مقتطفات من البروتين على 4-12٪ مكرر تريس المواد الهلامية (جدول المواد) والأداء الإقتصادي الأداءاسندت الكهربائي في 120 V لمدة 90 دقيقة (العازلة على التوالي: جدول المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) باستخدام جهاز نقل في 30 V لمدة 90 دقيقة (العازلة نقل: جدول المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الغشاء في الحليب 5٪ / 1X TBST (TABLE1) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) في الحليب 5٪ / 1X TBST بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. عن الأجسام المضادة الأولية، استخدم التخفيف من 1: 1000 (المضادة للعلم ومكافحة UB الأجسام المضادة) أو 1: 5000 (مكافحة Myc على الضد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X غشاء لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1X TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الضد الثانوية (جدول المواد) في 5٪ حليب / 1X TBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام 1: 5000 التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X غشاء لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1X TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع ECL workiنانوغرام الحل (جدول المواد) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الغشاء إلى الأزرق حساسة فيلم X-راي (جدول المواد) وتطوير استخدام مطور التلقائي (جدول المواد). </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وتستخدم على نطاق واسع علامات حاتمة مثل HA، Myc على، العلم، وGST لتحليل الكيمياء الحيوية للبروتينات. بناء سلالات مع HF-Smt3 والبروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة، مثل Ndc10 وNdc80، ويسهل الكشف عن PTMs مثل sumoylation وubiquitination. HF-Smt3 هدم مقايسة يسمح للكشف عن البروتينات الحيز الحركي sumoylat...

Ubiquitination وsumoylation السماح للتصريف بتحول والصغيرة اليوبيكويتين مثل معدل (SUMO؛ Smt3 في S. خميرة 1) إلى بروتين الهدف، على التوالي. PTMs من البروتينات الحيز الحركي تؤثر على مستويات الخلوية وتفاعلات البروتين البروتين خلال مختلف مراحل دورة الخلية لضمان المؤمنين كروموسوم العزل. على سبيل المثال، يتم تنظيم مستويات الخلايا من Cse4 / CENP-A وبروتين الحيز الحركي الخارجي Dsn1 التي كتبها بوساطة بتحول والتحلل البروتيني لضمان الاستقرار الجينوم 2-5. زعزعة استقرار إرفاق ملفات-الحيز الحركي أنيبيب غير صحيحة يتطلب B كيناز Ipl1 / أورورا، التي phosphorylates Dam1 وNdc80 المجمعات التي تتفاعل مباشرة مع ميكروتثبول 6-8. على الرغم من تحديد أكثر من سبعين البروتينات الحيز الحركي، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات إلى أن التحقيق في إدخال تعديلات على هذه البروتينات مع PTMs، على سبيل المثال، بتحول وSUMO. وجود قيود الرئيسي هو القدرة على الحفاظ على PTMالصورة خلال تنقية وندرة الأجسام المضادة مخصصة للكشف عن PTMs مثل sumoylation، الفسفرة، مثيلة، وغيرها. توصيف البروتينات الحيز الحركي sumoylated Ndc10، Cep3، تستخدم Bir1، وNdc80 الأجسام المضادة مخصصة 9. بالإضافة إلى ذلك، تم Ndc10 المتورطين باعتبارها الركيزة لubiquitination 10. Hec1 الإنسان (Ndc80 في S. الخباز) هو الركيزة أيضا لubiquitination، التي تنظمها APC / C-hCdh1 E3 يغاز 11. ولذلك، Ndc10 وNdc80 هي مرشحة جيدة لتعظيم الاستفادة من بروتوكول للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination في S. الخباز. لتسهيل التعرف على sumoylation، اقمنا السلالات التي تعبر عن HF-Smt3 وMyc على الموسومة Ndc10 أو Ndc80. استخدام علامات حاتمة (HF: His6 العلم) يقلل الخلفية بسبب عبر التفاعل الذي كثيرا ما لوحظ في المصل بولكلونل أثيرت ضد بروتين مرشح. نحن وضعت بروتوكولا لتقاربتنقية تقارن HF-Smt3 ثم استخدام التجاري المضادة للعلم ومعاداة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن وجود sumolyated Ndc10 وNdc80 في إعداد Smt3 تنقيته. لubiquitination أوجدنا بروتوكول مناعي تعديل يحفظ ubiquitination من البروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة وإجراء تحليل لطخة الغربية مع التجاري مكافحة UB الأجسام المضادة للكشف عن ubiquitination من Ndc10 وNdc80.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td align="right">11079105</td>
			<td>0.5 mm dia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini beadbeater</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>#693</td>
			<td>8 cell disrupter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">30430</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8215</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7470</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-Myc antibody (A-14)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-789</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-150P</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-258R</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931V</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2001</td>
			<td>0.45 mm pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10 well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer Buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">34078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS pH7.4</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue sensitive X-Ray film</td>
			<td>Dbio</td>
			<td>DBOF30003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>M35AX-OMAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2619</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

التعديلات بعد متعدية (PTMs)، مثل الفسفرة، مثيلة، أستلة، ubiquitination، وsumoylation، تنظيم وظيفة الخلوية من العديد من البروتينات. PTMs من البروتينات الحيز الحركي التي تربط مع DNA القسيم المركزي توسط المؤمنين العزل الصبغي للحفاظ على استقرار الجينوم. النهج البيوكيميائية مثل مطياف الكتلة وتحليل لطخة الغربي هي الأكثر شيوعا لتحديد PTMs. هنا، يتم وصف طريقة تنقية البروتين الذي يسمح للكشف عن كل من sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في خميرة الخباز. سلالة التي تعبر عن polyhistidine العلم الموسومة Smt3 (HF-Smt3) وMyc على الموسومة Ndc10 أو شيد Ndc80 وتستخدم لدراساتنا. للكشف عن sumoylation أوجدنا بروتوكول لتقارب تنقية صاحب الموسومة البروتينات sumoylated باستخدام الخرز النيكل ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة Myc على الأجسام المضادة للكشف عن sumoylated Ndc10 لالثاني Ndc80. للكشف عن ubiquitination، ونحن وضعت بروتوكولا للمناعي من البروتينات Myc على الموسومة ويستخدم تحليل لطخة الغربية مع مكافحة UB الأجسام المضادة لإظهار أن Ndc10 وNdc80 وubiquitinated. نتائجنا تظهر ان حاتمة الموسومة البروتين من الفائدة في صاحب العلم الموسومة سلالة Smt3 يسهل الكشف عن PTMs متعددة. ينبغي أن يسمح الدراسات المستقبلية استغلال هذه التقنية لتحديد وتوصيف التفاعلات البروتينية التي تعتمد على PTM معين.

للكشف عن sumoylation من البروتينات الحيز الحركي Ndc80 وNdc10، سلالات مع HF-Smt3 والبروتينات Myc على الحيز الحركي الموسومة (Ndc80 أو Ndc10) شيدت (الجدول 2)، كما هو موضح سابقا 9،12. تم تنقيته تقارن HF-Smt3 تقارب باستخدام الخرز ني NTA. تحليل لطخة الغربي من تنقية HF-Smt3 مع مضاد للعلم الضد...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80 at JoVE.com

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

تصف هذه المخطوطة الكشف عن sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في مهدها خميرة الخباز.

البروتين تنقية تقنية تسمح الكشف عن Sumoylation وUbiquitination من الناشيء الخميرة الحيز الحركي البروتينات Ndc10 وNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  National Cancer Institute, National Institute of Health.  تصف هذه المخطوطة الكشف عن sumoylation وubiquitination من البروتينات الحيز الحركي، Ndc10 وNdc80، في مهدها خميرة الخباز. 

Video: Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...