We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.

酵母細胞の1成長<ol><li>小さ ​​なフラスコにYPD（ 表1）30mlに酵母細胞を接種します。振とうしながら30℃で一晩インキュベートします。 </li><li> YPD 50mlに600 nmの（OD 600 = 0.2）で0.2の光学濃度に細胞を希釈し、振盪しながら30℃でインキュベートします。 </li><li> 600 nmの（OD 600 = 1.0）で1.0の光学密度に文化を育てます。 </li><li> 2,000×gで5分間遠心操作し細胞と上清を捨てます。 </li><li>細胞を洗浄するために2,000×gで5分間、40ミリリットル滅菌水と遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。上清を捨て、-20℃で細胞ペレットを保存します。 </li></ol>タンパク質の2抽出<ol><li>またはNi-NTAスーパーフロービーズを用いたプルダウンアッセイの氷冷グアニジン緩衝液（表1）0.5mlに再懸濁細胞を、免疫沈降した（ 表1）をバッファ。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。 </li><li> 2メートルへの転送Lスクリューキャップチューブ。 </li><li>ガラスビーズの同じ容量（ 材料表）を追加します。 </li><li> 2-3分間氷上に置く、その後、室温で2分間のミニビーズビーター（材料表）で細胞をビーズ破りました。この3回繰り返します。 </li><li> 30〜60分間、4℃で高速の渦。細胞が溶解されていることを確認するために顕微鏡下で可視化して細胞を確認してください。 注：溶解した細胞は、暗い幽霊が表示され、境界または規定された形状を欠くであろう。最適細胞の少なくとも80％が溶解されるべきです。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ（スクリューキャップが緩んでなければならない）コレクションに押しピンと場所を使用して、チューブの底に穴を穿刺。 </li><li>溶解物を収集するために1分間1000×gで遠心分離します。 </li><li>マイクロ遠心チューブにライセートを移します。 </li><li> 4°Cで30分間15,000×gで遠心分離は、抽出されたタンパク質を回収します。 </li><li>タンパク質ASSAを用いて抽出されたタンパク質の濃度を測定しますYキット（ 材料の表）と同量のタンパク質を含有するすべての抽出物を正規化します。適切な緩衝液で1ミリリットルの全容量を持参してください。 注：総タンパク質の約5 mgを50 OD 600細胞から得られます。 </li><li>全細胞抽出物（WCE）として（ステップ2.10から抽出した全タンパク質は、5mgである場合に250μgタンパク質）50μLを保存します。 2×Laemmliサンプルバッファー（ 表1）の50μlを添加して、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。負荷ウエスタンブロット分析（第5節：ウェスタンブロット分析）のためのSDS-PAGEゲルの各サンプルを10μl。 </li></ol> HF-SMT3コンジュゲートの3精製<ol><li> 1分間低速遠心（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりのビーズを100μl）のために必要なのNi-NTAスーパービーズ（ 材料表）を取得します。上清を取り除きます。 </li><li>反転トップオーバー：洗浄ビーズを1mlのPBS（材料表）で5倍底ビーズを再懸濁されるまで、低速遠心分離によりビーズを収集し、上清を除去します。 </li><li>グアニジン緩衝液（ 表1）1mlのビーズを中断し、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によりビーズを集め、上清を除去します。トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。 注：トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。 </li><li>のNi-NTAスーパービーズ100μlに：各サンプルについて、（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。 </li><li>少なくとも4時間、または4℃で一晩、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。 </li><li> 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。 </li><li>上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルにおける負荷10μlの各サンプルを（セクション5：ウェスタンブロット肛門ysis）。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上で5〜10分間、グアニジン緩衝液1mlで一回ビーズを洗浄します。 </li><li>洗浄ビーズをロッキングプラットフォーム上で5〜10分間のバッファ（ 表1）を破る1mlの5倍。 </li><li> 2×Laemmliサンプルバッファー90μlの再懸濁ビーズ。 </li><li> 1 Mイミダゾールの10μlを添加します。 注：イミダゾールは、イミダゾールとビーズとの間の相互作用を競合に起因したNi-NTAビーズからのHisタグ化タンパク質を解離するのに役立ちます。 </li><li> 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。 </li><li>ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。 </li><li>ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。 注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。 </li></ol> Myc標識動原体タンパク質の4免疫沈降<ol><li>抗c-Mycのアガロースアフ​​ィニティーゲルANを取得tibody（ 材料表）低速遠心分離（800-1,500 XG）による実験（サンプルあたりの樹脂の25μl）をするために必要な。上清を取り除きます。 </li><li>緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 </li><li>緩衝液A 1mlの樹脂をサスペンドし、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 注：トップオーバー底を反転させて十分に樹脂を混ぜます。 </li><li>樹脂の25μlに：（タンパク質の抽出ステップ2.11から）残りのWCEの950μlを添加します。 </li><li>一晩4℃でロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。 </li><li> 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。 </li><li>上清（SUP）として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ローウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルの10μlの広告。 </li><li>緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X：反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。 </li><li> SUMEBサンプル緩衝液（ 表1）100μlの中に樹脂を再懸濁します。 注：SUMEBサンプル緩衝液を8 M尿素および1％SDS（強い変性条件）を含みます。 </li><li> 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。 </li><li>ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。 </li><li>ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル（：ウェスタンブロット分析セクション5）の各サンプルのロード10-20μL。 注：WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。 </li></ol> 5.ウェスタンブロット分析<ol><li> 4~12％のBis-Trisゲル（材料の表）とPERFにタンパク質抽出物をロードORM電気泳動は、90分間120 Vで（ランニング緩衝液： 材料の表）。 </li><li> 90分（： 材料の表転送バッファ）、30 Vで転写装置を用いてニトロセルロース膜（ 材料表）にゲルからタンパク質を転送します。 </li><li>室温で1時間の5％ミルク/ 1×TBST（ 表1）で膜をブロックします。 </li><li> 4℃で一晩、5％ミルク/ 1×TBST中で一次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。千（抗Flagおよび抗Ubの抗体）または1：5,000（抗Myc抗体）一次抗体は、1の希釈を使用しています。 </li><li> 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。 </li><li>室温で1時間、5％ミルク/ 1×TBSTで二次抗体（ 材料表）で膜をインキュベートします。二次抗体の希釈5,000：1を使用してください。 </li><li> 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。 </li><li> ECL workiで膜をインキュベートngの溶液（ 材料表）5分間。 </li><li>青感性X線フィルムに膜（ 材料表）を公開し、自動現像機（ 材料表）を使用して開発しています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-1:+Ubiquitin+gains+weight.">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li><li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4.">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li><li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain.">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li><li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis.">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mub1/Ubr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein.">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).</li><li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast.">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li><li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p.">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li><li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase.">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li><li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation.">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase-promoting+complex/cyclosome+controls+HEC1+stability.">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li><li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIZ1/SIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II.">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li><li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells.">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158 (2007).</li><li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li><li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+assembly:+if+you+build+it,+they+will+come.">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

そのようなHA、Mycの、フラグ、GSTなどのエピトープタグは、広くタンパク質の生化学的分析のために使用されます。 HF-SMT3などNdc10やNdc80としてMyc標識動原体タンパク質、を有する株の構築は、SUMO化およびユビキチン化などのPTMの検出を容易にしています。 HF-SMT3アッセイをプルダウンNdc10とNdc80（ 図1）、SUMO化動原体タンパク質の検出を可能にします。修飾タンパク質は、HF-SMT3な?...

それぞれ、標的タンパク質へ;（S.セレビシエ 1 SMT3 SUMO）ユビキチンとSUMO化は、ユビキチンと小さなユビキチン様修飾剤の結合を可能にします。動原体蛋白質のPTMは、忠実な染色体の分離を確実にするために、異なる細胞周期の段階でそれらの細胞レベルおよびタンパク質 - タンパク質相互作用に影響を与えます。例えば、Cse4 / CENP-Aと外側動原体タンパク質DSN1の細胞レベルは、ゲノムの安定性2-5を確保するためのユビキチンを介したタンパク質分解によって調節されています。不正な動原体微小管の添付ファイルの不安定化は、直接微小管6-8と対話DAM1とNdc80複合体をリン酸化するIPL1 /オーロラBキナーゼを必要とします。 70以上の動原体タンパク質の同定にもかかわらず、PTMを、 例えば 、ユビキチンおよびSUMOとのこれらのタンパク質の修飾を調査する非常に少数の研究があります。主な制限は、PTMを維持する能力であります精製およびそのようなSUMO化、リン酸化、メチル化、および他のようなPTMを検出するためのカスタム抗体の不足時にS。 SUMO化動原体タンパク質の特性はNdc10、Cep3は、BIR1、およびNdc80カスタム抗体9を利用しました。さらに、Ndc10は、ユビキチン化10の基質として関与しています。ヒトHec1（S. cerevisiaeにおけるNdc80）も、APC / C-hCdh1 E3リガーゼ11によって規制、ユビキチン化の基質です。したがって、Ndc10とNdc80はSにSUMO化とユビキチン化の両方を検出するためのプロトコルの最適化のための良好な候補でありますセレビシエ 。 SUMO化の識別を容易にするために、我々は、HF-SMT3とMyc標識Ndc10またはNdc80を発現する株を構築しました。エピトープタグ（HF：のHis6フラッグ）の使用は、頻繁に候補タンパク質に対するポリクローナル血清で観察された交差反応性に背景を最小限に抑えることができます。私たちは、親和性のプロトコルを考案しましたHF-SMT3複合体を精製した後、精製SMT3準備にsumolyated Ndc10とNdc80の存在を検出するために、市販の抗フラッグ及び抗Myc抗体を用いました。ユビキチン化のために、我々はmycタグ動原体タンパク質のユビキチン化を保持する修飾された免疫沈降プロトコルを考案し、Ndc10とNdc80のユビキチン化を検出するために、市販の抗Ubの抗体を用いたウエスタンブロット分析を行いました。

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins ndc10 and ndc80

このようなリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化などの翻訳後修飾（PTMを）は、多くのタンパク質の細胞機能を調節します。動原体DNAに関連付ける動原体タンパク質のPTMを、ゲノムの安定性を維持するために忠実な染色体分離を媒介します。このような質量分析およびウェスタンブロット分析のような生化学的アプローチは、最も一般的のPTMの同定のために使用されます。ここで、タンパク質精製法は、サッカロミセス·セレビシエに、Ndc10とNdc80、動原体タンパク質のSUMO化及びユビキチン化の両方の検出を可能にすることが記載されています。ポリヒスチジンFlagタグ付きSMT3（HF-SMT3）およびMyc標識Ndc10またはNdc80を発現株を構築し、私たちの研究のために使用しました。 SUMO化の検出のために、我々は、ニッケルビーズを用いて、HisタグSUMO化タンパク質をアフィニティー精製するためのプロトコルを考案し、SUMO化Ndc10 Aを検出するために抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用しましたND Ndc80。ユビキチン化の検出のために、我々はMyc標識タンパク質の免疫沈降のためのプロトコルを考案し、Ndc10とNdc80がユビキチン化されていることを示すために抗Ubの抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用していました。我々の結果は、彼のフラッグで目的のエピトープタグ化タンパク質はSMT3株は、複数のPTMの検出を容易にタグ付けされたことを示しています。今後の研究では、この技術の利用は、特定のPTMに依存しているタンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために許可する必要があります。

以前9,12に記載されているように動原体タンパク質Ndc80とNdc10のSUMO化を検出するために、HF-SMT3とMyc標識動原体タンパク質（Ndc80またはNdc10）を有する株は、（ 表2）を構築しました。 HF-SMT3結合体は、親和性のNi-NTAビーズを用いて精製しました。 HF-SMT3（ 図1A及び図1Bに示すように 、左パネル）を含まない対照株には存在しなかったSUMO基...

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Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  National Cancer Institute, National Institute of Health. この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

生化学

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, including cell survival, proliferation, and differentiation. It is a reversible process that consists of a covalent attachment of ubiquitin to the substrate through a cascade reaction of at least three different enzymes, composed of E1 (Ubiquitin-activation enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-ligase enzyme). The E3 complex plays an important role in substrate recognition and ubiquitylation. Here, a protocol is described to evaluate substrate ubiquitylation in mammalian cells using transient co-transfection of a plasmid encoding the selected substrate, an E3 ubiquitin ligase, and a tagged ubiquitin. Before lysis, the transfected cells are treated with the proteasome inhibitor MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) to avoid substrate proteasomal degradation. Furthermore, the cell extract is submitted to small-scale immunoprecipitation (IP) to purify the polyubiquitylated substrate for subsequent detection by western blotting (WB) using specific antibodies for ubiquitin tag. Hence, a consistent and uncomplicated protocol for ubiquitylation assay in mammalian cells is described to assist scientists in addressing ubiquitylation of specific substrates and E3 ubiquitin ligases.

We provide a detailed protocol for a ubiquitylation assay of a specific substrate and an E3 ubiquitin-ligase in mammalian cells. HEK293T cell lines were used for protein overexpression, the polyubiquitylated substrate was purified from cell lysates by immunoprecipitation, and resolved in SDS-PAGE. Immunoblotting was used to visualize this post-translational modification.

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

要約

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ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

タンパク質のユビキチン化の検出

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

哺乳類細胞からのユビキチン化p53タンパク質の精製

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製