باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين. تنقية البروتينات في كل مكان في خلايا الثدييات بالمقارنة مع التنقية في المختبر يحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف إشعاعية أكثر. ابدأ بإضافة 1.5 ملليلتر من وسط المصل المختزل في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
أضف الحمض النووي البلازميد الجاهز للنقل إلى كل أنبوب وأضف 0.2 ميكروغرام من بلازميد بروتين الفلورسنت الأخضر لمراقبة كفاءة النقل. أضف 78 ميكرولترا من كاشف نقل الجسيمات الشحمية إلى 4.5 ملليلتر من وسط المصل المختزل في أنبوب طرد مركزي آخر لتخفيف الجسيمات الشحمية. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب ثم اتركه يقف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
أضف 1.5 ملليلتر من محلول الجسيمات الشحمية المخففة إلى كل أنبوب يحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول الحمض النووي المخفف. امزج جيدا واربط البلازميدات بالليبوزومات لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تخلصي من الوسط الأصلي من أطباق بتري وأضيفي تسعة ملليلتر من وسط المصل المختزل في كل طبق.
أضف ثلاثة ملليلترات من خليط الحمض النووي الشحمي واخلط المحلول عن طريق هز اللوح برفق ذهابا وإيابا ثلاث مرات ثم اليسار واليمين ثلاث مرات لتوزيع الخليط بالتساوي على الطبق. قم بزراعة الخلايا في الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط بعد أربع إلى ست ساعات واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24 إلى 36 ساعة.
بعد 24 إلى 36 ساعة ، عالج الخلايا ب MG132 بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار لمدة أربع إلى ست ساعات. تخلص من الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الطبق.
قم بإزالة الخلايا عن طريق كشطها بمكشطة نظيفة ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي عند 700 جم لمدة خمس دقائق لجمع كريات الخلية. أضف 800 ميكرولتر من محلول تحلل FLAG البارد المكملة بكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني إلى الخلايا الموجودة في كل أنبوب.
امزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ثم احتضن الخليط على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بالموجات فوق الصوتية الخليط على الجليد مع كل نبضة تدوم ثانية واحدة ، وتخضع الخليط لخمس إلى 10 نبضات قصيرة. احتضان الخليط على دوار عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
ثم الطرد المركزي العينات بالموجات فوق الصوتية في 8،000 G لمدة 20 إلى 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. القسمة 80 ميكرولتر من استخراج الخلية وتخلط مع 20 ميكرولتر من 5X SDS تحميل العازلة .
غلي العينات عند 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تبرد على الثلج لمدة دقيقتين وتخزن في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. استخدم هذه العينات كمجموعة إدخال لمراقبة تعبير البروتين.
بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من حبات الأجسام المضادة المضادة ل FLAG M2 إلى مستخلصات الخلايا المتبقية واحتضانها على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو طوال الليل. جهاز طرد مركزي عند 1،500 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية لجمع الخرز. أضف ملليلتر واحد من محلول تحلل FLAG البارد إلى الخرز واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
كرر هذه الخطوة من أربع إلى ست مرات ، ثم أضف 40 ميكرولتر من ببتيدات FLAG بتركيز نهائي يبلغ 200 نانوجرام لكل ميكرولتر إلى الخرزات. احتضان على الدوار لمدة ساعتين كما هو موضح سابقا ثم الطرد المركزي في نفس درجة الحرارة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل 5X SDS.
يغلى المزيج على حرارة 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم يبرد على الثلج لمدة دقيقتين. أضف ملليلتر واحد من PBS البارد إلى كريات الخلية واخلطها بالتساوي. قسمة 100 ميكرولتر من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق كعينة إدخال وأجهزة طرد مركزي عند 700 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع كريات الخلية.
أضف 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل FLAG إلى عينة الإدخال واخلط الخلايا باستخدام مذبذب دوامة كما هو موضح سابقا. قم بتحليل الخلايا على الجليد لمدة ساعة واحدة ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بتقسيم 80 ميكرولترا من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وإضافة 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 5X SDS إلى المادة الطافية.
يغلى المزيج على حرارة 98 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم يبرد على الثلج لمدة دقيقتين. جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية عند 700 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع بيليه الخلية. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 1 إلى كريات الخلية واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتوزيع الخلايا بالتساوي.
إخضاع الخلية للتحلل إلى 10 إلى 20 جولة من الموجات فوق الصوتية على الجليد حتى يصبح المحلول غير لزج ، ثم الطرد المركزي للمحلول. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 30 ميكرولترا من راتنج النيكل المشحون إلى المادة الطافية. احتضان على الدوار في 15 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي لمدة دقيقتين.
بعد الطرد المركزي ، اجمع الخرز وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 1 إليه. احتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 1،500 غرام لمدة دقيقتين ، كما هو موضح سابقا. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ubiquitin 2 إلى الخرز وقم بإجراء الحضانة متبوعا بالطرد المركزي ، كما هو موضح سابقا ، لجمع الخرز.
كرر هذه الخطوة مرة واحدة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الخرز واتبع نفس الإجراء للحضانة والطرد المركزي لجمع الخرز. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
قم بتخفيف البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرز ب 40 ميكرولتر من الإيميدازول بتركيز نهائي قدره 0.5 مولار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، الطرد المركزي مرة أخرى في 1،500 غرام لمدة دقيقتين. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف وأضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل 5X SDS.
اغلي المحلول عند 98 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم قم بتبريده على الثلج لمدة دقيقتين. حل العينات بواسطة SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المقابلة. ابدأ تشغيل نظام التصوير الكيميائي للكشف عن الإشارات من النشاف الغربي.
ضع غشاء النيتروسليلوز في الكاميرا الغامضة ووجهه لأعلى. ترميز محلول الركيزة بالتساوي على الغشاء باستخدام مسدس ماصة. أخيرا ، حدد إجراء التعرض التلقائي لالتقاط إشارات السطوع الكيميائي وضبط وقت التعرض يدويا حتى يتم الحصول على إشارة مثالية.
تم ترسيب إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، بخرز FLAG M2 من خلايا H1299 في ظل ظروف غير تغيير الطبيعة. تعرض الشطف للنشاف الغربي مع مضاد p53 ومضاد للهيماغلوتينين أو مع الأجسام المضادة ل p53 والأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هنا ، تعرضت مستخلصات الخلايا الخام أو مدخلاتها للنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 و MDM2.
زادت الإشارة من بروتين p53 في كل مكان والذي يظهر كشريط ملطخ من الوزن الجزيئي المنخفض إلى العالي بشكل ملحوظ عندما تم التعبير عن MDM2 خارج الرحم في هذه الخلايا. تشير هذه النتيجة إلى أن بروتين p53 في كل مكان قد تم تنقيته بشكل فعال من الخلايا. بعد ذلك ، تم تحليل الخلايا تحت ظروف تغيير الطبيعة.
تم سحب إجمالي البروتينات الخلوية في كل مكان باستخدام راتنج النيكل المشحون ثم تم إخضاعها للنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 ومضادات الهيماجلوتينين. تم الكشف عن بروتين p53 في كل مكان باستخدام جسم مضاد مضاد p53 وجسم مضاد مضاد للهيماغلوتينين. هنا في مستخلصات الخلايا الخام أو المدخلات تعرضت للنشاف الغربي مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل p53 و MDM2.
أظهرت النتائج أن مستوى البروتين الكلي في كل مكان لم يتغير ولكن مستوى بروتين p53 في كل مكان زاد بشكل كبير بعد الإفراط في التعبير عن MDM2 في هذه الخلايا. يشير هذا إلى أن إجمالي بروتينات ubiquitin التي تحتوي على p53 في كل مكان قد تم سحبها بشكل فعال من محللات الخلايا في ظل ظروف تغيير الطبيعة. عند محاولة هذا الإجراء ، تذكر أن تعالج الخلايا ب MG132 قبل جمع الخلايا والموجات فوق الصوتية للخلايا بشكل صحيح على الجليد لتنقية البروتينات في كل مكان.
