J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community&#8217;s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).

1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل حوالي 150 ملغ من PEI إلى 100 ​​مل من H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 بإضافة حمض الهيدروكلوريك حتى يصبح حل واضح ويقلب حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق ما بين 10 و 60 دقيقة والمياه إضافة إلى تركيز نهاية 1 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما اضح، تصفية حل PEI من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية في aliquots من 5 مل. </li></ol> 2. إنتاج Lentiviral الجسيمات اليوم 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا HEK293T انقسم الى 60٪ -80٪ confluency في 162 سم 2 قارورة أو طبق بتري كبير في خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 2 ملي الجلوتامين الملحق). </li></ol> يوم 2: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA الحل ترنسفكأيشن التي تحتوي على 45 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد بإضافة معاناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (7 ميكروغرام من pVSVg، 5 ميكروغرام من pRSV مراجعة (13)؛ ميكروغرام من pMDL) و 20 ميكروغرام من البلازميد lentiviral ترميز الجينات في المصالح أو shRNA من الاهتمام. التكيف مع حجم 1 مل باستخدام DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن من خلال إضافة 90 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PEI إلى 930 ميكرولتر من DMEM واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DNA الحل ترنسفكأيشن إلى حل PEI. دوامة أو عكس عدة مرات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حل ترنسفكأيشن الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتنقيط 2 مل من محلول ترنسفكأيشن الحمض النووي على الخلايا HEK293T واحتضان لمدة 4 ساعات في ترطيب حاضنة الثقافة خلية على 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 ساعات، وتحديث مستنبت لإزالة PEI. وليس من الضروري أن يغسل خلايا قبل أن يضيف الوسيلة الجديدة. ملاحظة: PEI غير السامة للخلايا وحضانة مرات أطول من 4 ساعات قد يسبب ضررا للخلايا HEK293T. </li></ol> اليوم 4: <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال سوبrnatant مع الجديد مستنبت. الحفاظ طاف (التي تحتوي على فيروس)؛ هذا وسوف تستخدم في الخطوة 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طاف في 15 مل قارورة. لإزالة الخلايا الميتة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع طاف من خلال 0.45 ميكرون فلتر باستخدام حقنة كبيرة 60 مل. تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> يوم 5: <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدفعة الثانية من طاف. الطرد المركزي ومرشح كما هو الحال في الخطوات 2،8-2،9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع supernatants من الخطوات 2.9 و 2.10 في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي في 50،000 x ج في نابذة فائقة السرعة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ بها كبسولات تحتوي على أنابيب نابذة فائقة السرعة بعناية فائقة ووضعها في غطاء تدفق الصفحي، وتذكر التوجه من الأنبوب داخل أجهزة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبسولة مفتوحة عقد أنبوب نابذة فائقة السرعة والمتوسطة صب بعناية في مثل هذه الأزياء التي بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. منذ الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصور، تذكر على ماجانب من أنبوب بيليه سيكون قد تشكلت. اتخاذ ممص مكروى وإزالة الجزء الأخير من المتوسط ​​مع الحرص على عدم تستنهض الهمم بيليه البني مبهمة التي مرئيا على جانب من الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend هذا بيليه في 500 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع 10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021، 10 ميكرومتر Y27632 و 8 ميكروغرام / مل polybrene. إعادة تعليق في هذه الوسيلة هي مهمة منذ يستخدم الفيروس عيار عالية لtransduct organoids مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: تجميد الفيروس في هذه الوسيلة aliquoted على دفعتين من 250 ميكرولتر في -80 ° C. </li></ol> 3. Lentiviral تنبيغ من Organoids اليوم 0: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كامل 0.95 سم 2 جيدا organoids يومين قبل تنبيغ في بئر جديد، وتهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 organoids صغير. تقسيم organoids وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 1 (الشكل 3A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة عضي مستنبت مع 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ملي نيكوتيناميد للحصول فرط الكيسي أقبية التكاثري (الشكل 3C). ملاحظة: سوف أقبية الكيسي تطوير أفضل عندما تزرع organoids تقسيم حديثا في وجود Chir99021. </li></ol> يوم 2: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids الحصاد قبل pipetting صعودا ونزولا على matrigel والمتوسطة، وبالتالي تعطيل الخليط مع ممص مكروى P1000. ضع الخليط في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل باستخدام مزيد من باستور الماصة التي قد انخفضت افتتاح البعيدة عن ذوبان. organoids أجهزة الطرد المركزي لتكوير لمدة 5 دقائق في 100 × ز. ملاحظة: تعتمد على حجم الطرد المركزي، واستخدام سرعة أجهزة الطرد المركزي مختلفة. فمن الضروري للعثور على سرعة الدقيقة التي تعطلت يتم فصل organoids من الخليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت التربسين 1X (على غرار 0.25٪ التربسين). و resuspend organoids في التربسين واحتضان3 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل التربسين بإضافة 3.5 مل من خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والجلوتامين). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف لترك بيليه في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. نقل organoids في هذا المبلغ صغير الأخير من المتوسط ​​في بئر على طبق من ذهب 48-الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العالية عيار الفيروسة البطيئة في التنبيغ المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.14، في resuspend وانتقل إلى الخطوة 3.10. عندما تواجه منخفضة التنبيغ فعالية، خطوة 3.9 ويمكن أن يضاف. ملاحظة: للحصول على التنبيغ كفاءة، وعادة إضافة قسامة واحدة من 250 ميكرولتر من ارتفاع عيار الفيروسة البطيئة للبئر واحدة من organoids. وهذا يمثل 50٪ من جميع الفيروسة البطيئة تحصد من إنتاج واحد كما هو موضح في الخطوة 2 من هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، نفذ spinoculation من خلال وضع لوحة تحتوي على الآبار organoids 48 في مرحلة ما قبل درجة حرارة الطرد المركزي على 326؛ C وتدوير في 600 x ج لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خليط فيروس عضوي الشكل في الثقافة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة للسماح التنبيغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، واحتضان organoids لمدة 3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من عضوي الشكل مستنبت و resuspend خليط فيروس عضوي الشكل، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 850 x ج لتكوير organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من matrigel الجليد الباردة. منذ المواد يتصلب عندما يصبح أكثر دفئا، واستخدام نصائح ماصة التي توترت بسبب pipetting صعودا وهبوطا الجليد PBS البارد لعدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة في منتصف بئر في لوحة 48 بئرا واحتضان في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة، إضافة بعناية 250 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ميكرومتر Y27632. سوف شظايا عضي تعطلت صغيرة تشكل في organoids الكيسي صغير خلال 24 ساعة. </li></ol> يوم 5: <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث المتوسطة وتكملة مع مضاد حيوي التحديد (لبوروميسين، استخدم 4 ميكروغرام / مل). </li></ol> يوم 7: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة لمعيار مستنبت عضي، على أن تستكمل مع اختيار المضادات الحيوية. ملاحظة: سوف الناشيء تكون كاملة 2-3 أسابيع بعد Chir99021 الانسحاب. بعد الاختيار، قد نمت organoids دون اختيار المضادات الحيوية. </li></ol> 4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد RNA، واستخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إزالة المتوسطة من organoids وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة RLT، على أن تستكمل مع β المركابتويثانول مباشرة على قبة matrigel تحتوي على organoids. Resuspend والعتادالقاعدة في RLT من قبل pipetting باستخدام P1000 ممص مكروى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مزيد من الإعدادية RNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: زيادة الغلة RNA عن طريق التضخيم باستخدام نظام الحفاوة بيكو WTA، والتي تتطلب مدخلات الأولي من 50 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لمراقبة الجودة قبل RNA ميكروأري، تشغيل العينات على 2100 bioanalyzer باستخدام حقيقي النواة مجموع RNA نانو رقاقة، وتهدف لعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من 8.5 أو أكثر (الشكل 5) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol> 5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الشروع في عضي تضمين ما قبل الحارة كتلة الألومنيوم مع الثقوب لتركيب 12 ملم أنابيب زجاجية قطرها في حاضنة عند 70 درجة مئوية للحفاظ على البارافين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ بئر واحد مع organoids كامل نما وإزالة المتوسطة، وترك organoids جزءا لا يتجزأ سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ملمن بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني مباشرة إلى جيدا وإصلاح في 4 درجات مئوية في أي مكان من 1 ساعة ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال بارافورمالدهيد مع 1 مل من الجليد الباردة PBS. اختياريا: الحفاظ على organoids الثابتة في برنامج تلفزيوني يصل إلى 1 في الاسبوع عند 4 درجة مئوية بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend organoids الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومكان في زجاج القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح organoids تنزل الى القاع لمدة 1 دقيقة، صب PBS واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول التي يتم فيها حل بضع قطرات من محلول يوزين لتمكين التصور من organoids في جميع مراحل عملية التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك organoids في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق الصب بعناية، والقدرة على تصور organoids قبل العين بسبب بسيط وردي اللون يوزين. استبدال تضمين حل مع 96٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 5.7، في كل مرة يحل محل الحل تضمين مع واحد القادم. تمرير organoids من خلال الحلول التالية لاحقا: 70٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول و 96٪ من الإيثانول، و 100٪ الإيثانولنول، و 100٪ من الإيثانول، الزيلين والزيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب غسل زيلين الماضي وتصب البارافين في أنبوب. وضع أنبوب على الفور في مرحلة ما قبل درجة حرارة كتلة الألومنيوم عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال البارافين مع البارافين نظيفة الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب البارافين قبالة والماصة organoids في القالب كتلة البارافين باستخدام درجة حرارة ما قبل باستور الماصة مع فتحة كبيرة. الحفاظ باستور الماصة دافئة باستخدام موقد بنسن. وضع كافة organoids في قالب كتلة البارافين في طبقة صغيرة من البارافين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قدر الإمكان، في محاولة للتلاعب كل organoids نحو وسط القالب كتلة البارافين باستخدام إبرة تشريح تحسنت. حافظ على تشريح إبرة دافئة باستخدام بنسن الموقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما توطين organoids في قالب غير مرضية، والبرد القالب قليلا ليصلب طبقة البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من كتلة بصب المزيد من البارافين على رأس وإضافة معيار النسيجي التضمين الكاسيت. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents.">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin1,+a+novel+intestinotrophic+mitogen,+ameliorates+experimental+colitis+in+mice.">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids.">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis.">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li><li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer.">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية. وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي...

الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4. Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني 5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا 8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids. transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء. تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Reagent</td>
			<td style="width:91px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Polyethylene imine</td>
			<td style="width:91px;">polysciences</td>
			<td style="width:103px;">23966-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">BE12-614F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Glutamin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">25030-024</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">matrigel</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">BD 356231</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Advanced DMEM-F12</td>
			<td style="width:91px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N2</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">B27</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-1G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Egf</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glutamax 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir 99021</td>
			<td>axon</td>
			<td>1386</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-007E</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P 7255</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8,057,400,250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ovation Pico WTA system</td>
			<td>NuGen</td>
			<td>3300-12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass vial conical 12mm x 75mm 5ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LSUKM12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Yellowish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,159,350,025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

تنبيغ lentiviral عضوي الشكل تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids at JoVE.com

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

30.2K Views.  Academical Medical Center. In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. 

Video: A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

3D ثقافة المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية والخلايا الجذعية واحدة

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

تسليط الضوء على المؤلف: زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...