J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community&#8217;s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).

1. הכנת Polyethylenimine (PEI) כTransfection מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר כ -150 מ&quot;ג של PEI לשל H 2 O. 100 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם פתרון לpH 7.4 ידי הוספת HCl עד פתרון הופך ברור ומערבבים עד שהיא נמס לחלוטין. פעולה זו עשויה להימשך בין 10 ל 60 דקות ומוסיפה מים עד לריכוז סוף 1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ברור, לסנן את פתרון PEI דרך מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס בaliquots של 5 מיליליטר. </li></ol> 2. ייצור lentiviral החלקיקים יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאי HEK293T 60% confluency -80% בבקבוק 162 סנטימטר 2 או צלחת פטרי גדולה במדיום תרבות שורת תאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ותוספת גלוטמין 2 מ&quot;מ). </li></ol> יום 2: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון transfection DNA המכיל 45 מיקרוגרם בסך הכל DNA פלסמיד על ידי הוספה ביחדוקטורי lentiviral אריזה (7 מיקרוגרם של pVSVg; 5 מיקרוגרם של rev pRSV; 13 מיקרוגרם של pMDL) ו -20 מיקרוגרם של פלסמיד lentiviral קידוד הגן של עניין או shRNA של עניין. התאם לנפח של 1 מיליליטר באמצעות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון transfection PEI על ידי הוספת 90 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר PEI לμl 930 של DMEM ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון transfection DNA לפתרון PEI. מערבולת או להפוך מספר הפעמים ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשיג פתרון transfection DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטף 2 מיליליטר של פתרון transfection DNA על גבי תאי HEK293T ודגירה של 4 שעות בתרבית תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, לרענן את מדיום התרבות להסיר PEI. אין צורך לשטוף את התאים לפני הוספת מדיום חדש. הערה: PEI הוא פעמים ציטוטוקסיות ודגירה ארוכות יותר מ -4 שעות עלולות לגרום נזק לתאי HEK293T. </li></ol> יום 4: <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Supernatant עם מדיום התרבות חדש. שמור supernatant (המכיל וירוס); זה ישמש בשלב 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים supernatant ב -15 בקבוק מיליליטר. כדי להסיר תאים מתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר גדול. אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> יום 5: <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המנה השנייה של supernatant; צנטריפוגה ומסנן כמו בשלבים 2.8-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת supernatants מצעדי 2.9 ו2.10 בצינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 50,000 XG בultracentrifuge למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כמוסות המכילות את צינורות ultracentrifuge מאוד בזהירות והכניס לתוך הזרימה למינרית, לזכור את הכיוון של הצינור בתוך צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמוסה פתוחה מחזיקה צינור ultracentrifuge ובינוני למזוג בזהירות באופן כזה שהגלולה היא בצד העליון של הצינור. מאז כדורים נגיפיים עלולים להיות קשים לדמיין, לזכור על מההצד של צינור גלולה תהיה יצרה. קח micropipette ולהסיר אחרון קצת בינוני תוך הקפדה שלא כדי להתסיס את הגושים חומים האטומים כי הוא גלוי בצד של החלק התחתון של צינור ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה זו ב500 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת 10 nicotinamide מ&quot;מ, 10 מיקרומטר Chir99021, 10 מיקרומטר Y27632 ו8 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene. Resuspension במדיום הזה הוא חשוב שכן וירוס גבוה כייל משמש לtransduct organoids ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: להקפיא את הווירוס במדיום זה aliquoted בשתי קבוצות של 250 μl ב-80 ° C. </li></ol> 3. lentiviral התמרה של Organoids יום 0: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול 0.95 סנטימטר 2 גם מלא organoids יומיים לפני התמרה לבאר חדשה, במטרה להשיג כ -50 organoids הקטן. פיצול organoids על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 1 (איור 3 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים organoid מדיום תרבות עם 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 nicotinamide מ&quot;מ להשיג מאורות היפר פיברוזיס שגשוג (איור 3 ג). הערה: מאורות Cystic יפתחו הטובים ביותר כאשר organoids טרי לפצל גדלים בנוכחות Chir99021. </li></ol> יום 2: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids קציר על ידי pipetting מעלה ומטה matrigel והבינוני, ובכך לשבש את התערובת עם micropipette p1000. מניחים את התערובת בשפופרת 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש נוסף באמצעות pipet פסטר שבפתיחת דיסטלי כבר ירד ב נמס. organoids צנטריפוגה לגלולה במשך 5 דקות ב 100 x גרם. הערה: תלוי בגודל של צנטריפוגות, להשתמש במהירות צנטריפוגות שונה. זה הכרחי כדי למצוא את המהירות המדויקת שבו שיבש organoids מופרדים מהתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של טריפסין 1x מראש חימם (בדומה לטריפסין 0.25%). Resuspend organoids בטריפסין ודגירה3 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום תרבות שורת התאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וגלוטמין). צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant לעזוב גלולה בכ -20 μl של מדיום. העבר את organoids בכמות קטנה האחרונה של מדיום לתוך באר בצלחת 48-בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף lentivirus כייל גבוה במדיום התמרה כמתואר בשלב 2.14, resuspend והמשך לשלב 3.10. כאשר נתקל ביעילות התמרה נמוכה, צעד 3.9 ניתן להוסיף. הערה: לתמרה יעילה, בדרך כלל להוסיף aliquot אחד של 250 μl של lentivirus כייל הגבוה ולאחת מorganoids. זה מייצג 50% מכל lentivirus שנקטפו מייצור יחיד כמתואר בשלב 2 של פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: כדי לשפר את יעילות התמרה, לבצע spinoculation על ידי הצבת 48 organoids הצלחת המכילה גם בצנטריפוגה מראש חיממה על 326; C ולסובב ב 600 XG במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תערובת organoid-וירוס בתרבות חממת דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות כדי לאפשר התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: כדי לשפר עוד יותר את יעילות התמרה, דגירה organoids במשך 3 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבות organoid וresuspend תערובת organoid-הווירוס, להעביר לתוך צינור microcentrifuge ו צנטריפוגות בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 850 XG כדי גלולה organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב -20 μl של matrigel קר כקרח. מכיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא הופך להיות חם יותר, להשתמש בטיפי פיפטה המקוררים על ידי pipetting מעלה ומטה קרח הקר PBS למספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים הטיפה באמצע גם בצלחת 48 בארות דגירה בחממת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, בזהירות להוסיף 250 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת10 nicotinamide מ&quot;מ, 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 מיקרומטר Y27632. שברי organoid שיבשו קטנים יהוו לorganoids פיברוזיס הקטן בתוך 24 שעות. </li></ol> יום 5: <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן בינוני ולהשלים עם אנטיביוטיקה בחירה (לpuromycin, להשתמש 4 מיקרוגרם / מיליליטר). </li></ol> יום 7: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני למדיום תרבות organoid הסטנדרטי, בתוספת אנטיביוטיקה בחירה. הערה: הניצנים יהיו שלמים 2-3 שבועות לאחר נסיגת Chir99021. לאחר בחירה, organoids עשוי להיות מבוגר ללא אנטיביוטיקה בחירה. </li></ol> 4. Organoid RNA הכנה לכמותי RT-PCR או Microarray <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת RNA, השתמש בערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הוצא את המדיה מorganoids ולהוסיף 350 μl של RLT חיץ, בתוספת β-mercaptoethanol ישר על כיפת organoids matrigel מכיל. Resuspend materiאל בRLT ידי pipetting באמצעות micropipette p1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הכנות RNA נוספות על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: להגדיל את תשואת RNA על ידי הגברה שימוש במערכת Ovation הפיק WTA, הדורשים השקעה ראשונית של 50 מיקרוגרם RNA הכולל על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: לבקרת איכות לפני microarray RNA, דגימות מנוהלות על Bioanalyzer 2100 באמצעות שבב ננו RNA eukaryote כולל, מכוון למספר שלמות RNA (רין) של 8.5 או יותר (איור 5) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 5. Organoids העיבוד לפרפין הטבעה ואימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת organoid הטבעה מראש לחמם בלוק אלומיניום עם חורים בקוטר צינורות זכוכית מתאימים 12 מ&quot;מ באינקובטור ב 70 ° C כדי לשמור על נוזל פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גם אחת עם organoids מלא גדל ולהסיר את המדיום, ומשאיר את organoids המשובץ בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטרשל paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ישר לטוב ולתקן על 4 מעלות צלזיוס בכל מקום בין שעות 1 עד הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף paraformaldehyde עם 1 מיליליטר של PBS הקר כקרח. לחלופין: לשמור organoids הקבוע בPBS עד השבוע 1 על 4 מעלות צלזיוס לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend organoids הקבוע ב 1 מיליליטר של PBS ומקום לתוך בקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוא organoids לשקוע לתחתית דקות 1, למזוג PBS ולהחליף עם 70% אתנול שבכמה טיפות של תמיסת eosin הם מומסים על מנת לאפשר להדמיה של organoids לאורך כל תהליך ההטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר organoids באתנול 70% בטמפרטורת חדר. לאחר 30 דקות, להסיר את אתנול 70% באמצעות אחסון בזהירות, להיות מסוגל לדמיין organoids לפי העין בגלל צבע ורדרד eosin קל. החלף פתרון הטבעה עם 96% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.7, בכל פעם שמחליפה את פתרון ההטבעה עם הבא. עובר דרך organoids את הפתרונות הבאים לאחר מכן: 70% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול, etha 100%נול, אתנול 100%, קסילן, קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לשטוף קסילן האחרון ולשפוך נפט לצינור. שים את הצינור מייד בבלוק האלומיניום מראש חימם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהחליף פרפין עם פרפין הנקי החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים organoids פרפין את וpipet לתוך תבנית בלוק פרפין באמצעות pipet פסטר מראש חימם עם פתח גדול. להתחמם pipet פסטר באמצעות מבער בונזן. מניחים את כל organoids בעובש בלוק פרפין בשכבה קטנה של פרפין הנוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד כמה שניתן, מנסה לתפעל את כל organoids לכיוון המרכז של עובש בלוק פרפין באמצעות מחט לנתיחה חיממה. להתחמם מחט לנתיחה באמצעות מבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הלוקליזציה של organoids בעובש היא משביעת רצון, עובש צינה מעט כדי לחזק את שכבת הנפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את הבלוק על ידי שפיכה יותר פרפין על גבי ולהוסיף הטבעת קלטת היסטולוגית סטנדרטית. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+epidermal+growth+factor+(EGF)+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents.">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li><li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine.">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin1,+a+novel+intestinotrophic+mitogen,+ameliorates+experimental+colitis+in+mice.">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids.">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response.">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li><li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis.">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li><li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer.">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול הווידאו הנוכחי מתאר התמרה lentiviral של organoids מאפיתל במעי ראשוני וניתוח במורד הזרם של organoids אלה תוך שימוש בטכניקות RNA כמותי ואימונוהיסטוכימיה. התמרה lentiviral מבוצעת לעתים קרובות בתאים חסיד או צפים בצלחות תרבות. מכיוון שהמבנה הת?...

אפיתל במעי הוא אחד מרקמות הגוף במהירות הרבה ביותר מתרבות, אשר גרמו לו למשוך עניין רחב ממחקר על תאי סרטן וגזע. בשינה 2009 פורסמה טכניקה ליצירת תרבויות לאורך זמן של מאורות מעי דקים בmatrigel, שימור מבנה ממדי 3 1. מבנים אלה, קרוי organoids מעיים, יכול להיות מתורבת באמצעות טכניקות סטנדרטיים, עם סובבים בתוספת בינונית עם מספר גורמי צמיחה מוגדרים, כולל הגולגולת של מעכב מסלול BMP-איתות (קולב), משפר מסלול Wnt-איתות rspondin 1 (Rspo1) ו גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כל מצא כדי לשפר את התפשטות מעיים 2-4. Organoids לעלות שורות תאי הסרטן מסורתיות בהיבטים שהם-מוטציה שאינן, יש לשמור על היררכיה בתאי גזע, להציג קיטוב סלולארי ללא פגע ובידול תערוכה לכל תא השושלות שנמצאו בint הקטן המתהווהאפיתל estinal. שכן הם יכולים להיות transduced לבצע transgenes או התערבות RNA בונה 5, הם משמשים ללמוד אלמנטים גנטיים ספציפיים, להכריע ניסויים באמצעות עכברים הטרנסגניים בהיבטים של עלות ומהירות. ביטוי מהונדס בorganoids יכול להתבצע גם באמצעות retroviral העכברית או וקטורי lentiviral 6,7. בשל המגבלות של רטרווירוסים עכבריים, מסוגלים transducing תאי mitotic באופן בלעדי 8, התמרה lentiviral היא בתדירות גבוהה יותר בשימוש בתאים שקשה להדביק, כגון organoids. באופן ויראלי transduced וorganoids המהונדס ביציבות להביע יכול לשמש למספר רב של ניתוחים במורד הזרם, כולל RNA ניתוחים כמותיים ואימונוהיסטוכימיה. יחדיו, התרבות של organoids מתאי אפיתל במעי עיקרי התפתחה טכניקה שגרתית שהיא קל ליישום ללא דרישות מעבדה ספציפיות, והפכה לסטנדרט ברומן ceתרבות ll במחקר על אפיתל במעי. טכניקות של התמרה ויראלית וניתוח במורד הזרם שלאחר מכן בorganoids הן מייגע לבצע ולסייע לניסויי organoid נוצר פרוטוקול וידאו זה, המציג שיטות לתמרת lentiviral של organoids התרבותי. אנחנו בנוסף להראות כיצד נכונים עיבוד של organoids יכול להגדיל את התשואה ולכן לשפר את הביצועים של ניתוח במורד הזרם תוך שימוש בטכניקות RNA או אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול, organoids שנגזרים ממאורות מעיים קטנים שימש באופן בלעדי, למרות שהטכניקות המתוארות ניתן להחיל organoids מעי הגס גם כן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Reagent</td>
			<td style="width:91px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Polyethylene imine</td>
			<td style="width:91px;">polysciences</td>
			<td style="width:103px;">23966-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">BE12-614F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:91px;">Lonza</td>
			<td style="width:103px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Glutamin</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">25030-024</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">matrigel</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">BD 356231</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">Advanced DMEM-F12</td>
			<td style="width:91px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">12634-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N2</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">B27</td>
			<td style="width:91px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:345px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-1G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Egf</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMG8045</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes 1M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glutamax 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir 99021</td>
			<td>axon</td>
			<td>1386</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107689</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-007E</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P 7255</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8,057,400,250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ovation Pico WTA system</td>
			<td>NuGen</td>
			<td>3300-12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass vial conical 12mm x 75mm 5ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LSUKM12</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Yellowish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,159,350,025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

התמרה lentiviral Organoid הטכניקה של התמרה organoid באמצעות חלקיקי lentiviral תלוי בטיפול הנכון בorganoids לפני ובמהלך התמרה. Organoids (איור 3 א) היו בתרבית והם שובשו למאורות יחידים (איור 3). כפי שדווח בעבר, מאורות יחידים אלה, כאשר בתר?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids at JoVE.com

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

30.2K Views.  Academical Medical Center. In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. 

Video: A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is compartmentalized into crypts and villi: the stem and proliferating cells are confined to the crypts, whereas the villi epithelium contains only differentiated cells. Hence, the normal intestinal crypts, but not the villi, can give rise to organoids in 3D cultures. The procedure described here is applicable only to villus epithelium undergoing dedifferentiation leading to stemness. The method described uses the Smad4-loss-of-function:&#946;-catenin gain-of-function (Smad4KO:&#946;-cateninGOF) conditional mutant mouse. The mutation causes the intestinal villi to dedifferentiate and generate stem cells in the villi. Intestinal villi undergoing dedifferentiation are scraped off the intestine using glass slides, placed in a 70 &#181;m strainer and washed several times to filter out any loose cells or crypts prior to plating in BME-R1 matrix to determine their organoid-forming potential. Two main criteria were used to ensure that the resulting organoids were developed from the dedifferentiating villus compartment and not from the crypts: 1) microscopically evaluating&#160;the isolated villi to ensure absence of any tethered crypts, both before and after plating in the 3D matrix, and 2) monitoring the time course of organoid development from the villi. Organoid initiation from the villi occurs only two to five days after plating and appears irregularly shaped, whereas the crypt-derived organoids from the same intestinal epithelium are apparent within sixteen hours of plating and appear spherical. The limitation of the method, however, is that the number of organoids formed, and the time required for organoid initiation from the villi vary depending on the degree of dedifferentiation. Hence, depending upon the specificity of the mutation or the insult causing the dedifferentiation, the optimal stage at which villi can be harvested to assay their organoid forming potential, must be determined empirically.

The procedure describes isolation of the villi from the mouse intestinal epithelium undergoing dedifferentiation to determine their organoid forming potential.

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in response to infection or injury at the mucosal level as they are involved in antimicrobial responses and wound healing. They are also critical secondary messengers, regulating several pathways, including cell growth and differentiation. On the other hand, excessive ROS levels lead to oxidative stress, which can be deleterious for cells and favor intestinal diseases like chronic inflammation or cancer. This work provides a straightforward method to detect ROS in the intestinal murine organoids by live imaging and flow cytometry, using a commercially available fluorogenic probe. Here the protocol describes assaying the effect of compounds that modulate the redox balance in intestinal organoids and detect ROS levels in specific intestinal cell types, exemplified here by the analysis of the intestinal stem cells genetically labeled with GFP. This protocol may be used with other fluorescent probes.

The present protocol describes a method to detect reactive oxygen species (ROS) in the intestinal murine organoids using qualitative imaging and quantitative cytometry assays. This work can be potentially extended to other fluorescent probes to test the effect of selected compounds on ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

תרבית תלת ממדית של אורגנואידים מקריפטים של המעי המוריני ותאי גזע בודדים

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

מחבר זרקור: התרבות התלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...