The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility &#8221;Two-Photon Imaging&#8221;, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

ملاحظة: وأجريت التجارب وفقا للتشريعات التي تحكم الألماني الدراسات على الحيوانات في أعقاب &quot;دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية&quot; (منشورات NIH، الطبعة 8، 2011) والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض العلمية (الجريدة الرسمية للاتحاد الأوروبي، 2010). تم منح إذن رسمي من الحكومة رعاية الحيوان واستخدام المكتبي (LANUV نوردراين فيستفالن، ركلينغاوسين، ألمانيا). ملاحظة: الخطوات التي يمكن حذفها للتصوير على المدى القصير (على سبيل المثال المفاجئة الطلقات، مداخن 3-D أو أيضا مدة قصيرة الوقت الفاصل بين المجهري) يتم وضع علامة مع النجمة (*) للحد من الوقت اللازم لإعداد وتبسيط البروتوكول الجراحي. ويمكن أيضا أن يؤديها التصوير دون رقابة رصد وتداول واسعة النطاق إذا لزم الأمر، ومع ذلك، سيتم تخفيض الوقت البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ. 1. إعداد المجهر وجراحة قبل إعداد (5-10 ميلن) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام التبديل على (المجهر، مختبر السلطة، ليزر، وسادة التدفئة، وغرفة المناخ، وكاميرا ويب، جهاز ضخ حقنة، التنفس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط O 2 العرض لالأيزوفلورين بخار وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 1.5٪ المجلد (ت / ت)، وربط لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير على المدى القصير، والحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلورين إلا بعد الأولي للتحريض التخدير IP (راجع الخطوة 2.2). ثم استخدام 2 المجلد٪ (ت / ت) الأيزوفلورين، والحفاظ على وقت التصوير أقل من 2 ساعة لضمان استقرار دوران الأوعية الدقيقة في الكبد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التنفس إلى 120-140 دورات التنفس / دقيقة مع حجم 150-200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرحلة الماوس الاغاروز. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز، وسكب عليه في طبق (حوالي 10 سم × 15 سم القاعدة) في زاوية من 40 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقامة منطقة العمل الجراحي جمع الأجهزة المطلوبة. لمنع العدوى الميكروبية، وتطهير الأدوات باستخدام محلول 1٪ من Sekusept فورت S (9.9٪ ث / ت)، غلوتارال 9.8٪ ث / ت، الفورمالديهايد لمدة 5 دقائق قبل التجربة (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المكونات المتبقية: مطهر الجلد (على سبيل المثال، 10٪ محلول البوفيدون اليود)، ومرحلة الكبد (مداخن والجسر)، والحل الاغاروز (3٪ (ث / ت) في PBS)، ضخ حقنة مع 5٪ (ث / ت) حل الجلوكوز (G-5)، ضخ حقنة مع الحل مخدر I (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل)، ومسحات القطن، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat، وبرنامج تلفزيوني 1X. وضع طبق مرحلة الاغاروز إلى غرفة الحضانة لالتسخين. </li></ol> 2. القصبة الهوائية (10-15 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام C57BL / 6 الفئران من المنزل في تربية وزنها 25-28 ز. بيت الفئران في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة وفقا للمبادئ التوجيهية FELASA، في و للحرارة البيئة التي تسيطر عليها الرطوبة مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام. تسمح الحيوانات حرية الوصول إلى النظام الغذائي العادي الفئران (الشمة ستاندرد القوارض الدايت) والمياه الإعلانية libitum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم داخل الصفاق (IP) حقن 250 ميكرولتر من محلول مخدر II (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 1 ملغ / مل، البوبرينورفين 10 ميكروغرام / مل). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * للصيانة خلال التصوير حيوي داخلي وإدارة باستمرار حل مخدر I عن طريق الحقن الملكية الفكرية المستمر (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل) باستخدام جهاز ضخ حقنة مع معدل تدفق 0.2 مل / ساعة في بالاشتراك مع inhalative الأيزوفلورين 0.5 المجلد٪ (ت / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من ردود الفعل بعد 5 دقائق (مثل قرصة وسادة القدم مع ملقط)، وتطهير الجلد لالقصبة الهوائية، وبدء التحضير إذا الفأر هو في حالة التخدير الجراحي متسامحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق كريم العين واقية (على سبيل المثال، ديكسبانتينول 50 ملغ / غ) لمنع القرنية من الجفاف (الشكل 1B). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحملق الماوس على إعداد جدول فضح الجانب البطني باستخدام شريط لاصق لالأطراف. تنهك بلطف الرقبة، يحملق في هذا الموقف، على سبيل المثال، باستخدام الشريط المطاطي مدمن مخدرات رس القواطع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجلد والفرو باستخدام محلول اليود البوفيدون، من خلال تطبيق مطهر مع مسحة القطن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قطع الجلد الأولي (0.5-1 سم طول) أدناه الذقن مباشرة (الشكل 1C) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بعناية النسيج الضام بين الغدد اللعابية (الشكل 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسيل للدموع بعناية مفتوحة العضلات المحيطة أنبوب القصبة الهوائية (الشكل 1E، F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع موضوع الجراحي تحت القصبة الهوائية لاحق أنبوب التهوية تثبيت (الشكل 1G). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح القصبة الهوائية مع مقص الصغرى بين حلقات الغضروف إجراء شق على شكل حرف T (الشكل 1H) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب التهوية إلى القصبة الهوائية من خلال شق (~ 0.5 سم). لدفع أنبوب إلى الأمام، والاستيلاء على نهاية الذيلية مع ملقط التشريحية الصغيرة ودفع بلطف أنبوب في القصبة الهوائية (الشكل 1I) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحملق أنبوب مع موضوع الجراحية (على سبيل المثال </eم&gt;، 5-0) مع موضوع وضعت في الخطوة 2.5 ربط عقدة حول أنبوب داخل القصبة الهوائية. أداء تثبيت الجمجمة الثاني من الأنبوب في الجلد لتجنب الاعادة العرضي (الشكل 1J، K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم قطع مع الغراء الأنسجة (على سبيل المثال، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat) (الشكل 1L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحملق أنبوب على رأس باستخدام شريط لاصق. </li></ol> 3. Laparatomy (15-20 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. حلق البطن، إزالة بعناية الشعر من الجلد. تطهير الجلد والفرو حلق باستخدام محلول البوفيدون اليود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء خفض أدناه القص باستخدام مقص جراحي (الشكل 2A) الجلد صغير. تمديد خفض أفقيا تحت الأضلاع لكلا الجانبين، كية جميع الأوعية الدموية واضحة لمنع النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء بعناية قطع صغيرة في ألبا الخط تحت القص، وفتح الغشاء البريتوني (الشكل 2B). تمديد خفض لكلا الجانبين باستخدام cauterizأوجه لمنع النزيف (الشكل 2C، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس إلى الاغاروز طبق المرحلة (الشكل 2E). وضع أكوام من الارتفاع المناسب على كلا الجانبين من الماوس (عادة 12-14 زلات الغطاء) (الشكل 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الجهاز التنفسي استشعار الزناد تحت أعلى الظهر لمزامنة المجهر مع التنفس. تفعيل وحدة الزناد (الشكل 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع موضوع الجراحي (5-0) من خلال القص لسحب الأضلاع (الشكل 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعناية الرباط الذي يربط الكبد والحجاب الحاجز (المنجلي الرباط)، وكذلك الكبد والجهاز الهضمي المسالك باستخدام مقص جراحي منحنية. قطع في الرباط المنجلي وصولا الى الشريان الأبهر (الشكل 2J). </li></ol> 4. إعداد نموذج (10-15 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على الجانب الأيمن مع بزاوية 45 درجة لسهولة الوصول إلى الفص الكبد واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جسر تنظيم تحت الأضلاع، الذي يغطي البطنتجويف. تصنيع جسر باستخدام غطاء زلة القياسية مع شريط لاصق الطلاء لتغطية حواف حادة (الشكل 2K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفص الكبد كبير على خشبة المسرح. زلة بعناية كروي مزدوج قلم التحقيق أو ملعقة مبطن أسفل الكبد مع الاستمرار على رأس الجهاز باستخدام قطعة من القطن مبللة أو الأنسجة الرطبة. رفع الفص على الشريحة وتطبيق السحب لطيف. الفص يمكن أن تكون عازمة أو مطوية. توفير المزيد من الحيطة لطيف فقط التلاعب في الكبد (الشكل 2L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع دعم الوحشي المخاطر، على سبيل المثال، أكوام من زلات صغيرة غطاء (20 ملم × 20 ملم)، ما يقرب من نفس الارتفاع من الفص الكبد بجانبه لدعم تغطية زلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع زلة غطاء كبير (24 ملم × 50 ملم) على الفص الكبد. تأكد من أن غطاء زلة موجه كما الأفقي ممكن (الشكل 2M). ملاحظة: يجب أن يكون زلة تغطية على اتصال مع الأنسجة دون الضغط عليه. التحقق من وجود علامات واضحة على ضعف تدفق الدم (الأنسجة البيضاء). إذا microcircتعطل ulation، إضافة مزيد من دعم حصص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * مكان اثنين من القسطرة داخل الصفاق المستقلة (الشكل 2N) للتخدير المدى الطويل وG-5 التطبيق. تثبيت القسطرة أفقيا في الجزء الأسفل من البطن بالقرب من أطرافه الخلفية. ملاحظة: يمكن للالقسطرة داخل الصفاق يكون من خلال ربط الإبر 27 G مع مرونة أنابيب السيليكون (الشكل 3) من صنع الذات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * يحملق إبرة مع حلقة من 5-0 موضوع الجراحي للجلد لتجنب النزوح عرضي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * إرفاق ضخ حقنة مع حل التخدير I لقثطار 1، تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل / ساعة. إرفاق ضخ حقنة مع G-5 لقسطرة 2، تعيين معدل التدفق إلى 0.1 مل / ساعة. </li></ol> 5. رصد ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * أقطاب مكان ECG إلى الأمام والأطراف الخلفية (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * إرفاق أنابيب انتهاء إلى CO 2 استشعار مستوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة جهاز استشعار درجة الحرارة الخارجي المتصل سادة الحرارة (الشكل 4C). </li></ol> 6. تضمين وتثبيت الأنسجة (5-10 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X. تضمين الكبد عندما تكون درجة الحرارة في 41 ° C باستخدام حقنة 5 مل و 18 G إبرة (الشكل 5A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المتبقية الاغاروز على ساترة وحول الماوس (الشكل 5B، C). انتظر حتى يتم مهيلم الاغاروز بالكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الاغاروز الزائد باستخدام ملعقة هايدمان، وإعداد viewfield كبيرة بما يكفي لمسح الفص الكبد إعداد (الشكل 5D، E). </li></ol> 7. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس إلى غرفة المناخ المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50-100 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن على 37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن عينة لمنع التبخر (الشكل 5F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * تصغير الأيزوفلورين inhalative إلى 0.5٪ المجلد (ت / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * ابدأ برنامج مراقبة وتسجيل تخطيط القلب، معدل ضربات القلب وCO 2 الزفير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تصوير: فتح لامصاريع سر، وتحديد جهة نظر المجالات ذات الاهتمام، وتحديد الحدود العليا والدنيا للZ-مداخن، وبدء تسجيل مرور الوقت. تعدل Z-مداخن إذا لزم الأمر لتصحيح Z-الانجراف (على سبيل المثال. نظرا للتغيرات في ضغط الدم أو درجة حرارة تذبذب، الشكل (5G). ملاحظة: بعد الانتهاء من فترة التصوير أو إذا كان التداول أو تخدير الحيوانات يصبح غير مستقر، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم (بدون الصحوة من التخدير). </li></ol>

<ol>
	<li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant,+tissue-targeted,+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells.">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li><li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy.">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li><li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs.">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955 (1969).</li><li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy.">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li><li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse.">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy.">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li><li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest.">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).</li><li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats.">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li><li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy.">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li><li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury:+a+working+hypothesis.">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li><li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis.">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li><li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence+excitation:+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy.">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li><li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories.">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li><li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney,+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm.">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li><li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy.">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6++NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids.">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li><li>Vel&#225;zquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids.">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li><li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis.">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li><li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets.">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li><li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas.">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation.">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation.">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li><li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models:+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis.">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li><li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+by+the+liver.">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li><li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis.">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1++monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis.">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice.">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype,+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis.">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li><li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TLR2/S100A9/CXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse.">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li><li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+&#947;&#948;+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis.">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of &#947;&#948; T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li><li>Syn, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids.">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li><li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas.">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li><li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis:+role+of+lymphocytes.">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li><li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue.">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).</li></ol>

The authors disclose no con&#64258;ict of interests.

وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والت?...

لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم 2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد 3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد. بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي 5، والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء 6. وبالمقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى، وجراحة الكبد هي تحديا من نوع خاص. نظرا لهيكل الاوعية الدموية الدقيقة كثيفة، يمكن التلاعب الجراحية تؤدي إلى آفات النزفية واسعة النطاق، وضعف دوران الأوعية الدقيقة 7، وكذلك تفعيل المقيمين طخلايا مناعية مثل خلايا كوبفر 8. ولذلك، التثبيت الميكانيكي للأنسجة كما نشرت في أماكن أخرى 6،9 من المحتمل أن تتداخل مع التصوير intravital المجهري. في كبد صحي، 10-15٪ من حجم الدم الكلي يكمن داخل الأوعية الدموية والكبد، والجهاز يستقبل حوالي 25٪ من النتاج القلبي العام 10، مما يجعل الجهاز عرضة للتغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، وتقلبات ضغط الدم ). ولذلك، فإن اضطرابات في تدفق الدم الكبدي بسبب مثل إجهاد القص، والتشرد، والإصابة التي كتبها معالجة الأنسجة المفرط أو تداول مركزية تؤدي إلى تغيرات مصطنعة في الكريات البيض سلوك الهجرة، الأوكسجين الكبد وضعف، وبالتالي المزيد من تلف الكبد، مما يؤثر على الكبد الاستجابات المناعية وكذلك كما الحفاظ على الجهاز والوقت حياة الشامل للحيوان. واستندت الدراسات المجهرية في وقت مبكر على ميل epifluorescence حيوي داخليcroscopy، ولكن العديد من المعوقات الفنية مثل تبيض الصورة وعمق الاختراق المنخفض تحد من استخدام هذه التقنية لتصوير الكبد على المدى الطويل 4،11،12. مع تطور المجهر multiphoton في 1990s، تم حل القيود المفروضة على الصورة تبيض أو عمق الاختراق بشكل رئيسي، كما كان هذا الأسلوب الجديد قادر من الناحية الفنية لإجراء دراسات التصوير في تقريبا جميع الأجهزة تحت مواقف الحياة الحقيقية 13-15. ومع ذلك، كانت التحديات الرئيسية المتبقية فيما يتعلق التصوير الكبد: حركات التنفس، وتألق ذاتي من أنسجة الكبد، وتأمين تدفق الدم دون تغيير في الجيوب الكبدية، والتصوير مستقر وخاصة لفترات أطول من عدة ساعة 16. على الرغم من أن العديد من الدراسات تناولت وظيفة والهجرة من مختلف الكريات البيض في الكبد 17، على سبيل المثال، NKT خلايا 18-20، وخلايا T 21،22، 23،24 الضامة الكبد أو العدلات 25، المدى الطويل multiphoton ملم يتم بعد إنشاء التصوير icroscopy بنجاح، وهي مهمة أكثر صعوبة في الحيوانات مع مرض الكبد الحاد أو المزمن بسبب الأضرار الموجودة وبالتالي ارتفاع قابلية لمزيد من الضرر 26. ومع ذلك، ومراقبة سلوك الهجرة وظيفة الخلوية من الكريات البيض في الكبد في الوقت الحقيقي يتيح رؤى جديدة في دورها معين في التوازن الكبد ومرض 27. يتم التعبير عن CXCR6 مستقبلات chemokine على عدة مجموعات فرعية لمفاوية، بما في ذلك القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا NKT وبعض السكان الخلية T 18،28. وقد أشارت الدراسات السابقة في الفئران التي CXCR6 وCXCL16 يجند لها وما شابه ذلك قد السيطرة على الدوريات الخلايا NKT على الجيوب الكبد خلال التوازن. ونتيجة لذلك، وقد وصفت استخدام الفئران CXCR6.gfp (يحمل في المغلوب من البروتين الفلوري الأخضر [GFP] في موضع CXCR6) للتحقيق في الهجرة من الخلايا الليمفاوية في مختلف أجهزة مثل الدماغ 29وكذلك الكبد 18،20، والتي تبين زيادة تسلل خلايا CXCR6.gfp على الالتهاب. مع أسلوب المقدمة في هذه الدراسة كان من الممكن أن تتبع هذه العمليات على مدى فترة طويلة من الزمن في ظل ظروف مستقرة. يسمح الإجراء multiphoton حيوي داخلي يستند التصوير التي كان استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من اضطراب الحيوان والجهاز. الأمثل لبقاء الحيوان على المدى الطويل من خلال رصد واسعة تليها مراقبة وثيقة من التنفس والدورة الدموية. ومرنة للغاية وسهلة تعتمد أيضا على أجهزة متني أخرى مثل الكلى أو الطحال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1184">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Anesthetics</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:263px;">Essex Pharma</td>
			<td style="width:219px;">997.00.00</td>
			<td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:263px;">Rotex Medica</td>
			<td style="width:219px;">charge: 30819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fluovac anesthesia system</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:219px;">34-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glucose 5%</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td>
			<td style="width:263px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:219px;">4802885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:263px;">Forene Abbott</td>
			<td style="width:219px;">B 506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isotonic (0.9%) NaCl solution</td>
			<td style="width:263px;">DeltaSelect GmbH</td>
			<td style="width:219px;">PZN 00765145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Ketamin 10%</td>
			<td style="width:263px;">ceva</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 36217/09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xylazin 2%</td>
			<td style="width:263px;">medistar</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 04-03-9338/23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Consumable supplies</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">20ml Syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td>21 226 36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">25mL Beaker 2x</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td style="width:219px;">50-1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">2ml syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl suture</td>
			<td style="width:263px;">Ethicon</td>
			<td style="width:219px;">V7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bepanthen Eye and Nose ointment</td>
			<td style="width:263px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:219px;">6029009.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">18010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton Gauze swabs</td>
			<td style="width:263px;">Fuhrmann GmbH</td>
			<td style="width:219px;">32014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cover Slip 24x50mm</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Durapore silk tape</td>
			<td style="width:263px;">3M</td>
			<td style="width:219px;">1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Feather disposable scalpel</td>
			<td style="width:263px;">Feather</td>
			<td style="width:219px;">02.001.30.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID</td>
			<td style="width:263px;">Smiths medical</td>
			<td style="width:219px;">800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Histoacryl</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;">1050052</td>
			<td>5x 0,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Leukoplast</td>
			<td style="width:263px;">BSN Medical Inc.</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Poly-Alcohol Haut&#8230;farblos Antisepticum</td>
			<td style="width:263px;">Antiseptica GmbH</td>
			<td style="width:219px;">72PAH200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 18 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 27 3/4 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Tissue paper</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amalgam burnisher 3PL</td>
			<td style="width:263px;">Gatz</td>
			<td style="width:219px;">0110?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2</td>
			<td style="width:263px;">Storz&#38;Klein</td>
			<td style="width:219px;">S-01134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.7 forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps curved x1</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps straight x2</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heidemann spatula HD2</td>
			<td style="width:263px;">Stoma</td>
			<td style="width:219px;">2030.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Needle holder Mathieu</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">12010-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Scissor</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14074-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Semken forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors curved</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14029-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors straight</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">ECG Trigger Unit</td>
			<td style="width:263px;">Rapid Biomedical</td>
			<td style="width:219px;">3000003686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Minivent Typ 845</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Multiphoton microscope Trimscope I</td>
			<td style="width:263px;">LaVision</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Perfusor Compact</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">PowerLab 8/30 8 channel recorder</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;">PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled heating pad</td>
			<td style="width:263px;">Sygonix</td>
			<td style="width:219px;">26857617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature sensor</td>
			<td style="width:263px;">comercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled System for Microscopes -Cube&#38;Box</td>
			<td style="width:263px;">Life Imaging Services</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using cxcr6.gfp reporter mice

<html> التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد. والأنف والحنجرة &quot;&gt; طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات. للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4). CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) - القاتلة الطبيعية (NK) - ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي 1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp + الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.

للتحقق من صحة نهج TPLSM حيوي داخلي لدينا، وتعرض CXCR6 GFP / + الفئران لتصوير TPLSM حيوي داخلي. تم الفئران يقم إما غير المعالجة والضوابط الأساسية أو تعرض لحقن داخل الصفاق واحد من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على تلف الكبد الحاد 20. <p class="jove_content" sty...

Watch this Scientific Journal Video about Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice at JoVE.com

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  RWTH University-Hospital Aachen. Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Video: Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

التفاعلات حيوي داخلي المجهري من خلايا الدم البيضاء-البطانية وصفائح الدم الكريات البيض في المساريقية الأوردة في الفئران

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

تحليل<em&gt; يرسينيا القولون</em&gt; المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

التصوير حيوي داخلي من العدلات الاشعال عن طريق IL-1β يحركها المروج عن dsRed الفئران مراسل

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...