The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility &#8221;Two-Photon Imaging&#8221;, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Rechtsvorschriften über Tierversuche nach dem &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) durchgeführt und der Richtlinie 2010/63 / EU über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Amtsblatt der Europäischen Union, 2010) verwendet. Offizielle Genehmigung wurde von der staatlichen Tierpflege und Verwendung Büro (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Deutschland) gewährt. HINWEIS: Die Schritte, die für kurzfristige Bildgebungs weggelassen werden können (zB Schnappschüsse, 3-D-Stapel oder auch kurzen Dauer Zeitraffer-Mikroskopie) sind mit einem Stern (*), um die Vorbereitungszeit zu reduzieren und vereinfachen das chirurgische Protokoll markiert. Bildgebung kann auch ohne umfangreiche Überwachung und Umlaufsteuerung ausgeführt wird, wenn jedoch notwendig, die Überlebenszeit merklich verringert werden. 1. Mikroskop-Setup und Pre-Chirurgie Vorbereitung (5-10 kmn) <ol><li> Switch-System auf (Mikroskop, Netz Lab, Laser, Heizkissen, Klimakammer, Webcam, Spritzenpumpe Gerät, Atemschutzmaske). </li><li> Schließen O 2 Versorgung Isofluran Vapor und stellen Isofluran Ebene bis 1,5 Vol% (V / V), eine Verbindung zu einem kleinen Tierbeatmungsgerät. <ol><li> Für kurzfristige Bildgebung, halten die Anästhesie mit Isofluran nur nach der ersten IP-Narkose (siehe Schritt 2.2). Dann nutzen Sie 2 Vol% (v / v) Isofluran, und halten Sie die Aufnahmezeit weniger als 2 Stunden, um eine stabile Lebermikrozirkulation zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Atmung zu 120-140 Atemzyklen / min mit einem Volumen von 150 bis 200 &amp; mgr; l. </li><li> Einrichten der Maus Agarose Bühne. Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose, Gießen in eine Schale (ca. 10 cm x 15 cm-Basis) in einem Winkel von 40 °. </li><li> Einrichten chirurgischen Arbeitsbereich sammeln die erforderliche Messtechnik. Um mikrobielle Infektion zu verhindern, Desinfektion Instrumente mit einer 1% igen Lösung von Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyd für 5 min vor dem Experiment (Figur 1A). </li><li> Erhalten übrigen Komponenten: Hautdesinfektionsmittel (zB 10% Povidon-Iod-Lösung), Leber-Stufe (Stapeln und Steg) und Agarose-Lösung (3% (w / v) in PBS), Spritzenpumpe mit 5% (w / v) Glucoselösung (G-5), Spritzenpumpe mit Anästhesielösung I (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), Wattestäbchen, n-Butyl-2-Cyanoacrylat und 1x PBS. Setzen Agarose Bühne Gericht in Inkubationskammer zur Vorwärmung. </li></ol> 2. Tracheotomie (10-15 min) <ol><li> Verwenden C57BL / 6 Mäuse von Haus in Zucht einem Gewicht von 25 bis 28 g. Haus die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien FELASA, in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit 12 Stunden Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. Lassen Tiere freien Zugang zu Standardmäusen Ernährung (Sniff Standard-Nagerfutter) und Wasser ad libitum. </li><li> Betäuben die Maus von initial intraperitoneale (ip) Injektion von 250 ul Anästhesielösung II (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 1 mg / ml, Buprenorphin 10 ug / ml). <ol><li> * Für Halt während intravitalen Bildgebung, kontinuierlich zu verabreichen Anästhesielösung I durch kontinuierliche Injektion ip (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) mit einer Spritze Pumpvorrichtung mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / h in Kombination mit inhalativen Isofluran 0,5 Vol% (v / v). </li><li> Überprüfen Reflexe nach 5 min (zB Prise Fuß-Pad mit einer Pinzette), desinfizieren die Haut für Tracheotomie Startvorbereitung, wenn die Maus in der chirurgischen Anästhesie tolerant Zustand. </li><li> Anwenden Augenschutzcreme (zB Dexpanthenol 50 mg / g) auf der Hornhaut vor dem Austrocknen (1B) zu verhindern. </li></ol></li><li> Fixieren Sie die Maus auf Vorbereitungstisch auszusetzen Bauchseite mit Klebeband für den Extremitäten; sanft dehnen Hals, in dieser Position zu fixieren, z. B., indem ein Gummiband eingehakt to der Schneidezähne. <ol><li> Desinfizieren Sie Haut und Fell mit Povidon-Iod-Lösung, durch die Anwendung Desinfektionsmittel mit einem Wattestäbchen. </li></ol></li><li> Mit den ersten Hautschnitt (0,5 bis 1 cm Länge) direkt unter das Kinn (1C) <ol><li> Sorgfältig sezieren Bindegewebe zwischen Speicheldrüsen (1D). </li><li> Vorsichtig aufreißen Muskelschlauch umgebenden Luftröhre (1E, F). </li></ol></li><li> Zeigen chirurgischen Faden unter der Luftröhre zur späteren Belüftungsschlauch Fixierung (1G). <ol><li> Offene Luftröhre mit Mikroscheren zwischen Knorpelringe Führen eines T-förmigen Einschnitt (Figur 1H) </li></ol></li><li> Zeigen Belüftungsschlauch in die Luftröhre durch den Einschnitt (~ 0,5 cm). Um das Rohr nach vorne schieben, greifen Schwanzende mit kleinen anatomischen Pinzette und vorsichtig voran den Schlauch in die Luftröhre (1I) </li><li> Fixieren Sie Rohr mit chirurgischen Faden (zB </em&gt;, 5-0) mit Gewinde in Schritt 2.5 Binden eines Knotens um das Rohr im Inneren der Luftröhre platziert; zuführen zweiten kraniale Fixierung des Rohres in der Haut, um ein versehentliches Depositioning (Figur 1J, K) zu vermeiden. </li><li> Dichtung geschnitten mit Gewebekleber (beispielsweise n-Butyl-2-Cyanoacrylat) (Abbildung 1 l). </li><li> Fixieren Sie Rohr an der Spitze mit Klebeband. </li></ol> 3. Laparatomie (15-20 min) <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Rasur Bauch, entfernen Sie vorsichtig das Haar aus der Haut. Desinfizieren Sie rasierte Haut und Fell, indem Povidoniod Lösung. </li><li> Führen Sie eine kleine Haut unterhalb des Brustbeins mittels chirurgischer Scheren (2A) geschnitten. Erweitern Sie den Schnitt seitlich unterhalb der Rippen für beide Seiten, Kauterisieren alle sichtbaren Blutgefäße, um Blutungen zu verhindern. </li><li> Einen kleinen Schnitt an der Linea alba unterhalb des Brustbeins sorgfältig durchzuführen, das Öffnen der Bauchfell (2B). Erweitere Schnitt auf beiden Seiten mit cauterization Blutungen (2C, D) zu verhindern. </li><li> Zeigen Maus in Agarose Bühne Schale (2E). Platzieren Stapel in geeigneter Höhe auf beiden Seiten der Maus (in der Regel 12-14 Deckgläschen) (2F). </li><li> Zeigen Atemtriggersensor unter Nackenbereich, damit das Mikroskop mit der Atmung zu synchronisieren. Aktivieren Auslöseeinheit (2G). </li><li> Zeigen chirurgischen Faden (5-0) durch das Brustbein zu Rippen (2I) zurückzuziehen. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig Bandanschluss Leber und Zwerchfell (Ligamentum falciforme) sowie Leber und Magen-Darmtrakt mit gebogenen chirurgische Scheren. Schneiden Sie das Ligamentum falciforme bis zur Aorta (2J). </li></ol> 4. Sample Setup (10-15 min) <ol><li> Platzieren der Maus auf der rechten Seite mit einem Winkel von 45 ° zum einfachen Zugriff auf große Leberlappen. </li><li> Fügen Inszenierung Brücke unterhalb der Rippen, für den BauchHöhle. Herstellung einer Brücke mit Hilfe eines Standard-Deckglas mit Klebeband Beschichtung auf scharfe Kanten (Abbildung 2 K) zu decken. </li><li> Legen Sie großen Leberlappen auf der Bühne. Vorsichtig rutschen Doppelkugel Stift-Sonde oder eine gepolsterte Spatel unterhalb der Leber und halten Sie die Spitze des Organs mit einem feuchten Wattestäbchen oder Feuchtgewebe. Heben Lappen auf den Objektträger und gelten sanften Widerstand. Lobe gebogen oder gefaltet werden. Geben Sie besonders darauf, nur sanfte Manipulation der Leber (Abbildung 2 l). </li><li> Platzieren seitlichen Stütz Einsätze, beispielsweise Stapel von kleinen Deckplättchen (20 mm x 20 mm), der etwa auf gleicher Höhe der Leberlappen daneben Abdecküberzug zu unterstützen. </li><li> Legen Sie großen Deckglas (24 mm x 50 mm) an der Leberlappen. Stellen Sie sicher, dass die Deckglas wird möglichst horizontal (Abbildung 2 M) ausgerichtet ist. HINWEIS: Das Deckglas sollte in Kontakt mit dem Gewebe, ohne zu quetschen. Überprüfen auf sichtbare Beeinträchtigung des Blutflusses (weiße Gewebe). Wenn MICROCIRCulation gestört ist, fügen Sie weitere Unterstützung Einsätze. </li><li> * Platz zwei unabhängige intraperitoneale Katheter (Abbildung 2 N) für langfristige Anästhesie und G-5-Anwendung. Installieren Katheter seitlich im Unterbauch neben den hinteren Gliedmaßen. HINWEIS: Die intraperitoneale Katheter können self-made durch Anschluss 27 G Nadeln mit flexiblen Silikonschlauch (Abbildung 3). </li><li> * Fixieren Nadel mit einer Schleife von 5-0 chirurgischen Faden auf der Haut, um eine versehentliche Verschiebung zu vermeiden. </li><li> * Bringen Sie Spritzenpumpe mit Anästhesie-Lösung I mit dem Katheter 1, Durchflussmenge von 0,2 ml / h; befestigen Spritzenpumpe mit G-5 zum Katheter 2, eingestellt Flussrate von 0,1 ml / h. </li></ol> 5. Maus-Überwachung <ol><li> * Ort EKG-Elektroden in einen vorderen und hinteren Extremitäten (4A). </li><li> * Bringen Sie Ablaufschlauch bis 2 Niveausensor CO. </li><li> In externen Temperatursensor, um Heizkissen verbunden (4C). </li></ol> 6. Embedding und Gewebefixierung (5-10 min) <ol><li> Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose in 1x PBS. Einbetten Leber, wenn die Temperatur auf 41 ° C unter Verwendung einer 5 ml-Spritze und einer 18 G-Nadel (5A). </li><li> Strömen restliche Agarose auf Deckglas oder in der Maus (5B, C). Warten Sie, bis Agarose vollständig verkleistert wird. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Agarose mit dem Heidemannspatel, die Vorbereitung einer View groß genug, um die vorbereitet Leberlappen (5D, E) zu scannen. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Maus in Mikroskop Klimakammer. </li><li> Fügen Sie 50-100 ml 1x PBS (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Bedecken Sie Probenschale zu verhindern Verdampfung (5F). </li><li> * Reduzieren inhalative Isofluran bis 0,5 Vol% (v / v). </li><li> * Start Monitoring-Software, Aufzeichnung EKG, Herzfrequenz und exspiratorische CO 2. </li><li> Starten Bildgebung: la öffnenser Läden, identifizieren Ansicht Interessengebiete definieren obere und untere Grenze für Z-Stapel, und starten Sie Zeitrafferaufnahmen. Nachstellen Z-Stapel, falls erforderlich, Z-Drift zu korrigieren (z. Aufgrund von Änderungen im Blutdruck oder Temperaturschwankungen, Figur (5G). HINWEIS: Nach Abschluss der Bildperiode oder wenn der Kreislauf oder Betäubung des Tiers wird instabil, opfern Mäuse durch Genickbruch (ohne Erwachen aus der Narkose). </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1++monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis.">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice.">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li><li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype,+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis.">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li><li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TLR2/S100A9/CXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse.">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li><li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+&#947;&#948;+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis.">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of &#947;&#948; T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li><li>Syn, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids.">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li><li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas.">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li><li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis:+role+of+lymphocytes.">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li><li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+in+vascular+inflammation.">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li><li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue.">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).</li></ol>

The authors disclose no con&#64258;ict of interests.

Das Ziel unserer Studie war es, eine hoch standardisierte, stabile und reproduzierbare Methode zur intravital TPLSM Bildgebung der Leber zu entwickeln. Intravital Imaging im Allgemeinen hat wertvolle Einblicke in das Zellverhalten unter realen Bedingungen folgenden Referenzfahrt und der Interaktion verschiedener Leukozyten-Populationen in der Entwicklung, Homöostase und Krankheit gegeben. Die etwas schwierig anatomischen Position der Leber, durch die Atemwege und peristaltische Darmbewegung direkt an die Leber sowie ih...

Die Visualisierung von Zellen und Zellfunktionen in ganzer Organe oder ganze Organismen von großem Interesse für mehr als 50 Jahren, darunter nahezu alle Teile des Körpers 2. Daher sind einige frühe Studien bereits intravital Bildgebung der Leber 3,4 eingesetzt. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dem neuesten Stand in Bezug auf langzeitstabil hochauflösende Bildgebung von Lebergewebe. Aufgrund der anatomischen Position der Leber in engem Kontakt mit der Membran und dem Gastrointestinaltrakt 5, das häufigste Problem für mikroskopische intravitalen Bildgebung Bewegung aufgrund der Atmung und, in geringerem Maße, Peristaltik des Verdauungstraktes 6. Im Vergleich zu anderen soliden Organen, ist die Leberchirurgie eine besondere Herausforderung. Aufgrund der dichten mikrovaskuläre Struktur kann chirurgische Manipulation zu massiven hämorrhagische Läsionen führen, Mikrozirkulationsstörungen 7 und auch die Aktivierung der ansässigen immune Zellen, wie Kupffer-Zelle 8. Daher mechanische Fixierung des Gewebes wie anderswo veröffentlicht 6,9 ist wahrscheinlich mit dem Intravitalmikroskopie Abbildungs ​​stören. In einer gesunden Leber, 10-15% des Gesamtblutvolumens befindet sich innerhalb der Leber Gefäßsystem und das Organ erhält etwa 25% des Gesamtherzleistung 10, wodurch das Organ sehr anfällig für Veränderungen in der Blutzirkulation (zB Blutdruckschwankungen ). Daher werden Störungen in der Leberdurchblutung aufgrund zB Schubspannung, Vertreibung, Verletzungen, die durch eine übermäßige Gewebebehandlung oder zentrale Zirkulation künstliche Veränderungen der Leukozyten Zugverhalten, eingeschränkter Lebersauerstoffversorgung und damit weitere Leberschäden sowie führen, beeinflussen Leber Immunreaktionen als Organkonservierung und die Gesamtlebenszeit des Tieres. Frühe mikroskopischen Untersuchungen wurden an Intravital Epifluoreszenz mi basiertMikroskopie, aber einige technische Einschränkungen wie Fotobleichung und geringe Eindringtiefe begrenzen den Einsatz dieser Technik für die langfristige Leber-Bildgebung 4,11,12. Mit der Entwicklung der Multiphotonen-Mikroskopie in den 1990er Jahren wurden die Grenzen der Fotobleichung oder Eindringtiefe im Wesentlichen gelöst, wie diese neue Methode technisch in der Lage, um bildgebende Studien in nahezu allen Organen unter realen Situationen 13-15 durchzuführen war. Jedoch sind die Haupt verbleibenden Herausforderungen bezüglich Bildgebung der Leber waren: Atembewegung, Autofluoreszenz von Lebergewebe, die Sicherung unveränderten Durchblutung der Leber-Sinusoiden und besonders stabile Bildgebung für längere Zeiträume von mehreren Stunden 16. Obwohl mehrere Studien behandelt die Funktion und die Wanderung von verschiedenen Leukozyten in der Leber 17, zB NKT-Zellen 18-20, T-Zellen 21,22, Leber Makrophagen oder Neutrophile 23,24 25, langfristige Multi microscopy Abbildungs ​​noch nicht erfolgreich hergestellt wurde, die Aufgabe noch schwieriger bei Tieren mit akuten oder chronischen Lebererkrankung aufgrund der vorhandenen Schäden und damit eine höhere Anfälligkeit für weitere Schäden 26. Allerdings, Überwachungs- Zugverhalten und zelluläre Funktion von Leukozyten in der Leber und in Echtzeit ermöglicht neue Einblicke in ihre jeweilige Rolle bei Leber Homöostase und Krankheits 27. Das Chemokinrezeptor CXCR6 an mehreren Lymphozytensubsets, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK), NKT-Zellen und einige T-Zell-Populationen 18,28 ausgedrückt. Frühere Studien an Mäusen haben gezeigt, dass CXCR6 und ihre zugehörigen Liganden CXCL16 kann die Patrouillen der NKT-Zellen auf Lebersinusoide während Homöostase steuern. Folglich ist die Verwendung von CXCR6.gfp Mäusen (Tragen einer Knock-in-der Green Fluorescent Protein [GFP] im CXCR6 Locus) ist beschrieben worden, um die Migration von Lymphozyten in verschiedenen Organen, wie Gehirn 29 zu untersuchenund auch Leber 18,20 und zeigt bei Entzündungen erhöht Infiltration CXCR6.gfp Zellen. Mit dem in dieser Studie zur Verfügung gestellten Verfahren war es möglich, diese Prozesse über einen langen Zeitraum unter stabilisierten Bedingungen zu folgen. Die Intravitalmultiphotonen-basiertes Verfahren erlaubt Bildgebung, die in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Störung des Tieres und der Orgel; optimiert für die langfristige Überleben der Tiere durch umfangreiche Überwachungs gefolgt von genaue Kontrolle der Atmung und Kreislauf; und hoch flexibel und leicht auch auf andere parenchymatösen Organen wie Niere oder Milz erlassen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1184">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Anesthetics</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:263px;">Essex Pharma</td>
			<td style="width:219px;">997.00.00</td>
			<td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fentanyl</td>
			<td style="width:263px;">Rotex Medica</td>
			<td style="width:219px;">charge: 30819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fluovac anesthesia system</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:219px;">34-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glucose 5%</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td>
			<td style="width:263px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:219px;">4802885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:263px;">Forene Abbott</td>
			<td style="width:219px;">B 506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isotonic (0.9%) NaCl solution</td>
			<td style="width:263px;">DeltaSelect GmbH</td>
			<td style="width:219px;">PZN 00765145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Ketamin 10%</td>
			<td style="width:263px;">ceva</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 36217/09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xylazin 2%</td>
			<td style="width:263px;">medistar</td>
			<td style="width:219px;">Charge: 04-03-9338/23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Consumable supplies</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">20ml Syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td>21 226 36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">25mL Beaker 2x</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td style="width:219px;">50-1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">2ml syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl suture</td>
			<td style="width:263px;">Ethicon</td>
			<td style="width:219px;">V7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bepanthen Eye and Nose ointment</td>
			<td style="width:263px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:219px;">6029009.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">18010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton Gauze swabs</td>
			<td style="width:263px;">Fuhrmann GmbH</td>
			<td style="width:219px;">32014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cover Slip 24x50mm</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Durapore silk tape</td>
			<td style="width:263px;">3M</td>
			<td style="width:219px;">1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Feather disposable scalpel</td>
			<td style="width:263px;">Feather</td>
			<td style="width:219px;">02.001.30.011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID</td>
			<td style="width:263px;">Smiths medical</td>
			<td style="width:219px;">800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Histoacryl</td>
			<td style="width:263px;">Braun</td>
			<td style="width:219px;">1050052</td>
			<td>5x 0,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Leukoplast</td>
			<td style="width:263px;">BSN Medical Inc.</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:263px;">ROTH</td>
			<td style="width:219px;">1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Poly-Alcohol Haut&#8230;farblos Antisepticum</td>
			<td style="width:263px;">Antiseptica GmbH</td>
			<td style="width:219px;">72PAH200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 18 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">304622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 27 3/4 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Tissue paper</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amalgam burnisher 3PL</td>
			<td style="width:263px;">Gatz</td>
			<td style="width:219px;">0110?</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2</td>
			<td style="width:263px;">Storz&#38;Klein</td>
			<td style="width:219px;">S-01134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont No.7 forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps curved x1</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps straight x2</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heidemann spatula HD2</td>
			<td style="width:263px;">Stoma</td>
			<td style="width:219px;">2030.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Needle holder Mathieu</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">12010-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Scissor</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14074-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Semken forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors curved</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14029-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Small surgical scissors straight</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;"></td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">ECG Trigger Unit</td>
			<td style="width:263px;">Rapid Biomedical</td>
			<td style="width:219px;">3000003686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Minivent Typ 845</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Multiphoton microscope Trimscope I</td>
			<td style="width:263px;">LaVision</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Perfusor Compact</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">PowerLab 8/30 8 channel recorder</td>
			<td style="width:263px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:219px;">PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled heating pad</td>
			<td style="width:263px;">Sygonix</td>
			<td style="width:219px;">26857617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature sensor</td>
			<td style="width:263px;">comercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Temperature controlled System for Microscopes -Cube&#38;Box</td>
			<td style="width:263px;">Life Imaging Services</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using cxcr6.gfp reporter mice

<html> Leberentzündung als Reaktion auf eine Verletzung ist ein hochdynamischer Prozess, der die Infiltration von verschiedenen Subtypen von Leukozyten einschließlich Monozyten, Neutrophile, T-Zellen-Untergruppen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und die NKT-Zellen. Intravitalmikroskopie an der Leber zur Überwachung Immunzellmigration ist besonders herausfordernd aufgrund der hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung und die Fixierung, die optische Auflösung und die langfristige Überleben des Tieres. Dennoch könnte die Dynamik von entzündlichen Prozessen sowie zellulären Interaktionsstudien kritische Informationen, um die Initiation, Progression und Regression von entzündlichen Lebererkrankungen besser zu verstehen ist. Daher wurde eine hochempfindliche und zuverlässiges Verfahren eingerichtet, um die Migration und Zell-Zell-Wechselwirkungen von verschiedenen Immunzellen in Mausleber über lange Zeiträume (ca. 6 h), die durch intravitale Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) in Kombination mit Intensiv studieren Überwachung. ent &quot;&gt; enthält die vorgesehenen Verfahren eine schonende Zubereitung und stabile Fixierung der Leber mit minimaler Störung des Organs, langfristig intravital Bildgebung mit Mehrfarben-Multiphotonen-Mikroskopie praktisch ohne Bleichen oder phototoxische Effekte über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, so dass Tracking- spezifischer Leukozytenuntergruppen und stabile Bilderzeugungsbedingungen durch umfangreiche Überwachung Maus Vitalparameter und Stabilisierung der Zirkulation, Temperatur und Gasaustausch. Lymphozytenmigration auf Leberentzündung untersuchen CXCR6.gfp Knock-in-Mäusen wurden intravitalen Bildgebung der Leber unter Ausgangsbedingungen und nach akuter und chronischer Leberschädigung durch intraperitoneale Injektion (en) von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) verursacht wird, ausgesetzt. CXCR6 ein Chemokin-Rezeptor auf Lymphozyten exprimiert, hauptsächlich auf Natural Killer T (NKT) -, natürliche Killer (NK) - und Untergruppen von T-Lymphozyten, wie CD4-T-Zellen, sondern auch Schleimhaut associATED invariant (MAIT) T-Zellen ein. Im Anschluss an die Migrationsmuster und die Positionierung der CXCR6.gfp + Immunzellen erlaubt einen detaillierten Einblick in ihr verändertes Verhalten auf Leberschäden und damit ihre mögliche Beteiligung im Fortschreiten der Krankheit.

Um unsere Intravital TPLSM Ansatz zu validieren, die wir ausgesetzt CXCR6 gfp / + Mäuse Intravital TPLSM Bildgebung. Die Mäuse wurden entweder unbehandelt als Ausgangskontrollen oder auf eine einzelne intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4) unterzogen, um akute Leberschäden 20 zu induzieren. Videosequenzen wurden über einen Zeitraum von 2-5 h auf Grund ihrer grünen Fluoreszenz aufgenommen, und die Zellen wurden über die Zeit verfolg...

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Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Aufrufe.  RWTH University-Hospital Aachen. Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.