وأيد هذا البحث من قبل INSERM، جامعة إيكس مرسيليا وجائزة التطوير المهني من HFSPO التي حصلت عليها CL فوريستير.

بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع الدراسات على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من إيكس مرسيليا جامعة، فرنسا. الإناث C57BL / 6 الفئران في 8-10 أسابيع من العمر تم الحصول عليها تجاريا والتعامل معها وفقا لقواعد Décret N ° 8 87-848، 19 أكتوبر 1987، باريس. كل التجارب باستخدام L. أجريت طفيليات اللشمانيا الحشوية LD1S وفقا للوائح السلامة الأحيائية من التشريع الفرنسي والاتحاد الأوروبي. 1. ماوس العدوى مع L. اللشمانيا الحشوية المشيقة الطفيليات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت للصيانة في المختبر من L. اللشمانيا الحشوية الطفيليات المشيقة، LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام M199 المتوسطة. تكملة M199 المتوسطة مع 10٪ مصل العجل الجنين (المعطل للحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة)، 25 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 6.9، 12 ملي NaHCO 3، 1 ملم غلوtamine، RPMI 16040 فيتامين المزيج، 10 ملم حمض الفوليك، و 100 ملي الأدينوزين، 7.6 ملي هيمن، 50 U / البنسلين مل و 50 ملغ / مل الستربتومايسين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة LD1S الطفيليات في 10 مل من المتوسط ​​M199 في 26 ° C في قارورة التهوية 25 سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المتعاقبة الخطوات الطرد المركزي التفاضلية، وإعداد السكان من الطفيليات المشيقة أن يتم إثراء بأشكال metacyclic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد ثقافة مرحلة الطفيلي سجل منتصف. الاعتماد على hemocytomer. و resuspend 5 × 10 5 الطفيليات / مل في 10 مل من المتوسط ​​M199. تنمو ثقافة الطفيلي في الظروف اللاهوائية حتى يصلوا إلى مرحلة ثابتة في وقت متأخر (في حوالي 5-6 أيام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور ثقافة LD1S في 1200 x ج لمدة 10 دقيقة في 26 ° C لتكوير الطفيليات غير metacyclic، واستعادة طاف وتدور مرة أخرى في 2500 x ج في 26 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: عالي التخصيب هذه بيليه النهائي في الطفيليات المشيقة metacyclic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إزالة قسامة صغيرة لتثبيت مع 25٪ غلوتارالدهيد 1/100 الخامس: الخامس والاعتماد الطفيليات باستخدام عدادة الكريات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليص السكان الطفيلي التخصيب metacyclic إلى 1 × 10 7/100 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني. حقن تعليق الطفيلي في الوريد ذيل الماوس تخدير (انظر أدناه) باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G. للحيوانات السيطرة، وضخ 100 ميكرولتر PBS في الوريد الذيل. </li></ol> 2. العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير مساحة العمل مع رذاذ مطهر مبيد الأحياء وجميع الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل مخدر، وفقا لوزن الحيوان، والتي تحتوي على 125 ملغم / كغم من الكيتامين و 12.5 ملغم / كغم من زيلازين مخففة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الماوس والبريتونى حقن الجرعة المناسبة من مخدر باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس دافئة وتأكد من أن الفأر هو anesthe تماماtized عن طريق معسر لوحة القدم قبل المتابعة. إعادة ضخ جرعة نصف الحل مخدر في الماوس كل 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق البطن الماوس، وتنظيفه مع Vetedine. إجراء شق صغير في الجلد والعضلات تحت القفص الصدري على الجانب الأيسر من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة من الشاش الرطب على البطن أسفل منطقة فتحها. فضح الكبد ووضعه على الشاش. وضع آخر قطعة من الشاش الرطب فوق الكبد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 24 × 60 مم 2-150 ميكرون ساترة سميكة، إلى إطار معدني، على الكبد لتصور تحت المجهر المستعبدين cyanoacrylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية العينين من الفأرة مع الشاش الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جلسة التصوير، والموت ببطء الحيوان تخدير قبل خلع عنق الرحم. </li></ol> 3. حيوي داخلي المجهري التصوير من العمارة الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ التجارب intravital المجهري على مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة فيتسيطر hermostatic غرفة، وهو 63X الهدف الجلسرين النفط الغمر لامزيغة (NA 1.4)، الأرجون (488 نانومتر) والحنة (543 نانومتر، 633 نانومتر) وأشعة الليزر والصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على مرحلة من مراحل المجهر مع ساترة تغطية الوجه الكبد أسفل على الهدف. ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 29 درجة مئوية. ضبط التركيز باستخدام تألق ذاتي الكبد للسماح التصور من الجيوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الأوعية الدموية، وإعداد محلول من 500 ميكروغرام BSA-اليكسا 647 مخففة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، لكل الماوس. حقن هذا الحل عن طريق الوريد إلى الوريد ذيل الماوس تخدير باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الخلية نواة الكبد، وإعداد محلول هويشت 33342 في برنامج تلفزيوني. حقن هذا الحل في 8 ملغ / كغ من الماوس البريتونى باستخدام حقنة 1 مل مع 30 G الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وضع متسلسل طبيعي، والهدف الغمر 63X والماسح الضوئي في 400 هرتز لصورة الكبدينوى الخلايا والأوعية الدموية في الكبد. بدوره على 405 الصمام الثنائي الأزرق نانومتر لهويشت الإثارة والليزر 633 نانومتر لBSA-اليكسا 647 الإثارة. بدوره على نانومتر ليزر الأرجون 488 وتعريف الفرقة الاستحواذ الكبيرة لتصور تألق ذاتي الكبد. </li></ol> 4. حيوي داخلي المجهري التصوير من الكبد لقياس سرعة تدفق الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج LAS المجهر (LAS-AF المشاهد النسخة 3.1.0 بناء 8587). تحديد وضع الماسح الضوئي صدى عند فتح البرنامج المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق علامة التبويب تكوين لضبط الأجهزة. انقر على الليزر وتحديد الليزر الحنة 633. انقر على الإعدادات واختيار 12 بت القرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على قائمة الاستحواذ. في إطار الإعدادات مسار شعاع، حدد 63X موضوعي وانشاء قوة 633 الليزر إلى 100٪. تفعيل كسب إشارة وخارج مجموعة المعلمات عن طريق اختيار اليكسا-633 من القائمة المنسدلة PM1-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علامة التبويب اكتساب، حدد اقتناء &quot;XYT&quot;واسطة. تعيين عرض شكل في 1024 س 1024. تحديد السرعة 8000 هرتز. حدد الثقب من 3 وحدات متجدد الهواء. تحديد عامل التكبير 3. لا تحديد وضع ثنائي الاتجاه. </li></ol> 5. التحليل الكمي من RBC السرعة باستخدام XYT صور (الطريقة 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أيقونة &quot;لايف&quot; لتصور تدفق الدم على طريقة العيش. اختيار مجال الاهتمام واختر أحد الأوعية الدموية محددة للتحليل. ضبط السفينة التي تهم وضع أفقي عن طريق ضبط &#39;X&#39;، &#39;Y&#39; ومسح دوران الحقل تنسق على لوحة التحكم USB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف الوضع &quot;لايف&quot; مرة واحدة تم تعيين السفينة من الفائدة. تغيير عرض مجموعة التنسيق إلى 1024 × 256 في وضع اكتساب وضع الإطار، خط متوسط ​​= 1، والإطار المتوسط ​​= 1، حدد &quot;المداخن&quot; 150. اضغط على &quot;ابدأ&quot; للحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحليل الكمي من RBC السرعة باستخدام صور &quot;XYT&quot; فتح البرنامج يماغيج. حدد &quot;ملف&quot;التبويب في يماغيج، انقر فوق &quot;فتح&quot; ثم اختيار الملف من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى القائمة &quot;المساعد&quot; في يماغيج، حدد LOCI وبيو تنسيقات استيراد الخيارات. في هذا الإطار، حدد كومة عرض المعلمات باسم &#39;hyperstack. في الخيار أجل المكدس، حدد الخيار: &quot;xyzct&quot;. ملاحظة: هذا يفتح نافذة مع جميع سلسلة من عمليات الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &#39;الإضافات&#39; في القائمة يماغيج واختر الخيار MTrackJ. انقر على أيقونة &quot;إضافة&quot; على نافذة صغيرة وانقر على RBC لتتبع. انقر على نفس RBC في كل إطار التالية وانقر على أيقونة &quot;قياس&quot; لقياس السرعة. ملاحظة: الملفات التي تم إنشاؤها يمكن حفظها في شكل .exl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبع ما لا يقل عن خمس كرات الدم الحمراء لكل سفينة وتحليل ما لا يقل عن ثلاث سفن الفردية من نفس الحجم. </li></ol> 6. التحليل الكمي من RBC السرعة عن طريق الخط XT صور (أسلوب 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &#39;مباشر&#39; لتصور و الدمانخفاض في طريقة العيش. حدد أحد الأوعية الدموية محددة للتحليل. ضبط السفينة التي تهم الوضع الأفقي. وقف الوضع &quot;لايف&quot; مرة واحدة تم تعيين السفينة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;XT&quot; وضع المسح وتعيين التجويف المركزي للسفينة مختارة على طول خط المسح الضوئي. مجموعة العرض شكل في 1024 X 512، السرعة = 8،000Hz، خط المتوسط ​​= 32، الوقت = 512. اضغط على &quot;ابدأ&quot; والحصول على صور خط XT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الشرائط للتحليل الكمي من RBC السرعة عن طريق فتح ملف .lif وفتح صورة خط XT من الفائدة. في مجال البرمجيات LAS-AF، حدد &quot;التجارب&quot;، افتح .lif واختيار الصورة. ملاحظة: وسوف تفتح تلقائيا مخطاط التموج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الوقت (ر، وحصل على المحور Y) المطلوبة لخط الجسيمات (يظهر انعكاس الظلام) للسفر مسافة معينة (د، وحصل على محور X) على هذا مخطاط التموج. حدد أداة &quot;لرسم خط&quot; ورسم خط أفقي على خط. لاحظ المسافة فيميكرون والوقت بالثواني ولدت في علامة التبويب نتيجة في الجزء السفلي من الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب سرعة كما V = المسافة / الزمن باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من مخطاط التموج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ما لا يقل عن خمسة جزيئات الشرائط في صورة XT وما لا يقل عن ثلاث سفن الفردية من نفس الحجم. </li></ol>

<ol>
	<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+microcirculation:+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair.">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li><li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods.">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li><li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+liver+blood+flow:+a+review.">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li><li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis.">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells.">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6++NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids.">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113 (2005).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li><li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein.">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li><li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+spleen:+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood.">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

التطورات الأخيرة في intravital المجهري للكبد الفأر تفتح آفاقا جديدة للتحقيق في الاستجابة الفسيولوجية للإصابة في الجسم الحي في الوقت الحقيقي 5،9،10. تدفق الدم الجهاز هو المعلمة الفسيولوجية الحرجة التي غالبا ما تتغير في كثير من الأمراض. ومع ذلك، فإن وضع ديناميكا ?...

ديناميكا الدم الجهاز محددة هي السمات الفسيولوجية الهامة من أي جهاز الثدييات. شذوذ في تدفق الدم قد يكون نتيجة للالتهاب، وعلامة على ضعف الجهاز 1. وهكذا، وتدفق الدم التنظيم والبنية والوظيفة تظهر المعلمات الحرجة بالنسبة للتحليل في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. التقنيات التي استخدمت عادة لتحليل تدفق الدم في جهاز معين تحتوي على العديد من القيود، بما في ذلك الحد حل هذه التقنية نفسها (مثل التصوير دوبلر من تدفق الدم)، والقدرة على قياس المطلق تدفق الدم فقط (حجم الدم في وحدة خدمة جهازا) (على سبيل المثال التماسك البصري التصوير المقطعي) وقياس متوسط ​​التغير في السرعة في عدد كبير من السكان وغير متجانسة من الأوعية الدموية 2،3. ويربط نظام الدورة الدموية والكبد فرعية سفينة المختلفة التي هي غير متجانسة في حجمها، البنية والوظيفة. فييتم تطبيق هذه الدراسة، intravital المجهري (IVM) تكنولوجيا التصوير لتقييم ديناميكا الدم الكبد في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وبدقة عالية وبالتوازي للكشف عن خصائص الأوعية الدموية الفردية التي تشكل الجهاز الكبدي. التطورات الأخيرة في هذه التقنية التصوير الضوئي قوية تسمح للباحث لجمع البيانات الديناميكية على الحيوانات التي تعيش في القرار المكانية والزمانية عالية. من خلال السماح للرؤية مباشرة ومراقبة الوقت الحقيقي من العمليات البيولوجية محددة وسريعة في الجسم الحي، ويوفر IVM فرصة فريدة للباحث للسفن صورة الدم الفردية، وقياس وتحديد سرعة خلايا الدم الحمراء واحدة (RBC) ضمن مختارة خصيصا سفينة الكبدية. في هذه الدراسة، قمنا بتنفيذ تقنية IVM في كبد الفأر لدراسة تأثير الإصابة الماوس عن طريق طفيل الليشمانيا كبدي التوجه على ديناميكا الدم في الكبد. L. اللشمانيا الحشويةهو العامل المسؤول عن داء الليشمانيات الحشوي، وهو مرض شديد يتميز الاستجابات الالتهابية الحادة على اساس المزمنة وأمراض موجودة في أجهزة متعددة، بما في ذلك الطحال والكبد. في نموذج الفأر تجريبية من داء الليشمانيات الحشوي، وإصابة الكبد في حين أن العدوى الطحال هو التدريجي 4-حل ذاتيا. هذه النتائج من العدوى الليشمانيا فيما يتعلق الأجهزة الفردية لا تزال غير مفهومة تماما. والتحقيق في الكبد والطحال ديناميكا الدم في ظل الظروف المرضية تسليط الضوء من جديد على التفاعلات المضيف الطفيلي والتسبب بالمرض. ويستند نظامنا النموذج التجريبي على كشف وتصوير الكبد من الماوس تخدير التي تلقت حقن في الوريد من الأصباغ الفلورية محددة لوضع العلامات على intravasculature الكبدي. الكبد هو عضو مواتية للفحص المجهري داخل الحيوي. بعد إجراء incisio صغيرن في البطن، وتخريجها بلطف الكبد ويوضع على شاش مبللة، ثم على ساترة بهدف الحد من أي الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. ثم يتم وضع الكبد في ضوء عدسة المجهر. بالمقارنة مع العقدة الليمفاوية والطحال والتي تتطلب استخدام اثنين من الفوتون المجهري للدراسات IVM، والاستفادة من الكبد تكمن في هندسته المعمارية 3D متجانسة / التشريح التي تسمح لاستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية، مع عمق الاختراق الحد الأقصى ل ما يقرب من 50 ميكرون، لحيوي داخلي المجهري التصوير 5-8. توضح هذه الدراسة طريقتين التصوير مستقلة لقياس كمي لRBC السرعة وسرعة تدفق الدم في الأوعية الدموية الفردية. في الطريقة الأولى، يتم الحصول على تدفق الدم في الكبد باستخدام وضع ثنائية الأبعاد س ص على مر الزمن. ويتم تحليل البيانات XYT الناتجة باستخدام البرنامج المساعد MtrackJ في برنامج يماغيج مجانا، والذي يسمح لتتبع individالسياقية كرات الدم الحمراء مع مرور الوقت. في الطريقة الثانية، يتم تحديد وعاء دموي واحدة ويتم تحليل المقابلة تدفق الدم وذلك باستخدام خط المسح وضع الاستحواذ السريع للمتحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي. يتم فحص السفينة من الاهتمام في وتيرة عالية على طول المحور المركزي من خلال خط محوري. ثم يتم كميا سرعة تدفق الدم على أساس الفرق في التباين بين كريات الدم الحمراء الداكنة غير المسماة والبلازما fluorescently المسمى. يتم رسم شدة مضان من كرات الدم الحمراء والبلازما المكتسبة على طول خط المسح الضوئي مع الزمن للحصول على الشرائط، وزوايا وهي يتناسب مع سرعات لRBC الفردية. والهدف من هذه المقالة هو توفير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار للتصوير وقياس سرعة تدفق الدم داخل الأوعية الدموية الفردية الكبد وإتاحة الأدوات الأساسية لنجاح أداء جراحة الماوس، IVM والتحليلات الكمية للسرعة كرات الدم الحمراء الفردية. تيسوف نهجه تسمح للباحثين لاكتساب رؤى جديدة في سرعة الدم في ظل ظروف مرضية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

intravital المجهري (IVM) هو تقنية التصوير البصرية القوية التي جعلت من الممكن التصور، ورصد وتقدير من الأحداث البيولوجية المختلفة في الوقت الحقيقي والحيوانات الحية. هذه التكنولوجيا قد تقدمت بشكل كبير من فهمنا للعمليات الفسيولوجية والظواهر بوساطة العوامل المسببة للأمراض في أجهزة معينة. في هذه الدراسة، يتم تطبيق IVM للكبد الفأر وصممت بروتوكولات الصورة في الجسم الحي الدورة الدموية للكبد وقياس خلايا الدم الحمراء (RBC) سرعة في الأوعية الكبدية الفردية. لتصور أنواع فرعية مختلفة السفينة التي تميز الجهاز الكبدي وإجراء قياسات سرعة تدفق الدم، ويتم حقن C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد مع كاشف البلازما الفلورسنت التي تصف الأوعية الدموية المرتبطة الكبد. IVM تمكن في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وقياس سرعة RBC في وعاء محددة من الفائدة. ووضع هذه المنهجية تجعل من الممكن لالتحقيق في ديناميكا الدم في الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. في نهاية المطاف، وهذا المنهج القائم على التصوير سيكون مهما لدراسة تأثير L. عدوى اللشمانيا الحشوية على ديناميكا الدم الكبدية. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على نماذج المعدية الأخرى وأجهزة الماوس ويمكن أن تمتد أيضا إلى ما قبل السريرية اختبار تأثير المخدرات على الالتهاب عن طريق قياس تأثيرها على تدفق الدم.

تنظيم المعمارية محددة من الجيوب في الكبد يمكن تصور يستند إلى خاصية autofluorescent هذا الجهاز (الشكل 1، لوحة B و C والأخضر)، وحقن داخل الصفاق من هويشت لوضع العلامات على الكبدية النوى (1B الشكل، اللون الأزرق) والحقن في الوريد من BSA الفلورسنت لتلطيخ الدورة الدمو...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics at JoVE.com

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

intravital-microscopy-imaging-liver-following-leishmania-infection-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

11.4K Views.  University of Aix-Marseille. This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Video: Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...