نشكر الدكتور ويليام Cashdollar، ومركز نورث وسترن المتبادلة التصوير مؤسسة في معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في الدراسات التصوير. كما نشكر الدكتور داريا Ilatovskaya لقراءة نقدية لهذه المخطوطة ومناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL108880 (لAS) وDP2-OD008396 (لAMG).

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية الطب في ويسكونسن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. عزل الجرذ الأبهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) أو IACUC آخر وافق الأسلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران في موقف ضعيف. من أجل فضح أعضاء البطن، وجعل شق خط الوسط بطني صغير من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن. باستخدام قطع من الشاش يصرف بلطف الأمعاء لفضح الشريان الأبهر والوريد الأجوف كما هو مبين في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، بلانت تشريح الشريان الأورطي من النسيج الضام ومن الوريد الأجوف. باستخدام خياطة وربطة عنق من الشريان الأورطي في أقرب وقت ممكن إلى الكلى. تشريح حوالي 1-2 سم من الشريان الأورطي ووضعه في المخروطية 15 مل توتكون تحتوي على فسيولوجية طبيعية محلول الملح (PSS، في ملي: 140 كلوريد الصوديوم، 1.2 MgCl 2، 2 CaCl 2، 4.5 بوكل، 6 الجلوكوز، 10 HEPES) على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم عزل الشريان الأورطي، الموت ببطء الحيوانية وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة. عند الانتهاء من جميع عدم بقاء الإجراءات الموت ببطء الحيوانات الخدر بعمق بضع الصدر حمل استرواح الصدر للتأكد من زوال إنسانية لهذا الحيوان. 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر التشريح، وملقط غرامة ذات الرؤوس، وmicroscissors تشريح الدهون والنسيج الضام الخروج من الشريان الأورطي. مرة واحدة في الشريان الأورطي نظيفة، وقطع الشريان الأورطي طوليا ووضعه في جهاز الأمن الوقائي على الجليد في وقت لاحق. </li></ol> 2. صبغ التحميل والحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 7 ميكرولتر من 1 ملم فلوو-04:00 صبغ، الذي تم توفيره في حل يستند إلى DMSO، إلى الفردية 500 أنابيب ميكرولتر التي تم تغطيتها بورق الألمنيوم. تخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 مئوية إلى الحفاظ على خصائص الصبغة مع مرور الوقت. ملاحظة: هذه aliquoted ذلكوينبغي أن يكون lutions مستقرة لمدة ستة أشهر على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستخدام، والسماح للحلول صبغ في عملية الاحماء لRT قبل الافتتاح. إعداد حلول العمل فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين كاشف المخفف لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 7 ميكرولتر من الجاهزة 1 ملم فلوو-04:00 الذائبة في حل DMSO إلى 450 من المجاهدين PSS لا تحتوي على الكالسيوم صبغ. إضافة 40 ميكرولتر من غير DMSO أساس 10٪ حمض Pluronic حل للكوكتيل تحميل للمساعدة في تفريق acetoxymethyl (AM) استرات وتحسين التحميل من الصبغة الكالسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع aortas تشريح في 500 ميكرولتر أنابيب تحتوي على كوكتيل تحميل (كما هو موضح في 2.3) لمدة 1 ساعة. تغطية جميع أنابيب مع احباط ومكان على شاكر الدورية في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد أي إنتاج في الأوعية الدموية، واستخدام DAF-FM ثنائي الأسيتات الصبغة. احتضان الشريان الأورطي في محلول يحتوي على 450 ميكرولتر PSS، 40 ميكرولتر حمض pluronic و 5 ميكرولتر من 10 ملي ثنائي الأسيتات DAF-FM. وعلى غرار بروتوكول حضانة الكالسيوم (موضح في 2.3)، ضع الشريان الأورطيفي أنبوب 500 ميكرولتر التي تحتوي على حل NO-صبغ المشمولة في احباط ومكان على شاكر الدورية لمدة 30 دقيقة على 4 ج تليها 30 دقيقة المقبل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم قياس NO الإنتاج، واستخدام البطانية NO سينسيز مانع، L-NAME، لمنع أي إنتاج كعنصر تحكم كما هو مبين في الشكل 4B. لهذا الإجراء، إضافة إلى كوكتيل (كما هو موضح في 2.5) 100 نانومتر L-NAME لمدة 30 دقيقة الأخيرة من الحضانة (في RT). </li></ol> 3. بروتوكول الفوتون المجهري بالليزر الضوئي الثاني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة الحضانة، وغسل الشريان الأورطي 2-3 مرات في نظيفة PSS لإزالة الصبغة خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريان الأورطي إلى طبق المغلفة السيليكون التي تحتوي إما PSS العادي أو الكالسيوم 2+ عازلة خالية (يعتمد على بروتوكول تجريبي). دبوس الشريان الأبهر أسفل على طلاء السيليكون مع البرانية في اتصال مع سيليكون (أي التجويف البطانية تتعرض لافتتاح الطبق) باستخدام دبابيس على شكل μ. بدلا من ذلك، استخدم شريحة مرساةالشبكة أو الغراء لإصلاح الأنسجة. ملاحظة: للحد من التوتر والتحف الميكانيكية المحتملة ونقل وإصلاح الشريان الأورطي في كا 2+ خالية من الحل والانتظار 5-10 دقيقة قبل بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل مضخة تحوي أو حقنة لوحة المغلفة للسيليكون التطبيق التلقائي أو اليدوي للمخدرات أو لتغيير حل خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق تحت قطعة أنف مستقيم المجهر ثنائي الفوتون، وتركيب ووضع 25 × (NA 1.05 والعمل عن بعد 2 ملم) الغمر بالمياه العدسة الشيئية فوق العينة. ملاحظة: إذا كانت هذه عدسة معينة غير متوفرة، استخدم الهدف صنعت خصيصا لمدة تصوير الفوتون، لأنه يمكن زيادة دقة إشارة بشكل كبير مقارنة مع هدف منتظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل الليزر اثنين الفوتون باستخدام برنامج (ليزر يبدأ في ضخ وتشغيل). ضبط الإثارة ليزر 820 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام epifluorescence، موقع الشريان الأورطي والتركيز على الهدفسطح البطانية باستخدام التعديل الخشنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل المجهر إلى قسمين الفوتون وضع المسح الضوئي ليزر، وضمان أن الليزر الإثارة ووضع مقفلة، وتشارك في كشف غير descanned ويتم تثبيت المرشحات الانبعاثات المناسبة لأطياف الانبعاثات المتوقعة. ملاحظة: وهنا استخدمت FV10-MRL / R (495-540 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المسح الضوئي المباشر باستخدام ما يقرب من 5٪ قوة الليزر والتركيز بدقة على الهدف من أجل رؤية الخلايا البطانية. ملاحظة: الخلايا البطانية سوف تظهر إشارة الفلورسنت قوية عندما حضنت في PSS العادي. وسيكون هذا أضعف بشكل ملحوظ عندما يتم تحضين السفن في المخزن خالية من الكالسيوم. الخلايا البطانية سوف تكون موجودة على الجزء العلوي من الشريان الأورطي فتح ويمكن رؤية خلايا العضلات الملساء فقط دون الخلايا البطانية (انظر الشكل 2). لأن الأوعية الدموية ليست سلسة ولا حتى، سيكون هناك أماكن حيث كل من خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية موجودة. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة كانت الخلايا في التركيز، برنامج البرنامج المجهر لجمع صور متسلسلة في وضع المسح الضوئي السريع (النقطية المسح، 512 X 512 بكسل نافذة مع تواتر جمع اطار 1،1 ق). بالتوازي مع فلوو-04:00 مضان، وجمع الصور المنقولة الخفيفة من أجل الكشف عن التغيرات في انكماش الأوعية وأفضل تصور الظروف التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مجموعة من الصور إشارة مرجعية، تغيير تركيز أيون الكالسيوم 2+ في حل خارجي أو ببطء تطبيق عوامل التحفيز الدوائي باستخدام مضخة تحوي بينما التصوير. نلاحظ الزيادة إشارة الفلورسنت داخل خلايا تحميل. ملاحظة: الخلايا البطانية تستجيب للتغيرات في التدفق، وبالتالي فمن المستحسن أن تستخدم تطبيقات الصفحي المنخفضة واختبار السيارة قبل تطبيق المنشطات الدوائية من الكالسيوم 2+ أو NO الإشارات. لحساب الكالسيوم داخل الخلايا لنانومتر قيم تركيز في سفن محملة فلوو-4 (ثابت التفكك لفلوو-4 طالصورة 345 نانومتر)، يمكن أن تسجل كثافة مضان في الأساس وبعد إضافة ionomycin وMnCl 2. 4 </li></ol> 4. معالجة الصور والحسابات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت حزمة فيجي معالجة الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف الصورة في فيجي. عند استيراد ملف، وتقسيم قنوات (الضوء المرسل وإشارة الفلورسنت) عند المطالبة. استخدام فقط في إشارة الفلورسنت لتحليل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن برنامج فيجي، انقر فوق علامة التبويب تحليل وانزل الى خيار الأدوات. تحت خيار الأدوات، والعثور على علامة التبويب التي يقول مدير ROI واضغط عليها. ستظهر نافذة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، انقر على القياسات مجموعة تحت علامة التبويب تحليل. حدد مقاييس محددة من الفائدة. للقياسات عابرة الكالسيوم، استخدم خيار القيمة الرمادي يعني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع أداة التتبع دائرية، والبدء في تتبع المناطق ذات الاهتمام (ROI) وانقر على زر &quot;إضافة&quot; على الشاشة مدير ROI لكل ROI. مرة واحدة وقد تم تتبع جميع الخلايا في المصالح، في إطار إدارة ROI، حدد متعددة التدبير تحت عنوان &quot;أكثر&quot; علامة التبويب. تذكر أن إما حفظ قياسات مباشرة أو نسخ ولصق كل هذه القياسات في جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * فتح ملف txt أو جداول البيانات إكسل من فيجي ونقل الأرقام إلى ورقة عمل جديدة المنشأ. ملاحظة: يمكنك أيضا استخدام أي برنامج مثل سيغما قطعة أرض أو بريزم لمزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن برنامج المنشأ، استخدم قطعة أرض → القائمة الخط + رمز لمراقبة لمحة عامة عن جميع الردود عابرة. إلغاء الخلايا لا تستجيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد تتبع لنطاق الوقت (X محور)، استخدم العمود → تعيين قيم العمود والعمود مضاعفة عدد تتبع لتواتر جمع الصور (في حالتنا 1.1s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التحليل → إحصاءات عن صفوف لجميع التسجيلات المختارة لحساب متوسط ​​(المحور Y) وأثر خطأ قياسي. رسم الرسم البياني النهائي للمجموعة الحالية من خلايا مؤامرة → الخط + رمز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرق الأوسط وأفريقيان يوصف الكالسيوم حساب عابرة على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمجموع الافراج عن الكالسيوم في إطار البرنامج المنشأ، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة تحليل → → دمج حساب التفاضل والتكامل. يبدو جزءا لا يتجزأ الكلي للمنطقة تحت منحنى في النتيجة السجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحركية عابرة، انقر على الرسم البياني، ثم استخدم القائمة: المنحنى تحليل → غير الخطية صالح → حدد مجموعة البيانات (اختر تتراوح محور X من الحد الأقصى لوضع حد للاستجابة عابرة). بدء تركيب → حدد وظيفة → الأسي تسوس 1 → القيام به. ملاحظة: يظهر المناسب الأسي في الرسم البياني النافذة والنتيجة السجل. البيانات التي تم الحصول عليها (القيم) تمثل المبلغ الإجمالي للكالسيوم المفرج عنهم، وحركية القنوات بوساطة الاستجابة العابرة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria.">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li><li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease.">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li><li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H(2)O(2)+release+in+freshly+isolated+kidneys.">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li><li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+analysis+and+calcium+imaging+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated.">Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated.</a> J Vis. Exp. In Press, (2015).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2++signaling+and+NO+production+in+rat+aorta.">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat.">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li><li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2.">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+network:+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy.">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li><li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4.">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li><li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Multiphoton+Microscopy:+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury.">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li><li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications.">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li><li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure.">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12.">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus.">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li><li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage.">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li><li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney.">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li><li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment.">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نظرة عامة التجريبية. لفهم أفضل للمساهمة الكالسيوم وNO لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية، وقد تم تطوير طريقة جديدة لقياس [كا 2+] أنا وNO داخل العضلات الملساء والخلايا البطانية من aortas سليمة معزولة. معا، ويتكون هذا البروتوكول من هذه الخطوات الحاسمة: 1) عزل...

الكالسيوم هو رسول الثاني الأساسي داخل الخلايا الوعائية مثل البطانية وخلايا العضلات الملساء. هو الحافز الأساسي لتقلص الأوعية الدموية، ويلعب دورا رئيسيا في توسع الأوعية الدموية، بما في ذلك آثاره من خلال NO جيل داخل البطانة. بسبب القيود المفروضة على تقنيات التصوير، فقد كان من المستحيل تقريبا لمراقبة التعامل مع الكالسيوم داخل السفينة سليمة. تطوير نظامين التصوير فوتون وإنشاء الكالسيوم جديد أو NO الأصباغ وضع العلامات، ويجعل من الممكن لصورة على عمق ودقة كافية للبدء في فهم ديناميات الكالسيوم وNO الإنتاج داخل الأوعية الدموية. وقد تم مؤخرا تطبيق اثنين من الفوتون المجهري في الأنسجة والأجهزة والدراسات على الحيوانات حتى بأكملها بسبب القدرة الفائقة لاختراق عميق الأنسجة مع انخفاض مضان الخلفية وحساسية إشارة عالية 1،2 الطيف ضيق اثنين من الفوتون الإثارة في illuminatأيون نقطة اتصال واستخدام أجهزة كشف غير descanned هي الأسباب التي دفعت اثنين من الفوتون المجهري متفوقة على المجهر متحد البؤر التقليدية. المجهر متحد البؤر لا يمكن أن تنتج صورا ذات جودة عالية في عمق الأنسجة ضروري نظرا لصناعة السيارات في مضان ونثر من خارج التركيز الضوء في الثقب متحد البؤر. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير طريقة استخدام المجهر اثنين الفوتون لقياس [كا 2+] ط الإشارات وNO الإنتاج في حالها، الفردية خلايا الأوعية الدموية مع ارتفاع القرار، ونسبة منخفضة إشارة إلى الضجيج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DAF-FM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-23842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4 AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F14217</td>
			<td>500&#181;l in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP DeepSee-OL&#160;</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Ti:sapphire laser 690nm &#8212; 1040nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10-MRL/R&#160;</td>
			<td>495 to 540 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25&#215; water-immersion objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPL25XWMP</td>
			<td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor grid&#160;</td>
			<td>Warner Instrument&#160;</td>
			<td>SHD-27LH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other basic reagents&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

الكالسيوم هو منظم هام جدا من العديد من العمليات الفسيولوجية في الأنسجة الوعائية. معظم البطانية والعضلات الملساء وظائف تعتمد إلى حد كبير على التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ([كا 2+] ط) وأكسيد النيتريك (NO). من أجل فهم كيف [كا 2+] ط، NO ويتم التعامل مع جزيئات المصب بواسطة أحد الأوعية الدموية في استجابة لvasoconstrictors وموسعات، قمنا بتطوير تقنية جديدة أن ينطبق الكالسيوم وضع العلامات (أو NO-التوسيم) الأصباغ مع اثنين من الفوتون المجهري لقياس التعامل مع الكالسيوم (أو أي إنتاج) في الأوعية الدموية معزولة. وصف هنا هو خطوة بخطوة الإجراء الموضح الذي يوضح كيفية عزل والشريان الأورطي من الفئران، الكالسيوم التسمية أو NO داخل الخلايا البطانية أو العضلات الملساء، وصورة العابرين الكالسيوم (أو NO الإنتاج) باستخدام مجهر اثنين من الفوتون التالية الفسيولوجية أو المنبهات الدوائية. فوائد استخدام طريقة هي متعددة جوانب: 1) أنه من الممكن في وقت واحدلاي قياس العابرين الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في استجابة للمؤثرات مختلفة؛ 2) أنه يسمح احد لخلايا صورة البطانية وخلايا العضلات الملساء في بيئتها. 3) هذه الطريقة هي حساسة جدا للكالسيوم داخل الخلايا أو NO التغييرات ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. و4) نهج صفها يمكن تطبيقها على قياس الجزيئات الأخرى، مثل أنواع الاكسجين التفاعلية. باختصار، تطبيق اثنين من الفوتون المجهري انبعاث الليزر لمراقبة العابرين الكالسيوم وNO الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأوعية الدموية ومعزولة قدمت بيانات كمية عالية الجودة والترويج فهمنا للآليات تنظيم وظيفة الأوعية الدموية.

من أجل إجراء تقييم دقيق للمساهمة الكالسيوم لعلم وظائف الأعضاء الأوعية الدموية (توسع الأوعية وتضيق الأوعية)، وقد تم تصميم بروتوكول لتحميل الأصباغ الكالسيوم في كل من الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء في الأبهر سليمة معزولة. التجريبية العامة إعداد مبين في ا...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta at JoVE.com

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K Views.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

Video: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...